Mitokondrielle proteiner avslører mekanismen som fysisk trening forbedrer hukommelse, læring og motorisk aktivitet ved hypoksisk iskemisk encefalopati Rottemodell del 3

4. Materialer og metoder

4.1. Dyr og eksperimentelle grupper

Trettiseks Sprague-Dawley-rotter ble brukt til denne studien. Dyrene ble holdt ved 22 ± 1◦C med lys/mørke-sykluser på 12 timer og hadde fri tilgang til mat og vann. Eksperimentelle prosedyrer ble utført med godkjenning fra den etiske institusjonelle komiteen for dyrepleie og forskning ved Zhengzhou University.

Den mørke syklusen refererer til perioden når folk sover om natten, og det er nært knyttet til hukommelsen. For de fleste forbedrer en god natts søvn fysisk helse og hjernefunksjon. Samtidig er søvn også relatert til hjernens minneprosess.

Når vi sover, går kroppen inn i forskjellige søvnstadier, inkludert rask øyebevegelse (REM) søvn og ikke-rask øyebevegelse (NREM) søvn. Disse stadiene spiller en viktig rolle i å regulere hjernens informasjonsintegrasjon og minnekonsolidering.

De fleste opplever de positive effektene av søvn på konsentrasjon og hukommelse. Forskning viser at søvn kan hjelpe oss å konsolidere og styrke minnene våre og til og med forbedre vår evne til å lære. Under søvn integrerer hjernen ny informasjon med eksisterende kunnskap, og forbedrer dermed evnen til å lagre og bruke minne.

Omvendt kan mangel på tilstrekkelig søvn føre til hukommelsestap og lærevansker. Langvarig søvnløshet kan forårsake en rekke problemer i kroppen og hjernen, som påvirker dagliglivet og arbeidsevnen. Derfor er en riktig søvnstrategi og en fornuftig livsstil avgjørende for å opprettholde god hukommelse.

Totalt sett er det en sammenheng mellom mørke sykluser og minne. Tilstrekkelig søvn kan fremme integrering av hjerneinformasjon og hukommelseskonsolidering, mens langsiktige søvnforstyrrelser kan påvirke hjernens funksjon og hukommelse. Derfor bør vi være oppmerksomme på søvnkvaliteten i hverdagen og opprettholde en sunn livsstil, for å effektivt støtte og forbedre hukommelsen og læringsevnene våre. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen betydelig, fordi Cistanche deserticola også kan regulere balansen av nevrotransmittere, som å øke nivåene av acetylkolin og vekstfaktorer. Disse stoffene er svært viktige for hukommelse og læring. I tillegg kan Cistanche deserticola også forbedre blodstrømmen og fremme oksygentilførsel, noe som kan sikre at hjernen får tilstrekkelig med næringsstoffer og energi, og dermed forbedre hjernens vitalitet og utholdenhet.

Klikk vet 10 måter å forbedre hukommelsen

Alt ble gjort for å redusere antall dyr og minimere lidelser hos dyr under forsøkene. Dyrene ble tilfeldig delt inn i fire grupper (Figur 8). (1) HIE, NT (hypoxia-ischemiencephalopathy group without exercise training) besto av dyr som ble modellert for hypoksisk-iskemisk encefalopati på postnatal dag 7 ved å bedøve ungene med isofluran (5 % induksjon, 1,5 % vedlikehold).

Den venstre vanlige halspulsåren ble deretter permanent ligeret, og ungene ble lagt på en varm hvilesofa i 30 minutter før de ble overført til et hypoksisk kammer med en kontinuerlig strøm av den hypoksiske gassblandingen av 92 % N2 og 8 % O2 i 90 minutter og deretter returnerte til burene frem til 10. uke uten å utsette dem for svømmetrening. (2) HIE, T (hypoksi-iskemi-encefalopati-gruppe med trening) besto av dyr som ble modellert for hypoksisk-iskemisk encefalopati som i (1) og returnert til burene frem til 6. leveuke og deretter utsatt for 90 min. svømmetrening daglig i fem dager med 2 dager hvile per uke i 4 uker, (3) SHAM, NT (kontrollgruppe) inkluderte dyr som ikke ble utsatt for noen behandling, men som levde et normalt liv i burene fra postnatal dag 1 til 10. uke uten treningstrening, og (4) SHAM, T besto av dyr som ikke ble utsatt for noen behandling, men levde et normalt liv i burene fra postnatal dag1 opp til 6 uker, hvoretter de ble utsatt for svømmetrening i 4 uker.

Dyrehjernene fra de forskjellige gruppene ble deretter høstet og forberedt for western blotting (hippocampus og hjernebark) og immunfluorescens (motorisk cortex).

4.2. Øvelsesparadigme

Dyrene ble holdt med mat og vann ad libitum og holdt på en 12-lys/mørke-syklus. De ble delt inn i to grupper: stillesittende dyr (HIE, NT og SHAM, NT) og treningsdyr (HIE, T og SHAM, T). De trenende dyrene ble utsatt for svømmetrening etter postnatal uke 6 i 4 uker; de ble utsatt for svømmetrening 5 dager i uken med 2 dagers hvile. Hver svømmeøkt varte i 90 min. Bassenget ble fylt til en dybde på 50 cm for å forhindre at dyrene berører bunnen av tanken.

Dyrene fikk svømme fritt, uten ekstra belastning, og ble forsiktig stimulert under svømming. Rottene ble forsiktig tørket etter øvelsen og returnert til burene.

4.3. Vertica! Polmotortest

Dyrene i hver gruppe ble en etter en plassert med forsiden opp på en stofftapebelagt stang (3,0 cm diameter og 150 cm lengde), som ble holdt i horisontal stilling, og deretter gradvis løftet til en vertikal posisjon, og tiden rotten oppholdt seg på stangen ble registrert i maksimalt 2 min (120 s). I denne testen faller dyret med underskudd i motorisk koordinasjon og balanse av stangen.

4.4. Morris Water Maze Test (MWM)

Rotter (10 uker gamle) ble utsatt for MWM etter å ha gjennomgått 4 ukers treningsprotokoll (SHAM, 'T og HlE, T). Alle vannlabyrintdata ble registrert ved hjelp av Panjab SMART videosporingssystem (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Shanghai, Kina). MWM ble brukt som beskrevet av l32]. Kort fortalt brukte rotter visuelle signaler plassert på kanten av et svømmebasseng for å nå en skjult plattform og rømme fra vannet. Læring ble vurdert over 7 dager. Før læringsvurderingen ble rotter introdusert i bassenget som inneholdt klart vann og en synlig plattform. Under treningen fikk rottene prøvesvømmeøvelser for å bli kjent med oppgaven.

Under læringsfasen ble rotter smurt med svart fargestoff for enkel videosporing og plattformen ble nedsenket. Hver rotte ble utsatt for fire forsøk fra forskjellige utgangspunkt (kvadranter). Latens eller tiden som kreves for å nå plattformen ble registrert hver dag av Panlab SMART Video Tracking System. På den siste dagen av eksperimentet ble plattformen fjernet, og hver rotte ble gjeninnført i vannet antall ganger dyrene krysset stedet for den skjulte plattformen i kvadranten som tidligere inneholdt plattformen (målkvadranten) ble registrert.

4.5. Western Blotting

Seks rotter ble tilfeldig valgt fra hver gruppe for eksperimentet på proteinnivå. Proteiner ble ekstrahert fra hippocampus og cortex og homogenisert i RIPAs reagens (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA) og separert i cytoplasmiske og nukleære proteiner. Proteinkonsentrasjonene ble bestemt ved å bruke bicinchoninicacid-analysen (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA), og totalt 20 g protein ble separert ved elektroforese på universelle SDS-PAGE-geler (CFAS AnyKD PAGE) # PE008, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, Kina.

Proteiner ble deretter overført til polyvinylidenfluoridmembraner, (PVDF)(R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, USA). Membranene ble blokkert i 2 timer med 5 % bovint serumalbumin (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences , Beijing, Kina) ved romtemperatur og inkubert med følgende primære antistoffer fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA): AIF (D39D2, 1:1000), Cytokrom C (136F3, 1:1000), spaltet kaspase{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) og OPA1 (D7C1A,1:1000).

GAPDH fra Servicebio, Wuhan, Kina (GB11002, 1:2000), og H3 fra Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) ved 4 ◦C over natten etterfulgt av HRP-konjugert sekundærantistoff SA00001-2 fra Proteintect (1:5000) inkubering i 2 timer ved romtemperatur. Proteinbåndene ble visualisert med et forbedret kjemiluminescenssett #KF005 fra Affinity Biosciences og avbildet med Bio-Image Analysis-systemet (Zhengzhou University, Zhengzhou, Kina). Forholdet mellom proteinbåndintensiteter og GAPDH (cytoplasmatiske proteiner) og H3 (kjerneproteiner) som interne referanser ble bestemt ved bruk av ImageJ.

4.6. Immunfluorescens

De {{0}}µm koronale skivene av hjernevev ble oppnådd ved bruk av en frysemikrotom (Leica, Tyskland) for immunfluorescens. Objektglassene ble blokkert i 2 timer med PBS med 10 % føtalt bovint serum, (#A8020, Solarbio Life Sciences, Beijing, Kina) og 0,3 % Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Estland ved romtemperatur og deretter inkubert med primære antistoffer fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA): anti-AIF, D39D2 (fortynning på 1:400), anti-Cytokrom C, 136F3 (fortynning på 1:200), anti-spaltet caspase-3 , Asp175 (fortynning på 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (fortynning på 1:200) og anti-OPA1, D7C1A (fortynning på 1:400) over natten ved 4 ◦C.

Deretter ble objektglassene vasket 3 ganger hver på 10 minutter i PBS, og deretter inkubert med sekundære antistoffer (ab150077 fra Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, Storbritannia) i 2 timer ved romtemperatur i mørket.DAPI,#C0065 fra Solarbio Life Sciences, Beijing, Kina (1:100PBS) ble tilsatt i 5 minutter og helt av, vasket i PBS i 3 ganger hver i 5 minutter, tørket, antiquenchingmiddelet ble tilsatt (#P0126, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina), glass slips ble festet på objektglassene, og prøvene ble lagret ved -20 ◦C i 2 timer og tatt for mikroskopisk avbildning. Vevsbildene ble tatt med et konfokalt fluorescensmikroskop (Ni-U942877, Nikon, Tokyo, Japan), og bildene representerte proteinene i den motoriske cortex ble deretter kvantifisert ved å bruke FIJI-ImageJ som beskrevet i [33].

4.7. Statistisk analyse

GraphPad Prism versjon 8.0.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) ble brukt for alle analyser. Enveis ANOVA etterfulgt av henholdsvis Dunnetts post hoc-tester ble brukt for å måle statistisk signifikans. Resultatene presenteres som gjennomsnitt ± SEM, og p < 0.05 ble ansett som statistisk signifikant.

5. Konklusjoner

Denne studien viser at svømmetrening forbedret motorisk aktivitet, hukommelse og læring assosiert med HIE ved å undertrykke mitokondriell apoptose via signalveiene Cyto.C/cleaved caspase-3 og AIF. I tillegg har svømmetreningsintervensjon vist seg å stabilisere mitokondrielle cristae og membranpotensiale som vist ved reversering av Smac/Diablo og OPA1 hos rotter med HIE. Som et resultat er dette et attraktivt og levedyktig grunnlag for ytterligere forskning for å dechiffrere flere molekylære veier som kan manipuleres for å effektivt håndtere HIE og de resulterende underskuddene. Mens denne studien vellykket demonstrerte rollen til trening i å reversere de strukturelle og funksjonelle underskuddene i mitokondriene forårsaket av HIE, uttømte den ikke alle mulige metoder for å etablere hvordan mitokondrielle cristae stabiliseres; Dette er kritisk for fremtidig forskning på dette emnet.

Forfatterbidrag: Konseptualisering, FG, FP, YW og CC; datakurering, FG, FP, YW,HL og JF; formell analyse, FG, HL og CC; finansiering anskaffelse, CC; etterforskning, FG,FP, YW, HL og JF; metodikk, FG, FP, YW og CC; prosjektadministrasjon, FG, YW og CC; ressurser, CC; programvare, FG, FP, JF og CC; tilsyn, CC; validering, FG, FP, YW, HL og CC; visualisering, FG, FP, YW, HL og JF; skriving – originalutkast, FG og YW;skriving – gjennomgang og redigering FG og HL Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering: Denne studien er støttet av det vitenskapelige og teknologiske forskningsprosjektet til Henan-provinsens avdeling for vitenskap og teknologi (tilskudd nr. 212102310217) og et tilskudd fra fondene til Kinas nasjonale naturvitenskapelige stiftelse (tilskudd nr. 81401015).

Uttalelse fra institusjonell vurderingsstyre: Studien ble utført i henhold til retningslinjene til komiteen for omsorg for forskningsdyr ved Zhengzhou University; ZZUIRB2022-32.

Informert samtykkeerklæring: Ikke relevant.

Datatilgjengelighetserklæring: Ikke relevant.

Interessekonflikter: Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Referanser

1. Li, B.; Concepcion, K.; Meng, X.; Zhang, L. Hjerne-immune interaksjoner ved perinatal hypoksisk-iskemisk hjerneskade. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [CrossRef]

2. Douglas-Escobar, M.; Weiss, MD Hypoksisk-iskemisk encefalopati: En gjennomgang for klinikeren. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]

3. Svart, RE; Cousens, S.; Johnson, HL; Lawn, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Campbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; et al.Globale, regionale og nasjonale årsaker til barnedødelighet i 2008: En systematisk analyse. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [CrossRef]

4. Juul, SE; Ferriero, DM Farmakologiske nevroprotektive strategier ved neonatal hjerneskade. Clin. Perinatol. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]

5. Zhu, C.; Rodriguez, JI; Li, T.; Xu, Y.; Sun, Y. Rollen til apoptose-induserende faktor i perinatal hypoksisk-iskemisk hjerneskade. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]

6. Song, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, I.-G.; Lee, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Lee, S.-J.; Cho, YS Tredemølletrening og hjultrening forbedrer motorfunksjonen ved å undertrykke apoptotisk nevroncelledød hos hjernebetennelsesrotter. J. Exerc. Rehabil. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]

7. Kelly, M.; Darrah, J. Akvatisk trening for barn med cerebral parese. Dev. Med. Barn. Neurol. 2005, 47, 838–842. [CrossRef]

8. Müller, P.; Duderstadt, Y.; Lessmann, V.; Müller, NG Lactate and BDNF: Key Mediators of Exercise Induced Neuroplasticity? J. Clin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]

9. Intlekofer, KA; Cotman, CW Trening motvirker synkende hippocampusfunksjon ved aldring og Alzheimers sykdom. Neurobiol.Dis. 2013; i trykk. [CrossRef]

10. Real, C.; Ferreira, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrão, A.; Pires, R.; Britto, L. BDNF-reseptorblokkering hindrer de gunstige effektene av trening i en rottemodell av Parkinsons sykdom. Nevrovitenskap 2013, 237, 118–129. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com