Abstrakt

Cistanche tubulosaer en verdifull tonic urt mye brukt i tradisjonell kinesisk medisin. Fenyletanoidglykosider representert ved echinacoside og acteosid er dens bioaktive kjernestoffer. Denne forskningen tar sikte på å optimalisere moderne prosesseringsparametere forCistanche tubulosaavkoksstykker for å forbedre utbyttet av echinacosid og acteosid, og videre utforske dets antioksidative stress og anti-inflammatoriske mekanisme på cellenivå.

Enkeltfaktoreksperimenter ble utført, etterfulgt av Box-Behnken respons-overflateoptimalisering med skivetykkelse, damptid og tørketemperatur som påvirkningsfaktorer. Høyytelses væskekromatografi (HPLC) ble tatt i bruk for å oppdage innholdet av to markørforbindelser. Den LPS-induserte RAW264.7 makrofagskademodellen ble konstruert for å vurdere farmakologiske aktiviteter. Reaktive oksygenarter (ROS), nitrogenoksid (NO), malondialdehyd (MDA), aktivitetene til antioksidantenzymer inkludert SOD, CAT, LDH og glutation (GSH) innhold ble bestemt. ELISA ble brukt til å teste sekresjonsnivået av pro-inflammatoriske cytokiner TNF-, IL-1 og IL-6. Western blot-analyse ble utført for å analysere fosforyleringsstatusen til nøkkelproteiner i p38/AKT/JNK/NF‑κB-signalveien.

De optimale bearbeidingsforholdene var skivetykkelse på 0,6 cm, damptid på 6 minutter og tørketemperatur på 57 grader. Under denne tilstanden nådde innholdet av akteosid 7,25 % og echinakosid nådde 31,62 %. Ekstrakter fra optimaliserte avkoksstykker kan betydelig redusere overproduksjonen av intracellulær ROS, NO og MDA i LPS-stimulerte RAW264.7-celler. Det forbedret aktivitetene til SOD, CAT, LDH og økte intracellulært GSH-nivå, samtidig som den hemmet frigjøringen av TNF-, IL-1 og IL-6 markant. Western-blot-resultater indikerte at ekstraktet nedregulerte fosforyleringsforholdet til p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK og p-NF-κB/NF-κB.

Den optimaliserte dampende-tørkende prosesseringsteknologien kan effektivt øke utvinningshastigheten for hovedfenyletanoidglykosider avCistanche tubulosa. Avkoksstykker utøver antioksidative og antiinflammatoriske effekter mot LPS-utløst celleskade gjennom å hemme p38/AKT/JNK/NF‑κB-signalveien. Denne studien gir praktiske tekniske parametere for standardisert industriell prosessering avCistanche tubulosa, og tilbyr eksperimentelle bevis for utvikling av funksjonell mat og næringsprodukter avledet fra denne urteressursen.

Nøkkelord: Cistanche tubulosa; prosesseringsteknologi for avkok; akteosid; echinacoside; antioksidativt stress; RAW264.7 makrofag; p38/AKT/JNK/NF‑κB-vei

1. Introduksjon

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight tilhører Orobanchaceae-familien, og dens medisinske del er den tørkede kjøttfulle stilken med skjellblader. I Kina er denne planten hovedsakelig plantet i tørre områder i nordvest, med det største planteområdet i det sørlige Xinjiang. Som en velkjent styrkende urtemedisin, fungerer den for å tonifisere nyre-yang, fylle på essens og blod, og fukte tarmene for å lindre forstoppelse. Klinisk brukes det til behandling av nyre-yang-mangel, mangel på essens-blod, infertilitet, sårhet og svakhet i midje og knær, samt tørr tarm forstoppelse.

Fenyletanoidglykosider, hovedsakelig echinacoside og acteosid, er de primære aktive komponentene iCistanche tubulosa. According to Chinese Pharmacopoeia requirements, the total content of echinacoside and acteoside in qualified raw medicinal materials shall not be lower than 1.50 %, which serves as the critical quality evaluation indicator. Tradisjonelle behandlingsmetoder forCistanche tubulosabruker for det meste bløtleggings-fukting, skjæring-tørking eller vindamping. Mange studier fokuserer på å forbedre utbyttet av aktive komponenter, mens forskning som kombinerer prosesseringsteknologioptimalisering med verifisering av biologisk aktivitet fortsatt er utilstrekkelig.

Oksidativt stress fungerer som det felles patologiske grunnlaget for flere metabolske og inflammatoriske sykdommer. Eksisterende undersøkelser har bevist at totalt glykosider ekstrahert fraCistanche tubulosakan undertrykke inflammatorisk respons og aktivere Nrf2/HO‑1-veien for å lindre leverskade hos sepsisdyr. Lignanglykosidfraksjoner fra denne urten kan dempe makrofagbetennelse ved å regulere PI3K/AKT-signalering. Nevertheless, the pharmacological property of modern processed decoction pieces and its underlying molecular mechanism still require further exploration.

I denne studien ble Box-Behnken respons-overflatedesign brukt basert på enkeltfaktortester, og tok skivetykkelse, damptid og tørketemperatur som variabler for å optimere prosesseringsarbeidsflyten. Etter å ha oppnådd optimale tekniske parametere, ble LPS-indusert RAW264.7-cellemodell for oksidativ skade etablert for å evaluere antioksidativt stress og anti-inflammatorisk kapasitet og dissekere relevant signalmekanisme. Dette arbeidet har til hensikt å gi stabile og operative prosessparametere for produksjon i pilotskala, og legge eksperimentelt grunnlag for omfattende utnyttelse avCistanche tubulosaressurser.

2. Materialer og metoder

2.1 Plantemateriale, reagenser og instrumenter

Friske kjøttfulle stilker avCistanche tubulosable høstet om høsten fra Hotan, Xinjiang. RAW264.7 musemonocyttmakrofageleukemiceller ble kjøpt fra Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Kina).

Acetonitril og metanol av HPLC-kvalitet ble hentet fra Merck-selskapet. Echinacoside (større enn eller lik 98 %) og acteosid (større enn eller lik 98 %) referansestandarder ble levert av Beijing North Weiye Metrology Institute. Dimetylsulfoksid (DMSO) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. DMEM høyglukosemedium, føtalt bovint serum (FBS), penicillin-streptomycin-dobbeltantistoffløsning, BCA-proteinkvantifiseringssett, analysesett for NO, MDA, SOD, CAT, GSH og LDH, lipopolysakkarid (LPS), MTT-reagens og ELISA-produkter cytokin-sett for alle kommersielle produkter.

Eksperimentelle instrumenter inkluderte Shimadzu høyytelses væskekromatograf, rotasjonsfordamper, pulverisering av kinesiske urter, termostatisk støytørkeovn, dampkoker, fullbølgelengde mikroplateleser, elektronisk analytisk balanse, nedkjølt sentrifuge, biosikkerhetsmikroskopskap og invertert optisk mikroskop.

2.2 Enkeltfaktor-prosesseringseksperiment

FerskCistanche tubulosakjøttfulle stilker ble skåret i skiver med tykkelse på 0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm og 1,2 cm. Skivene ble dampet i henholdsvis 3 minutter, 6 minutter, 9 minutter, 12 minutter, 15 minutter, 18 minutter og 21 minutter, og tørket under forskjellige temperaturgradienter inkludert romtemperatur (25 grader), 40 grader, 50 grader, 60 grader, 70 grader og 80 grader. Tørkede avkoksprøver ble knust og siktet gjennom en 40-mesh sikt for påfølgende påvisning. Formel for sammensatt poengsum ble tatt i bruk for en omfattende vurdering: Sammensatt poengsum=echinakosidinnhold × 50 % + akteosidinnhold × 50 %.

2.3 HPLC-bestemmelse av akteosid og echinakosid

Klargjøring av prøveløsning: vei nøyaktig 1,0 g pulverprøve, tilsett 100 ml 50 % metanolløsning. Etter 30 min bløtlegging ble ultralydekstraksjon utført i 40 min. Vekttapet ble supplert med 50 % metanol etter avkjøling. Supernatanten ble filtrert med 0,22 μm mikroporøs membran før HPLC-injeksjon.

Blandet referansestandardløsning av akteosid og echinakosid ble tilberedt med 50 % metanol og fortynnet til seriekonsentrasjoner for standardkurveplotting. Kromatografiske forhold: COSMOSIL C18 kromatografisk kolonne; mobilfasesystemet besto av 0,1 % vandig fosforsyreløsning (A) og acetonitril (B); deteksjonsbølgelengden ble satt til 330 nm; kolonnetemperatur 35 grader; strømningshastighet 1 ml/min. Ekstern standardmetode ble brukt for kvantitativ beregning av målforbindelser.

2.4 Box-Behnken Response-Surface Experimental Design

I henhold til enkeltfaktoreksperimentelle resultater ble skivetykkelse (X₁), damptid (X₂) og tørketemperatur (X₃) valgt som uavhengige variabler. Akteosidinnhold (Y1, %) og echinakosidinnhold (Y2, %) tjente som responsverdier. Design-Expert 13.0-programvare ble brukt til å etablere et tre-faktor tre-nivå Box-Behnken eksperimentelt opplegg med totalt 17 grupper av tester. Modelltilpasning, variansanalyse og parameterprediksjon ble fullført av programvare. Praktiske verifikasjonsforsøk ble utført i tre eksemplarer etter justering av teoretiske optimale parametere for å passe til faktisk produksjonsoperasjon.

2.5 Cellekultur og prøvepreparering

Avkoksprøve som ble oppnådd under optimaliserte behandlingsbetingelser ble tilberedt til ekstraktpulver. Pulveret ble oppløst i DMSO og videre fortynnet med komplett DMEM-medium inneholdende 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin for celleforsøk. RAW264.7-celler ble dyrket i fuktet inkubator ved 37 grader med 5 % CO2.

2.6 MTT-analyse for cellelevedyktighet

Cellesuspensjon ble inokulert i 96-brønners plater ved celletetthet på 8 × 104 celler/ml. Grupper ble satt som løsemiddelkontrollgruppe (0,1 % DMSO), LPS-modellgruppe (1 ug/ml LPS) og flere konsentrasjonsgrupper avCistanche tubulosaekstrakt (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). Etter 2-timers pre-inkubering av prøver, ble LPS med sluttkonsentrasjon på 1 ug/mL tilsatt bortsett fra løsningsmiddelkontrollbrønner og inkubert i ytterligere 24 timer. MTT-løsning (5 mg/ml) ble tilsatt for 4 timers reaksjon. Etter fjerning av supernatanten ble DMSO tilsatt for å oppløse formazankrystall. Absorbansverdi ved 490 nm ble detektert av mikroplateleser for å beregne cellelevedyktighet. Sikkert konsentrasjonsområde ble valgt for oppfølgingsfunksjonstester.

2.7 Intracellulær ROS-måling

RAW264.7-celler ble sådd i 6-brønns plater med en tetthet på 4 × 10⁵ celler per brønn. Etter å ha festet seg til veggen, ble cellene forbehandlet med gradient-konsentrasjonCistanche tubulosaekstrakt (12,5, 25, 50, 100 ug/mL) i 2 timer, deretter stimulert med 1 ug/mL LPS i 24 timer. Intracellulært ROS-nivå ble påvist med fluorescerende probereagenssett. Fluorescensintensitet ble registrert under eksitasjonsbølgelengde 488 nm og emisjonsbølgelengde 525 nm.

2.8 Påvisning av NO, MDA, SOD, CAT, LDH og GSH

Cellekultursupernatant ble samlet for å oppdage NO-innhold via Griess-metoden. Celler ble vasket med forhåndskjølt PBS og lysert på is. Cellelysat ble sentrifugert ved 10 000 rpm under 4 grader i 5 minutter for å oppnå intracellulær supernatant. MDA-innhold, enzymaktiviteter for SOD, CAT, LDH og GSH-nivå ble målt strengt i samsvar med settspesifikasjonene. BCA-metoden ble brukt for total-proteinnormalisering.

2.9 ELISA-påvisning av pro-inflammatoriske cytokiner

RAW264.7-celler ble behandlet med prøve og LPS i 16 timer. Kultursupernatanten ble samlet og sentrifugert ved 10 000 rpm i 10 min. Sekresjonskonsentrasjonene av TNF‑, IL‑1 og IL‑6 ble kvantifisert ved hjelp av ELISA-sett.

2.10 Western blot-analyse

Etter 45-minutters intervensjon av prøver og LPS, ble totalt cellulært protein ekstrahert ved bruk av RIPA-lysebuffer. Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert med BCA-sett. Like mengde proteinprøve (50 ug for hver bane) ble denaturert, separert ved SDS-PAGE-elektroforese og overført til PVDF-membran. Membranen ble blokkert med 5 % skummetmelk TBST-løsning i 1 time, deretter inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 grader. Etter gjentatt vasking med TBST ble sekundært antistoff inkubert ved romtemperatur i 1 time. Målproteinbånd ble visualisert med ECL kjemiluminescensreagens. Båndgråskalaanalyse ble utført for å beregne forholdet mellom fosforylering og protein totalt.

2.11 Statistisk analyse

GraphPad Prism 8.0.2-programvaren ble brukt til grafplotting og statistisk analyse. Enveis ANOVA og t-test ble tatt i bruk for datasammenligning.P < 0.05 represented statistically significant difference; P < 0.01 and P < 0.001 stood for higher significance. All experimental data were expressed as mean ± standard deviation (\(\bar{x}\pm s\)).

3. Resultater

3.1 Enkeltfaktoreksperimentelle resultater

Skivetykkelse utøvde fremtredende innflytelse på målglykosidinnholdet. Skiver med 0,2 cm tykkelse var lett å overdampe, noe som forårsaket termisk nedbrytning av aktive ingredienser. For tykke skiver hindret frigjøring av indre aktive stoffer. Når dampingstiden var fastsatt til 10 minutter og tørketemperaturen på 60 grader, var 0,4 cm den optimale skivetykkelsesparameteren i enkeltfaktorsikting.

Utilstrekkelig damptid kunne ikke fullstendig ødelegge plantecellestrukturen og førte til lavt glykosidutbytte. Når dampingstiden oversteg 6 minutter, oppsto vevsdesintegrasjon og echinakosid så vel som acteosid ble degradert. Under fast skivetykkelse på 0,4 cm og tørketemperatur på 60 grader, var 6 minutter den beste dampingstiden.

Innenfor et visst område steg innholdet av fenyletanoidglykosider sammen med økningen i tørketemperaturen, men nedbrytningen fant sted når temperaturen oversteg 60 grader. Med skivetykkelse på 0,4 cm og damptid på 6 minutter, viste 60 grader den beste omfattende ytelsen i enkeltfaktorsikting.

3.2 Respons-overflateoptimalisering og verifikasjonstest

Variansanalyse viste at regresjonsmodeller for akteosid- og echinakosidinnhold var signifikante (P < 0.05, P < 0.01). The lack‑of‑fit term was non‑significant (P >0,05), som indikerer god modelltilpasningsgrad. Bestemmelseskoeffisienten R² var nær 1, noe som viste høy korrelasjon mellom predikert verdi og faktiske eksperimentelle data.

Den påvirkningsrekkefølgen av faktorer for akteosidinnhold var skivetykkelse > tørketemperatur > damptid. For echinakosidinnhold var rekkefølgen damptid > tørketemperatur > skivetykkelse.

Teoretiske optimale parametere beregnet av programvare var skivetykkelse 0,600 cm, damptid 5,685 min og tørketemperatur 57,009 grader. Med tanke på praktisk produksjonstilstand ble parametere justert til skivetykkelse 0,6 cm, damptid 6 min og tørketemperatur 57 grader. Tre grupper av parallelle verifikasjonseksperimenter oppnådde akteosidinnhold på 7,25 % og echinakosidinnhold på 31,62 %. Avviket mellom praktisk verdi og teoretisk predikert verdi var henholdsvis 3,89 % og 4,92 %, noe som demonstrerte påliteligheten til denne respons-overflatemodellen.

3.3 Resultat av screening av cellelevedyktighet

Innenfor 0-100 ug/ml konsentrasjonsområde,Cistanche tubulosaavkoksekstrakt hadde ingen åpenbar cytotoksisitet på RAW264.7-celler og viste en liten spredningsfremmende effekt. Når konsentrasjonen nådde 200 ug/ml og over, ble cellelevedyktigheten betydelig redusert. Derfor ble 12,5 ug/ml, 25 ug/mL, 50 ug/ml og 100 ug/ml valgt som arbeidskonsentrasjoner for påfølgende celleeksperimenter.

3.4 Effekt på intracellulært ROS-nivå

Sammenlignet med løsningsmiddelkontrollgruppe, viste LPS-modellgruppen bemerkelsesverdig forhøyet intracellulær ROS-fluorescensintensitet (P < 0.001), proving the successful establishment of oxidative‑stress injury model. Pretreatment of Cistanche tubulosaekstraher redusert overdreven ROS-akkumulering på en doseavhengig måte (P < 0.001 versus model group).

3.5 Forskrift om NO, MDA og antioksidantrelaterte indikatorer

LPS-stimulering induserte kraftig økning av NO- og MDA-innhold i RAW264.7-celler. Sammenlignet med LPS-modellgruppen, reduserte ekstraktintervensjon signifikant NO-nivået med doseavhengig tendens . 12.5 ug/mL ekstrakt ga ikke åpenbar effekt på MDA-innhold, mens 25-100 ug/mL ekstrakt observerbart reduserte MDA-konsentrasjonen (P < 0.001).

Etter LPS-behandling reduserte aktivitetene til SOD, CAT, LDH og intracellulært GSH-innhold markant . 12.5 ug/mL ekstrakt kunne forbedre SOD-aktiviteten uten å forbedre CAT- og LDH-aktivitetene. Ekstraher ved en konsentrasjon på 25-100 ug/mL signifikant forhøyet SOD, CAT, LDH enzymaktivitet og GSH-innhold på en konsentrasjonsavhengig måte.

3.6 Hemmende effekt på pro-inflammatorisk cytokinsekresjon

LPS-stimulering utløste massiv frigjøring av TNF‑, IL‑1 og IL‑6 i RAW264.7 makrofager.Cistanche tubulosaForbehandling av avkoksekstrakt undertrykte bemerkelsesverdig sekresjonen av de ovenfor nevnte tre pro-inflammatoriske cytokiner (P < 0.001), presenting prominent dose‑dependent anti‑inflammatory property.

3.7 Modulering på p38/AKT/JNK/NF‑κB signalvei

Sammenlignet med løsemiddelkontrollgruppe, økte LPS-intervensjon fosforyleringsforholdet til p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK og p-NF-κB/NF-κB. Middels og høydose ekstraktgrupper reduserte p-p38/p38 og p-JNK/JNK-forholdet betydelig. Alle konsentrasjonsgrupper nedregulerte p‑AKT/AKT og p‑NF‑κB/NF‑κB nivå (P < 0.05 or P < 0.001). Results illustrated that optimized Cistanche tubulosaavkoksekstrakt begrenset aktiveringen av p38/AKT/JNK/NF‑κB-signalveien ved å hemme proteinfosforylering.

4. Diskusjon

Gjeldende behandlingskrav forCistanche tubulosaregistrert i kinesisk farmakopé beskriver kun kvalitative operasjonstrinn uten presise kvantitative parametere. Tidligere undersøkelser indikerte at forskjellige prosesseringsmetoder ville forårsake store forskjeller i kjemisk sammensetning og farmakologisk aktivitet mellom råolje og bearbeidetCistanche tubulosaprøver. Bearbeidede produkter viser bedre antioksidant- og immunregulerende ytelse sammenlignet med råvarer.

I denne forskningen oppnådde den moderne dampende-tørkingsprosessen optimalisert via respons-overflatemetodikk mye høyere utbytte av echinacosid og acteosid enn mange tradisjonelle prosesseringsteknikker. Det antyder at nøyaktig kontroll over skivetykkelse, dampvarighet og tørketemperatur effektivt kan beholde og forbedre innholdet av fenyletanoid-glykosid iCistanche tubulosa.

Oksidativt stress og betennelse er nært forbundet patologiske prosesser. Overdreven ROS gir opphav til lipidperoksidasjon og MDA-akkumulering; i mellomtiden aktiverer den nedstrøms inflammatoriske kaskader og fremmer dannelsen av NO og flere pro-inflammatoriske cytokiner. Inflammatoriske mediatorer akselererer ROS-produksjonen ytterligere og danner en ond patologisk syklus. Våre cellulære eksperimentelle resultater viste at det var optimalisertCistanche tubulosaekstrakt av avkok kan eliminere overflødig ROS, redusere oksidativ skade markører NO og MDA, gjenopprette aktiviteten til antioksidant enzymsystem representert ved SOD, CAT, LDH og fylle på intracellulær GSH, samt hemme frigjøring av pro-inflammatoriske cytokiner med åpenbart dose-effekt forhold.

p38, JNK som tilhører MAPK-familien og AKT-NF-κB-aksen er kjernesignaltransduksjonshuber som formidler oksidativ-inflammatorisk respons fra makrofager. LPS-stimulering fremmer fosforylering av p38, JNK og AKT, aktiverer NF‑κB ytterligere og induserer transkripsjon av en rekke pro-inflammatoriske gener. Western-blot-data avslørte detCistanche tubulosaavkoksekstrakt blokkerte fosforyleringsaktivering av p38, JNK, AKT og NF‑κB. Det antas at echinacosid og acteosid med høyt innhold fra optimalisert prosessering i fellesskap bidrar til å undertrykke p38/AKT/JNK/NF‑κB signalkaskade, for å lindre LPS-forårsaket oksidativt stress og inflammatorisk skade i RAW264.7 makrofager.

Det er fortsatt begrensninger i denne studien. Alle farmakologiske evalueringer ble fullført på in vitro-cellemodell. Ytterligere eksperimenter på dyrenivå er nødvendige for å verifisere in vivo-effektivitet og metabolske egenskaper til behandletCistanche tubulosaavkok biter.

Avslutningsvis etablerte denne studien kvantifiserbar og skalerbar moderne prosesseringsteknologi forCistanche tubulosaavkok biter. Under behandlingsparametere med skivetykkelse 0,6 cm, damptid 6 minutter og tørketemperatur 57 grader, er innholdet av hovedfenyletanoidglykosider sterkt forbedret. Bearbeidede avkoksstykker kan lindre oksidativt stress og inflammatorisk skade i LPS-stimulerte RAW264.7-makrofager ved å hemme p38/AKT/JNK/NF-κB-signalveien. Denne forskningen gir praktisk teknisk referanse for industrialisert produksjon, og tilbyr eksperimentelt grunnlag for å utvikle funksjonelle matvarer og kosttilskuddsprodukter av Xinjiang-opprinnelseCistanche tubulosa.

Anerkjennelser

Dette arbeidet ble støttet av Youth Science and Technology Backbone Innovation Capacity Cultivation Project ved Xinjiang Academy of Agricultural Sciences (xjnkq-2022022) og Xinjiang "Tianchi Doctor Program" (2021).

Referanser

[1] Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Utvinning av echinacoside fraCistanche tubulosaog undersøkelse av dens beskyttende effekt på leverskade hos sepsisrotter.Matvitenskap og teknologi. 2023;43:e010523.

[2] Guo J, Tang S, Miao Y, et al. De antiinflammatoriske effektene av lignanglykosider fraCistanche tubulosastammer på LPS/IFN-induserte RAW264.7 makrofagceller via PI3K/AKT-veien.Nåværende farmasøytisk bioteknologi. 2021;22(10):1380‑1391.

[3] Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Oksidativt stress og metabolske forstyrrelser: Patogenese og terapeutiske strategier.Livsvitenskap. 2016;148:183‑193.

[4] Martínez-de-Toda I, Ceprián N, Díaz-de-Castro E. Rollen til oksyinflammasjonsaldring i menneskelig patofysiologi.Celler. 2021;10(11):2974.

[5] Chung YC, Song SJ, Lee A, et al. Isobavacin lindrer lipopolysakkarid-induserte inflammatoriske responser i makrofager og sebrafisk ved å undertrykke MAPK- og NF-κB-signalveier.Journal of Ethnopharmacology. 2024;321:117501.