NGF modulerer kolesterolmetabolisme og stimulerer ApoE-sekresjon i gliaceller som gir nevrobeskyttelse mot oksidativt stress Del 1

Abstrakt:

Kolesterol spiller en avgjørende rolle i hjernen, hvor astrocytisk aktivitet spesielt regulerer stoffskiftet. Faktisk undertrykker voksne nevroner deres kolesterolbiosyntese og importerer denne sterolen gjennom ApoE-rike partikler utskilt fra astrocytter. Nyere bevis tyder på at nervevekstfaktor (NGF) kan utøve nevrotrofisk aktivitet ved å påvirke cellemetabolismen.

Nevroner er de grunnleggende enhetene som utgjør den menneskelige hjernen. Gjennom forbindelsene mellom nevroner danner de vår hjernebark, som bærer all vår kunnskap og minner. Derfor er nevroner nært knyttet til hukommelsesevne.

Hovedfunksjonen til nevroner er å overføre informasjon. Hvert nevron har en synapse, som forbinder dendrittene og aksonene til andre nevroner. Når et nevron mottar et signal, sender det signalet til nevronene som det er koblet til. Denne signaleringen, kalt nevronal overføring, er en av nøkkelprosessene i minnedannelse, lagring og gjenfinning.

Ved å holde hjernen vår sunn, kan vi fremme riktig funksjon av nevronene våre gjennom trening. Fysisk trening forbedrer blodsirkulasjonen og oksygentilførselen til hjernen, og øker dermed antall og forbindelser av nevroner. Samtidig kan mangfoldige sosiale og læringsaktiviteter danne nye nevroner i nye hjerneområder og øke hjernens plastisitet.

Når vi har flere, mer aktive nevroner, blir hukommelsen sterkere. Synkronien mellom nevroner i hjernebarken blir jevnere, noe som gjør det lettere for oss å lagre og hente informasjon, noe som forbedrer våre kognitive evner. I tillegg vil et stort antall nevroner og forbindelser mellom nevroner også forbedre vår reaksjonshastighet og beslutningsevne.

Derfor går det å opprettholde sunne nevroner og forbedre hukommelsen hånd i hånd. Vi kan forbedre hukommelsen vår ved å fremme sunne nevroner ved å fokusere på fysisk trening, en rekke sosiale aktiviteter og læringsaktiviteter og kostholdsvaner. La oss jobbe sammen for å støtte hjernens helse! Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen vår. Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen betydelig fordi Cistanche deserticola er et tradisjonelt kinesisk medisinsk materiale med mange unike effekter, en av dem er å forbedre hukommelsen. Effekten av kjøttdeig kommer fra en rekke aktive ingredienser den inneholder, inkludert karboksylsyre, polysakkarider, flavonoider, etc. Disse ingrediensene kan fremme helsen til hjernen gjennom ulike kanaler.

Klikk vet måter å forbedre hjernefunksjonen på

Likevel er effekten av NGF på glial kolesterolhomeostase fortsatt ikke belyst. Dette prosjektet tar sikte på å vurdere om NGF kan påvirke kolesterolmetabolismen i gliaceller. U373 astrocytt-avledet cellelinje ble brukt som en eksperimentell modell for å nå dette målet. Immunoblot og ELISA-analyse viste at proteiner og enzymer som tilhører kolesterolmetabolismenettverket ble økt ved NGF-behandling i gliaceller. Videre økte NGF signifikant ApoE-sekresjonen og mengden ekstracellulært kolesterol i kulturmediet.

Eksperimenter med samkultur og U373-kondisjonert medium viste at NGF-behandling effektivt motvirket rotenonmediert cytotoksisitet i N1E-115-nevronceller. Motsatt ble nevrobeskyttelse mediert av NGF-behandling undertrykt når N1E-115 ble dyrket sammen med ApoE-dempede U373-celler. Disse dataene tyder på at NGF kontrollerer kolesterolhomeostase i gliaceller. Enda viktigere, NGF utøver nevrobeskyttelse mot oksidativt stress, sannsynligvis assosiert med induksjon av glial ApoE-sekresjon.

Nøkkelord:

ApoE; astrocytt; kolesterol; differensiering; nervevekstfaktor; metabolisme; nevron; reaktive oksygenarter; rotenon.

1. Introduksjon

Hjernen er preget av den høyeste mengden kolesterol i hele kroppen [1]. Den eksepsjonelle konsentrasjonen av denne sterolen i sentralnervesystemet (CNS) er begrunnet med det faktum at kolesterol er involvert i flere grunnleggende biologiske prosesser. Merk at en betydelig mengde kolesterol er integrert i plasmamembranene til astrocytter og nevroner, der det definerer en riktig cellulær morfologi og korrekt funksjon av membranreseptorer og synaptisk nevrotransmisjon [2].
Kolesterol er også avgjørende for å danne nye membraner som kreves for nevrittutvekst, synaptogenese og frigjøring av nevrotransmitter, og er derfor avgjørende for nevronal differensiering og modning [3–7].

I hovedsak kommer alt kolesterol i hjernen fra de novo biosyntese in situ. Spesifikt forhindrer blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​kolesterolopptak som stammer fra lipoproteiner som transporteres gjennom den systemiske sirkulasjonen [8]. Av denne grunn utvikler nerveceller et eksemplarisk regulatorisk nettverk for uavhengig å styre sin egen etterspørsel etter dette lipidet. En godt akseptert modell fastslår at etter embryogenese, i løpet av den postnatale perioden, synker kolesterolbiosyntesen dramatisk i nevroner, med forsøk på å spare energien som brukes til generering av handlingspotensialene.

Følgelig dekket astrocytter de usikre nevronale kravene til kolesterol, hvis syntese blir spesielt uttalt [1,9,10]. Levering av kolesterol produsert av astrocytter til nevroner innebærer en elegant mekanisme for horisontal transport, som involverer kritiske proteiner og partikler. Spesielt starter kolesteroleksport i astrocytter, der nysyntetisert kolesterol lastes inn i begynnende lipoproteinpartikler som inneholder apolipoprotein E (ApoE). Akkumulerende bevis indikerer at lipideringen av ApoE-rike partikler medieres av transportørens ATP-bindende kassett A1 (ABCA1) [11]. Deretter, når de ble sluppet ut i det ekstracellulære rommet, ble ApoE-holdig lipoprotein tatt opp av nevroner gjennom reseptormediert endocytose med lav tetthet lipoproteinreseptor (LDLr) og LDLr-relatert protein 1 (LRP1) [12].

I henhold til den sentrale rollen til astrocyttavledet kolesterol i nevronal homeostase, indikerte eksperimentelle funn at kolesterol inneholdt i ApoE-rike lipoproteiner forbedrer dendrittdifferensiering og synaptisk funksjon betydelig [13,14]. Accordinastrocyttkondisjonert medium fra astrocytter fra Huntingtons sykdom (HD), som bare utskiller en beskjeden mengde ApoE-lipoproteinbundet kolesterol, påvirker alvorlig nevrittutvekst og synaptisk aktivitet i HD-neuroner [15].

Den nevrotrofiske virkningen av astrocyttavledede ApoE-holdige partikler opprettholdes videre av virkningen av ApoE-mangel, som markant hemmer nevrogenese hos voksne i hippocampus [16]. Krysstale mellom astrocytter og nevronkolesterol er også avgjørende for nevrobeskyttelse mot oksidativt stress. For eksempel viser noen rapporter at ApoE hindrer oksidativ skade og apoptose indusert av eksponering for hydrogenperoksid [17,18].

Fra disse observasjonene er vedlikehold av kolesterolhomeostase i hjernen nødvendig for å garantere nervecellenes funksjon, og de metabolske veiene som ligger til grunn for reguleringen av dette lipidet bør kontrolleres fint for å bevare forekomsten av flere nevrofysiologiske prosesser.

De siste årene har nevrotrofiner dukket opp som viktige aktører i cellemetabolismen [2,19–22]. Nevrotrofiner tilhører en liten familie av vekstfaktorer som har en uomtvistelig rolle i nevronal utvikling, overlevelse og plastisitet [23]. Mer nylig har disse signalmolekylene også blitt anerkjent som avgjørende modulatorer av cellemetabolisme, inkludert kolesterolmetabolisme [2,22].

Eksperimentelle bevis fremhever at nervevekstfaktor (NGF), prototypemedlemmet i nevrotrofinfamilien, stimulerer kolesterolbiosyntese i nevronceller og hepatocytter [24,25]. Interessant nok involverer disse hendelsene, i det minste delvis, lavaffinitetsnevrotrofinreseptoren p75NTR, som fremkaller aktivering av det sterolregulerende elementet bindende protein 2 (SREBP-2) og i sin tur induserer transkripsjon av kolesterolrelatert gener [25]. Aktiviteten til NGF på kolesterolmetabolisme er ikke begrenset til biosyntese, da den også fremmer kolesterolopptak ved å øke LDLr-ekspresjon i nevroner [26].

Til tross for denne informasjonen virker kunnskapen om mulig bidrag fra NGF i reguleringen av kolesterolhomeostase fortsatt spesielt begrenset. Spesielt er det mangel på systematiske studier som vurderer rollen som NGF spiller i reguleringen av kolesterolmetabolismen i astrocytiske celler. Tatt i betraktning at kolesterol produsert av astrocytter er avgjørende for å garantere nevronal fysiologi, er det viktig å forstå om det kan påvirke kolesterolmetabolismen i gliaceller så vel som intercellulær kolesteroltransport, hvis særegne regulering er avgjørende for å sikre hjernens helse.

På dette grunnlagsarbeidet er målet å utforske den potensielle involveringen av NGF i moduleringen av kolesterolmetabolismen i gliaceller, så vel som dens innvirkning på nevronal differensiering og nevronal overlevelse under oksidativt stressforhold.

2. Resultater

2.1. U373 Express Både NGF-reseptorene TrkA og p75NTR

NGF ble opprinnelig identifisert som en vekstfaktor med en spesifikk tropisme for nevronceller. Akkumulering av bevis viser imidlertid at dette nevrotrofinet også induserer biologiske effekter i flere ikke-nevronale celler og vev [22]. Aktiviteten til NGF er sikret ved at den binder seg til høyaffinitetsreseptoren TrkAd til lavaffinitetsreseptoren p75NTR [2].

Dermed konstaterte vi først om U373-celler uttrykker NGF-reseptorer. Spesielt er U373 en astrocytomcellelinje som er mye brukt som en astrocytcellekulturmodell, ettersom flere rapporter indikerte at de reproduserer morfologiske, metabolske og funksjonelle egenskaper til astrocytter [27–29]. I følge publiserte data [30] viste immunfluorescensanalyse at U373-celler uttrykker både TrkA og p75NTR på betydelige nivåer (figur S1A). Disse resultatene ble også bekreftet av Western blot-analyse, noe som tyder på at U373-celler har potensial til å være fullstendig responsive på NGF.

Siden administrering av NGF kan påvirke ekspresjonsnivåene til reseptorene, potensielt endre balansen mellom signalveier fremkalt av TrkA og/eller p75NTR [31–33], ble uttrykket av begge reseptorene også sjekket etter 48 timers NGF-behandling. Imidlertid ble ingen endringer observert i proteinmengden til både TrkA og p75NTR etter stimuleringen med neurotrofin (figur S1B).

2.3. NGF øker kolesterolsekresjonen med U373 til kulturmediet

De oppnådde resultatene fikk oss til å studere om effektene mediert av NGF kunne reflektere moduleringen av kolesterolinnholdet. Oljerød O-farging ble utført for å visualisere nøytrale lipider, inkludert kolesterylestere. Størrelsen og antallet lipiddråper funnet i U373-celler var lik de som ble rapportert for primære astrocytter [34,35].

Imidlertid ble ingen endringer observert ved NGF-behandling (figur 2A og S2A, B). Tilsvarende ble ingen endringer påvist i mengden fritt kolesterol, evaluert ved filipinfarging (figur 2B og S2C). Mangelen på signifikante effekter på intracellulære kolesterolnivåer ble videre opprettholdt av kolesterolenzymatisk analyse, som fremhevet at NGF ikke endret innholdet av totalt kolesterol, fritt kolesterol og kolesterylestere (Figur 2C).

Omvendt ble mengden kolesterol (fritt, estere og totalt) markant økt i kulturmediet til U373-behandlet NGF (Figur 2D). Når de evalueres som en helhet, indikerer disse dataene at NGF fremmer kolesterolekstrudering ved å øke ABCA1-mediert utstrømning av ApoE-holdige partikler.

Figur 1. NGF modulerer ekspresjonen av hovedproteinene involvert i kolesterolhomeostase i U373-celler og øker ApoE-sekresjonen n i U373-kulturmediet. (A–G) Representativ Western blot og densitometrisk analyse av SREBP-1, SREBP-2, HMGCR, LDLr, NPC1, ABCA1 og ApoE i U373-celler behandlet med vehikel (Ctrl) og NGF (100 ng) /ml) i 48 timer. n=6 forskjellige eksperimenter.

Aktin og vinkulin ble brukt som belastningskontroller. (H) Kvantifisering av ApoE-nivåer (µg/ml) ved ELISA-analyse i bærer- og NGF-behandlet U373-kulturmedium. n=3 forskjellige eksperimenter. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble vurdert ved en enkelt uparet Studet-test-test. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

2.4. p75NTR er delvis involvert i de NGF-medierte effektene på kolesterolproteinnettverket

Eksperimentelle funn viser at NGF påvirker kolesterolmetabolismen i leverceller gjennom aktivering av dens lavaffinitetsreseptor p75NTR [25]. For å teste om denne signalveien også kan bli bevart i astrocytiske celler, behandlet vi U373 med LM11A -31, en liten ligand som fungerer som en spesifikk p75NTR-modulator. Denne forbindelsen aktiverer ikke TrkA, men, på samme måte som NGF, fremkaller induksjon av p75NTR nedstrøms signalveier [36]. LM11A-31 etterlignet den NGF-medierte økningen av HMGCR (figur 3A).

Det ble imidlertid ikke observert endringer i de andre proteinene involvert i kolesterolmetabolismen (figur 3B–D), og heller ikke i mengden ekstracellulær ApoE (figur 3E) og kolesterol (totalt, fritt og estere) frigitt i kulturmediet (figur 3F) ). Samlet indikerer disse resultatene at NGF-indusert ekspresjon av HMGCR er mediert av p75NTR-aktivitet, mens effektene på NPC1, ABCA1, ApoE-sekresjon og kolesterolekstrudering sannsynligvis er avhengig av andre transduksjonsveier, muligens involverer TrkA.

Figur 2. NGF-effekter på nøytrale lipider og kolesterolinnhold. (A) U373-celler ble behandlet med bærer (Ctrl) eller NGF (100 ng/ml) i 48 timer og deretter farget med Oil Red O for å visualisere det intracellulære innholdet av nøytrale lipider. n=3 forskjellige eksperimenter. (B) Representativt bilde av filipinfarging utført på U373-celler behandlet med bærer (Ctrl) og NGF (100 ng/ml) i 48 timer. n=3 forskjellige eksperimenter. (C) Kvantifisering av intracellulære kolesterolnivåer (totalkolesterol, fritt kolesterol og kolesterylestere) i bærer- og NGF-behandlede U373-celler. n=3 forskjellige eksperimenter. (D) Kolesterolkvantifisering (totalkolesterol, fritt kolesterol og kolesterylestere) i kulturmediet til U373-celler behandlet med bærer (Ctrl) og NGF (100 ng/ml) i 48 timer. n=3 forskjellige eksperimenter. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført ved å synge en uparret Students t-test. ** s<0.01.

Figur 3. Effekter av p75NTR-modulering av LM11A-31 på kolesterolmetabolisme og sekresjon. (A–D) Representativ Western blot og densitometrisk analyse av HMGCR, ABCA1, NPC1 og ApoE i U373-celler behandlet med vehikel (Ctrl) og LM11A-31 (0.1 µM) i 48 timer. n=4 forskjellige eksperimenter.

Vinculin fungerte som et husholdningsprotein for å normalisere proteinbelastningen. (E) Kvantifisering av ApoE-mengde (µg/mL) ved ELISA-analyse i kulturmedium fra bærer- og LM11A-31-behandlede U373-celler. n=3 forskjellige eksperimenter. (F) Kolesterolkvantifisering (totalkolesterol, fritt kolesterol og kolesterylestere) i kulturmediet til U373-celler behandlet med bærer (Ctrl) og LM11A-31 (0.1 µM) i 48 timer. n=3 forskjellige eksperimenter. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført ved å bruke en enkelt uparet Studet-test-test. *** p < 0.001.

For more information:1950477648nn@gmail.com