NMR-basert metabolomisk analyse for effektene av -ketoglutarattilskudd på C2C12 myoblaster i forskjellige energitilstander

Klikk her for å få Cistanche Anti-aldrings- og tretthetstilskudd

1. Introduksjon

Skjelettmuskelen er det største organet i menneskekroppen og opprettholder normale livsaktiviteter.Langvarig treningstreningeller patologiskl prosesser av sykdommer induserer muskelskadeellerutilstrekkelig muskelenergiforsyning, på dette tidspunktet er gjenoppretting av muskelstyrke og funksjon spesielt viktig. Ulike kosttilskudd har blitt brukt for å fremme skjelettmuskelhypertrofi og forbedre idrettsprestasjoner [1]. Som skjæringspunktet mellom den organiske karbon- og nitrogenmetabolismen og samtidig et kritisk mellomprodukt i TCA-syklusen, har -Ketoglutarate (AKG) vist pleiotropiske effekter for å forbedre muskelytelsen i kliniske og dyreforsøk [2–9]. For eksempel kan AKG redusere tarmslimhinneskader [8] og betennelse [9], dempeutvikling av tykktarmskreft[4] og leverfibrose [5], fremmer vekst [6], og reduserer sykelighet ogforsinke aldring[7]. Tidligere arbeider har vist at AKG-tilskudd kan lindre muskeltap ved parenteral administrering i en traumemodell av pasienter som gjennomgår total hofteprotese [2], og fremme muskelhypertrofi og proteinsyntese gjennom Akt/mTOR-signalveier [10,11]. Når det gjelder Duchenne muskeldystrofi, kan AKG-tilskudd forhindre muskelatrofi og dysfunksjon gjennom PHD3/ADRB2-mediert vei [12]. Vårt tidligere arbeid viste også at AKG-tilskudd i stor grad kan lette spredningen av C2C12-myoblaster, og lindre atrofien til C2C12-myotuber dyrket i et medium uten glukose [13]. Gitt at glukose er hovedkilden til energi for å opprettholde normale fysiologiske funksjoner i skjelettmuskulaturen, er effekten av AKG-tilskudd for å forbedre muskelytelsen i stor grad avhengig av glukosenivået i skjelettmuskulaturen. Forskjellene mellom de AKG-induserte effektene i skjelettmuskulatur mellom ulike energitilstander er uklare.

AKG deltar i syntesen av aminosyrer, vitaminer ogorganiske syrerogenergimetabolismei kroppen, som involverer omdannelsen av AKG til glutamat ved hjelp av glutamatdehydrogenase, og den påfølgende amideringen av glutamat med ammoniakk ved hjelp av glutaminsyntetase. AKG gir energien for cellevekst via TCA-syklusen og oksidativ fosforylering og fremmer cellemetabolisme og signalering ved å interagere med sin reseptor OXGR (en G-proteinkoblet reseptor) på cellemembranen [14,15]. Dessuten kan AKG regulere mitokondriell oksidativ metabolisme og fremme den permissive epigenetiske tilstanden ved å formidle tidlig embryonal celletilstandsovergang og kimcelleutvikling [16]. Videre kan treningsindusert AKG stimulere sin reseptor OXGR1 i binyrene for å kontrollere termogenese og nedbrytning av triglyserider i fettvev og gi gunstige effekter på metabolismen [17].

Det er imidlertid utført få studier for å avdekke AKG-induserte metabolske endringer av skjelettmuskulatur i forskjellige energitilstander og de underliggende metabolske mekanismene. Nylig har metabolomisk analyse blitt brukt for å systematisk klargjøre de molekylære mekanismene som ligger til grunn for de gunstige effektene av kosttilskudd. Vekslinger av metabolitter som fungerer som nedstrømsprodukter av gentranskripsjon kan reflektere overordnede metabolske endringer intuitivt. Som spesielt egnede teknikker for kvantitativt påvisning av endringer i metabolittnivåer i biofluider, vev og celler, har høyoppløselig, 1H kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi blitt brukt mye i metabolomiske analyser. Betydelig nok har NMR-basert metabolomisk profilering flere fordeler som høy reproduserbarhet, kvantitativ måling uten fordommer og praktisk prøveforberedelse [18,19]. Tidligere har vi utført NMR-baserte metabolomiske analyser for å belyse både effekten av kreatintilskudd på C2C12 myoblaster [20], og effekten av alanyl-glutamin tilskudd på myoblaster skadet av energimangel [21].

2. Resultater

2.1. Spredning og differensiering av C2C12-myoblaster med AKG-supplement

C2C12 myoblastceller dyrket i et normalt vekstmedium med og uten AKG-tilskudd ble gruppert som Nor-A og Nor, mens de i lavglukose-vekstmedium med eller uten AKG-tilskudd ble gruppert som Low-A og Low. I samsvar med den forrige studien [10], viste Nor-A-celler med AKG-tilskudd i en konsentrasjon på 2 mm en betydelig forbedret cellelevedyktighet i forhold til Nor-celler (figur S1).

Derfor ble AKG-konsentrasjonen på 2 mm brukt i forsøkene for å vurdere AKG-induserte endringer i spredning og differensiering av myoblaster. Sammenlignet med Nor-celler, viste Low-celler en sterkt redusert spredningshastighet på grunn av energimangel (Figur 1A). Selv om AKG-tilskudd ikke forårsaket signifikant forskjellig morfologi av myoblaster i de to energitilstandene, økte det ikke bare spredningshastigheten til lav-celler dyrket i et medium med lavt glukosenivå, men forbedret også spredningshastigheten til Nor-celler dyrket i et normalt medium iht. tidligere studier [10,12]. Celletall per et gitt område ble talt for de fire gruppene av myoblaster (n=4 for gruppen): Nor, 563,8 ± 10.4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; Lav, 493,8 ± 14,5; Lav A, 547,0 ± 11,7 (Figur 1B). Det er verdt å merke seg at Low-A-celler ikke viste statistisk forskjellige celletall fra Nor-celler, noe som indikerer at AKG-tilskudd kunne gjenopprette celletall for myoblastene under lavglukosekulturforhold (figur 1B).

Figur 1, Proliferasjons- og differensieringsevner til C2C12-myoblaster under forholdene med normal kultur og lav. glukosekultur. (A) Myoblasts morfologier. (B) Celletall som tilsvarer panel A (n=4). (C) Cellelevedyktighet i forhold til Nor-celler analysert ved MTS-celleproliferasjonsanalyse (n=5). (D) MyoD1-uttrykk i myoblaster analysert med western blot. Anti-GAPDH-antistoffet ble brukt for å standardisere mengden protein i hver bane. (E) Statistisk analyse som tilsvarer panelene (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

I tillegg ble MTS-analysen utført for å kvantitativt sammenligne spredningshastighetene til de fire cellegruppene (figur 1C). Lave celler hadde en tydelig redusert proliferasjonsrate sammenlignet med Nor-celler, noe som indikerer at lavglukosemediet ugunstiget spredningen av celler. Det er betydelig at AKG-tilskudd økte spredningsratene til Nor-A- og Low-A-celler i forhold til henholdsvis Nor- og Low-celler. Merk at Low-A-celler viste en spredningsevne lavere enn Nor-celler, noe som antyder at AKG-tilskudd bare delvis gjenopprettet spredningen av celler dyrket i et medium med lavt glukoseinnhold

.Uttrykket av det myogene differensierings-1 (MyoD1)-proteinet brukes vanligvis for å karakterisere differensieringsevnen til celler. Vi sammenlignet dermed kvantitativt uttrykkene til MyoD1 mellom de fire cellegruppene (figur 1D). Lave celler viste en dypt redusert differensieringsevne sammenlignet med Nor-celler. Det er betydelig at AKG-supplementation oppregulerte differensieringsevnen til celler dyrket både i normalt medium og i lavglukosemedium, som indikert av omtrent 30 prosent økning av MyoD1-uttrykk i Nor-A- og Low-A-celler. Spesielt viste Low-A-celler ikke statistisk signifikant forskjellig MyoD1-uttrykk fra Nor-celler, noe som antyder den høye effektiviteten til AKG-supplement for å gjenopprette differensieringsevnen til celler dyrket i et medium med lavt glukose.

Videre analyserte vi myotube-differensieringsevner for de fire gruppene av C2C12-myoblaster. Myotuber ble dannet gjennom fusjon av myoblaster dyrket i normale og lavglukose-differensieringsmedier med eller uten AKG-tilskudd Figur S3). Morfologier av C2C12-myotubene viste at lavglukosekulturen svekket myotubedifferensieringsevnen til celler, og AKG-tilskudd kunne fremme myotubedifferensiering av myoblaster dyrket både i et normalt medium og i et ow-glukosemedium.

2.2. NMR-spektra av vandige ekstrakter av C2C12-myoblaster

Typiske 850 MHz 1H NMR-spektra ble registrert på vandige ekstrakter avledet fra Nor-, Nor-A-, Low- og Low-A-gruppene av C2C12-myoblaster (Figur 2A). Totalt 34 metabolitter ble tildelt og oppsummert i tabell S1. Resonanstilordningene til metabolittene ble bekreftet ved å bruke 2D 1H-13C HSOC og 1H-H TOCSY-spektra (figur S4 og S5). Den visuelle inspeksjonen av NMR-spektrene indikerte at dyrking av myoblaster med AKG-supplement resulterte i betydelige akkumuleringer av intracellulær AKG i Nor-A- og Low-A-celler (Figur 2B).

Figur 2, gjennomsnittlig 850 MHz lH kjernemagnetisk resonans (NMR)-spektra registrert på vandige ekstrakter avledet fra Nor-, Nor-A-, Low- og Low-A-gruppene av C2C12-myoblaster. (A) Sammenligning av gjennomsnittlig NMR-spektra for de fire gruppene. De vertikale skalaene ble holdt konstant i alle IH NMR-spektrene. Vannregionen (4.7-5.2 ppm) ble fjernet(B) Lokale amplifiserte områder av a-Ketoglutarat (AKG)-topper. Blå/grønn/gul/rød linje: spektralområder fra gruppene Nor/Nor-A/Low/Low-A. AKG, a-ketoglutarat; PC, O-fosfokolin; GPC, sn-glysero-3-fosfokolinUDP-glukose, uridindifosfatglukose: CTP, sn-glysero-3-fosfokolin; NAD pluss, nikotinamid adenin dinukleotid AXP adenin mono /di /trifosfat.

2.3. Multivariat dataanalyse for å utforske cellulære metabolske profiler

Vi utførte videre multivariat dataanalyse på NMR-spektraldata for metabolsk profilering av de fire gruppene av C2C12-myoblaster. Vi etablerte først tre uovervåkede PCA-modeller med de to første komponentene (PC1, PC2) for å få oversikt over grupperingstrendene og avsløre metabolske forskjeller mellom gruppene av myoblaster. ThePCA-poengdiagrammene viser at den metabolske profilen til celler dyrket i et medium med lavt glukose var tydelig skilt fra det som ble dyrket i et normalt medium (Figur 3A), og AKC-supplementering endret signifikant de metabolske mønstrene til cellene dyrket både i et normalt medium og i lavglukosemedium (figur 3B,C). Imidlertid var den metabolske forskjellen mellom Nor-A- og Nor-gruppene større enn den mellom Low-A- og Low-gruppene, noe som antyder at effekten av AKG-tilskudd på den metabolske profilen til myoblaster er sterkt avhengig av energitilstanden til cellene.

Figur 3. Multivariate analyser for 'HNMR-spektra ble registrert på vandige ekstrakter avledet fra C2C12-myoblaster av Nor-, Nor-A-, Low- og Low-A-gruppene. (AC) PCA skårer plott av Low- og Nor-gruppene, Low-A- og Low-gruppene Nor-A- og Nor-gruppene; (DF) OPIS-DA skårer plott av lav- og nord-gruppene (R2: 0.999, 02: 0.996), gruppene lav- og lav (R2: 0.918: 02: 0.761), Nor-A- og Nor-gruppene (R2: 0,927: 02: 0,838). Ellipsene indikerer 95 prosent konfidensgrense.

Videre etablerte vi tre overvåkede OPLS-DA-modeller for å illustrere metabolske separasjoner mellom de fire gruppene av myoblaster (Figur 3D-F). Som forventet maksimerte OPLSDA-modellene de metabolske forskjellene mellom de fire gruppene ved å reservere den korrelerte ortogonale variabelinformasjonen og filtrere ut ukorrelert ortogonal variabelinformasjon. Videre utførte vi tilfeldige permutasjonstester (n=200) for å evaluere påliteligheten til OPLS-DA-modellene (Figur S6), som indikerer gyldigheten til de etablerte OPLS-DA-modellene.

2.4. Identifikasjoner av differensielle og viktige metabolitter

For å kvantitativt sammenligne metabolittnivåer mellom de fire gruppene av C2C12-myoblaster, beregnet vi de relative nivåene av de identifiserte metabolittene basert på deres relative integraler (tabell S2). Dramatisk AKG-tilskudd økte intracellulære AKG-nivåer i Nor-A- og Low-A-gruppene, men endret ikke signifikant de i Nor- og Low-gruppen. Vi utførte Students t-test for å identifisere differensielle metabolitter med et kriterium på p < 0.05 (Figur 4). Sammenligningen av Nor vs. Low identifiserte 29 differensielle metabolitter (Figur 4A), inkludert 18 forbedrede metabolitter (leucin, isoleucin, valin, acetat, glutamat, glutamin, metionin, aspartat, lysin, kreatin, PC (O-fosfokolin)taurin, tyrosin , fenylalanin, histidin, NAD pluss, format, AXP), og 11 avviste Metabo. lite (glutation, pyroglutamat, fosfokreatin, beta-alanin, GPC, glukose, glycin, acetat, treonin, GTP, UDP-glukose). Sammenligningen av Low-A vs Low-identifiserte differensielle metabolitter (Figur 4B), inkludert 7 økte metabolitter (etanol, AKGbeta-alanin, PC, taurin, glycin og GTP) og 3 reduserte metabolitter (glutamin, lysin og myoinositol). Sammenligningen av Nor-A vs. Nor identifiserte 18 differensielle metabolitter (Figur 4C), inkludert 6 oppregulerte metabolitter (AKG, pyroglutamat, glutamin, lysin, glukose, laktat) og 12 nedregulerte metabolitter (alanin, acetat, glutation) metionin, fosfokreatin, PC, myoinositol, glycin, treonin, GTP, UDP-glukose og AXP).

Figur 4. Relative intensiteter av differensielle metabolitter ble identifisert fra parvise sammenligninger mellom de fire gruppene av C2C12 myoblaster. (A) Lav vs. Nor; (B) Lav-A vs. Lav; (C) Nor-A vs. Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} for hver gruppe.

Videre brukte vi OPLS-DA-modellene for å identifisere viktige metabolitter med et kriterium på VIP > 1 (Figur 5). Totalt ble 12, 10 og 10 viktige metabolitter identifisert fra OPLS-DA-modellene av Nor-A vs. Nor, Nor vs. Low, Low-A vs. Low.

Figur 5. VIP-skårer for viktige metabolitter ble identifisert fra parvise sammenligninger mellom de fire gruppene av C2C12myoblaster. (A) Lav vs. Nor; (B) Lav-A vs. Lav; (C) Nor-A vs. Nor. Rød/blå skrift angir økte/reduserte nivåer av metabolitten.

Kombinasjonen av de identifiserte viktige metabolittene og differensielle metabolitter ga karakteristiske metabolitter (tabell 1). De parvise sammenligningene av Low vs. Nor, Low-A vs. Low og Nor-A vs. Nor identifiserte henholdsvis 10, 6 og 10 karakteristiske metabolitter, noe som indikerer at effekten av AKG-tilskudd på myoblaster var nært assosiert med energien. tilstand av celler.

2.5. Identifikasjon av betydelig endret metabolsk

Veier Vi utførte metabolsk veianalyse for å identifisere signifikant endrede metabolske veier (signifikante veier) basert på nivåene av metabolitter identifisert fra de parvise sammenligningene mellom de fire gruppene av C1C12 myoblaster (Figur S7; Tabell 2 og Tabell S3). Analysen av Nor vs Low identifiserte 11 signifikante veier: (1) Alanin-, aspartat- og glutamatmetabolisme; (2) glysin-, serin- og treoninmetabolisme; (3) glutationmetabolisme; (4) D-glutamin og D-glutamat metabolisme; (5) Metabolisme av stivelse og sukrose; (6) beta-alanin metabolisme; (7) Taurin og hypotaurin metabolisme; (8) Fenylalaninmetabolisme; (9) Fenylalanin, tyrosin og tryptofan biosyntese; (10) Nikotinat- og nikotinamidmetabolisme; (11) Histidinmetabolisme. Denne betydelige veien var assosiert med energimetabolisme, oksidativt stress og anaplerotisk fluks i TCA-syklusen.

Analysen av Nor-A vs. Nor identifiserte bare de fem første signifikante veiene 1–5, ekskludert de andre seks veiene 6–11. På en annen måte, identifiserte analysen av Low-A vs. Low bare seks signifikante veier: de fire første veiene 1–4 delt av sammenligningene av Low vs. Nor, Nor-A vs. Nor; to veier 6–7 delt av sammenligningen av Low vs. Nor. Legg merke til at AKG-tilskudd ikke signifikant endret vei 5 (stivelse og sukrosemetabolisme) i celler dyrket i et lavglukosemedium, men interfererte med to andre veier (beta-alaninmetabolisme og taurin- og hypotaurinmetabolisme). For å visualisere AKG-induserte endringer i karakteristiske metabolitter, projiserte vi disse metabolittene på et metabolsk kart basert på Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database (figur 6). KEGG har blitt mye brukt som en av hoveddataressursene for å rekonstruere metabolske nettverk og fremhever betydelige metabolske veier. Både de endrede karakteristiske metabolittene og betydelig endrede metabolske veier gir ny innsikt i de molekylære mekanismene som ligger til grunn for effekten av AKG-tilskudd på C2C12-myoblaster.