Oversikt over Phlorotannins' bestanddeler i Fucales del 2

5. Metoder forKarakterisering og kvantifisering

Til tross for den eksponentielt økende interessen for PTs bioaktiviteter og potensielle anvendelser i en rekke terapeutiske strategier, er en av hovedkampene når man arbeider med disse forbindelsene deres kjemiske karakterisering og strukturelle belysning. På grunn av den enorme kjemiske variasjonen og kompleksiteten til PT-er, alliert med den begrensede tilgjengeligheten av kommersielle standarder, er analysen av PT-er fortsatt en ganske utfordrende oppgave. Det er ganske vanlig å finne arbeid som ikke går lenger enn estimeringen av PT ved bruk av kolorimetriske metoder [56,72,73]. Ikke desto mindre er det gjort mye arbeid for å belyse de strukturelle egenskapene til PT-er, som allerede har gitt relevant innsikt i kjemien til disse forbindelsene.

Glykosid av cistanche kan også øke aktiviteten til SOD i hjerte- og levervev, og redusere innholdet av lipofuscin og MDA i hvert vev betydelig, effektivt rense ulike reaktive oksygenradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) og beskytte mot DNA-skader forårsaket av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en sterk renseevne for frie radikaler, en høyere reduserende evne enn vitamin C, forbedrer aktiviteten til SOD i sædsuspensjon, reduserer innholdet av MDA og har en viss beskyttende effekt på sædmembranfunksjonen. Cistanche-polysakkarider kan øke aktiviteten til SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevev hos eksperimentelt senescent mus forårsaket av D-galaktose, samt redusere innholdet av MDA og kollagen i lunge og plasma, og øke innholdet av elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlenger hypoksitiden hos eldre mus, forbedrer aktiviteten til SOD i serum og forsinker den fysiologiske degenerasjonen av lunge hos eksperimentelt eldre mus. Med cellulær morfologisk degenerasjon har eksperimenter vist at Cistanche har den gode antioksidantevnen og har potensial til å være et medikament for å forebygge og behandle aldringssykdommer. Samtidig har echinacoside i Cistanche en betydelig evne til å rense DPPH-frie radikaler og har evnen til å rense reaktive oksygenarter og forhindre frie radikal-indusert kollagen-nedbrytning, og har også en god reparasjonseffekt på anionskader av tymin frie radikaler.

Klikk på Cistanche Tubulosa Supplement

【For mer informasjon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

På dette feltet fortsetter væskekromatografi kombinert med massespektrometri å stå som et kraftig analytisk verktøy for rask analyse av disse forbindelsene, selv om det er noen nyanser når man sammenligner med landfenoler. Dette emnet fremmer funnene gjort de siste årene angående metoder brukt for å skille og identifisere PT-er fra Fucales.

5.1. Spektrofotometrisk kvantifisering av florotanniner

Spektrofotometriske metoder for kvantifisering av PT-er tilbyr en rask og enkel tilnærming til å vurdere PT-innhold i en gitt prøve eller ekstrakt. Som fenoliske forbindelser forblir Folin-Denis eller Folin-Ciocalteu (FC) metoder levedyktige tilnærminger for å overvåke totalt PT-innhold. Begge metodene er basert på den velkjente kjemisk-fenol-medierte reduksjonen av et fosfowolfram-fosfomolybdisk reagens (FC-reagens) som danner en blå farge med et absorpsjonsspektrum ved ca. 760 nm [74]. Men selv om PT-er er de viktigste fenoliske forbindelsene som er tilstede i brun tang, er flere andre ikke-phlorotannin-fenoliske forbindelser også til stede [75]. Dessuten mangler dette reagenset følsomhet siden det ikke bare reagerer med fenoler, men også med eventuelle reduserende stoffer (f.eks. sukker, proteiner, vitaminer, tioler og uorganiske ioner) i prøven, og måler derved dens totale reduserende kapasitet [76] . Derfor, når fokuset er PT-ene, er dette kanskje ikke den mest passende tilnærmingen, da disse uspesifikke reaksjonene kan føre til falske avlesninger og feilaktige estimater. En mer spesifikk metode er utviklet av Stern et al. [77] ved å bruke 2,4- dimetoksybenzaldehyd (DMBA) for å reagere spesifikt på 1,3- og 1,3,5-substituerte fenoler, slik som floroglucinol og PT-er, og danne trifenylmetanpigmenter som kan overvåkes i området 510 nm. Imidlertid avhenger denne reaksjonen av forbindelsenes forgreningsgrad eller tilstedeværelsen av ytterligere hydroksylgrupper, slik som halo. Fordi reaksjonen med DMBA må skje mellom hydroksylgruppene gjennom de to, fire eller seks posisjonene, vil substituering av disse posisjonene hindre kromofordannelse, noe som til slutt resulterer i undervurderinger.

Selv om disse metodene anses som nyttige for en rask og foreløpig estimering av PT-innhold i en rekke prøver, er den største ulempen deres manglende evne til nøyaktig å kvantifisere og identifisere individuelle forbindelser, noe som gjør det nødvendig å vende seg til mer sofistikerte og kraftige separasjons- og analytiske teknikker for å muliggjøre riktig belysning av de strukturelle egenskapene til PT-er.

5.2. Metoder for separasjon og identifikasjon av florotanniner

5.2.1. HPLC-DAD

På grunn av deres strukturelle likhet og kompleksitet, er PTs analyse og identifisering av individuelle forbindelser fortsatt en ganske utfordrende oppgave. Et av hovedproblemene i PT-analyse er deres kromatografiske separasjon. De nære likhetene til sammensatte strukturer og muligheten for å danne flere isomerer gjør det vanskelig å oppnå en riktig separasjon av individuelle PT-er ved bruk av HPLC, og til og med i dens oppgraderte variant, UHPLC. På dette feltet er litteraturen delt inn i to hovedtilnærminger: omvendt og normalfasekromatografi. På den ene siden, selv om omvendt kromatografi er nyttig for å separere forbindelser med en lignende struktur i komplekse prøver, gir den høye polare naturen til PT-er dem en spesiell affinitet med den mobile fasen, noe som resulterer i veldig raske elueringer og danner de typiske, dårlig oppløste "puklene " [78]. Denne teknikken har imidlertid blitt mye brukt for analyse av PT-er av flere Fucales, inkludert flere arter fra slekten Fucus (F. vesiculosus, F. Aguirre, F. serratus og F. spiralis), Cystoseira (C. nodi caulis) , C. tamariscifolia og C. usneoides), A. nodosum og B. bifurcate, blant andre; og selv om det vanligvis ikke tillater å skille forbindelser lengre enn 8–10 enheter, har det vært veldig nyttig for å oppnå verdifull innsikt angående den lave polymerisasjonsgraden til PTs profil av disse tangene [16,47,48,50,79]. På den andre siden innebærer normalfasen bruk av en polar-stasjonær fase som bedre beholder disse høypolare forbindelsene. Bruken av denne teknikken for PT-separasjon og -isolering var hyppigere tidligere, med forfattere som brukte pre-acetylering av forbindelsene. Ved å bruke denne teknikken var Glombitza og hans medarbeidere i stand til å isolere og karakterisere flere PT-er fra slektene Cystophora, Sargassum og Carpophyllum [80–83], og til og med identifisere halogenerte PT-er i Carpophyllum angustifolium [84] og i forskjellige arter fra slekten, Cystophora [85,86]. Nylig har Koivikko et al. [87] utviklet en NP-HPLC-metode egnet for å separere F. vesiculosus PT-er i henhold til deres polymerisasjonsgrad, uten å kreve et tidligere acetyleringstrinn, og i stand til å produsere et kromatogram med forbedrede retensjonstider og toppdefinisjon, sammenlignet med RP-HPLC. Denne teknikken har også blitt brukt for analyse av PT-metabolitter i urinprøver av A. nodosum-administrerte frivillige [88]. Hovedproblemet med NP-HPLC er at høyere PT-er med et høyere antall hydroksygrupper etablerer sterke interaksjoner med polare stasjonære faser, noe som gjør dem svært vanskelige å eluere. Dessuten kan grensesnitt mellom typiske NP-løsningsmidler med ESI være utfordrende på grunn av redusert følsomhet forårsaket av dårlig ioniseringseffektivitet i 100 prosent ikke-polare løsningsmidler [78].

Alternative metoder har nylig blitt utforsket for å overvinne disse problemene. Dette er tilfellet med hydrofil interaksjonsvæskekromatografi (HILIC), betraktet som en variasjon av normalfase væskekromatografi, og er preget av kombinasjonen av hydrofile stasjonære faser med omvendt fase-lave vandige elueringsmidler, noe som fremmer dannelsen av to lag i den mobile fase, det vil si at det dannes et vannrikt lag på overflaten av den polar-stasjonære fasen og et annet organisk-rikt lag dannes på toppen av det (Figur 3), og skaper et væske-/væskeekstraksjonslignende system inne i kolonnen [89 ]. I denne kromatografiske modusen blir analyttene fordelt mellom disse to lagene og eluert i henhold til fordelingslikevektsskiftene som skjer mellom disse to fasene, selv om andre interaksjoner, som dipol-dipol, hydrogenbinding og elektrostatiske krefter også spiller en viktig rolle [90 ].

Disse egenskapene gjør HILIC-kolonner til de mest passende for å separere PT-er, noe som lar dem etablere sterke interaksjoner med den polar-stasjonære fasen, og dermed øke retensjonstidene og separasjonen. Denne teknikken har blitt brukt for å skille PT-er fra ekstrakter av forskjellige Fucales, nemlig F. vesiculosus, F. spiralis, A. nodosum, S. longicorns og P. canaliculata, noe som gjør det mulig å separere og oppdage forbindelser med polymerisasjonsgrader som varierte fra 3 til 49 enheter [78], som er langt utenfor rekkevidden rapportert av Tierney et al. [45], som utførte en lignende studie ved bruk av RP-kolonne for profilering av F. spiralis, A. nodosum og P. canaliculata, og bare klarte å oppnå påvisning av forbindelser med DP-er på opptil 16 enheter [45].

Nylig har 2D LC-teknikker (figur 4) blitt brukt med hell for å vurdere komplekse blandinger av PT-er i tangekstrakter, og oppnå betydelig forbedrede separasjoner. I denne tilnærmingen injiseres prøver i et apparat som inneholder to separerende kolonner koblet sekvensielt slik at eluenten som kommer ut fra den første kolonnen overføres til den andre kolonnen, som kjører under forskjellige forhold. Vanligvis har den andre kolonnen en skillemekanisme som komplementerer den første kolonnen, slik at de dårlig oppløste toppene fra den første kolonnen kan separeres riktig i den andre [91]. I det spesielle tilfellet med PT-er beskriver de hyppigst rapporterte oppsettene kombinasjonen av HILIC-kolonner (første dimensjon) for å separere forbindelsene i henhold til deres polymerisasjonsgrader, med RP-kolonner (andre dimensjon), som tillater separasjon i henhold til deres hydrofobitet. Ved å bruke denne teknikken, Montero et al. klarte å separere og oppdage over 50 forbindelser i arten, Cystoseria abies-marina [4], og mer enn 70 forbindelser i Sargassum muticum [92]. Tabell 2 samler de forskjellige kromatografiske konfigurasjonene og forholdene som har blitt brukt gjennom tiden for separasjon og deteksjon av PT-er i Fucales.

Naturligvis, uavhengig av kolonnene som brukes, krever U/HPLC alltid kobling til et deteksjonssystem for å overvåke forbindelsene når de eluerer. UV-Vis-detektorer, spesielt photodiode arrays (PDA-er), er uten tvil de vanligste detektorene som bindes med HPLC siden mange naturlige forbindelser av interesse absorberer i UV-Vis-regionen (fra 190–600 nm) [93]. Spesielt fenoler viser vanligvis sterke absorbanser rundt 270–280 nm, og PT-er er intet unntak, siden deres absorbansmaksima er nær 270 nm [94]. Identifikasjon av forbindelser ved bruk av HPLC-PDA kan oppnås ved å sammenligne UV-spekteret og retensjonstiden for en gitt forbindelse med dens kommersielle standard. Dessuten er denne teknikken svært nyttig for å bestemme innholdet av individuelle forbindelser i komplekse prøver, da konsentrasjonen av slike forbindelser, utgitt som absorbans, kan måles kvantitativt ved å bruke Beers lov [95]. Imidlertid er bruken av denne tilnærmingen for å identifisere og kvantifisere PT-er svært begrenset siden det bare er et lite antall kommersielle standarder tilgjengelig for dette formålet. Derfor krever identifisering av PT-er vanligvis kraftigere teknikker, som massespektrometri (MS) eller kjernemagnetisk resonans (NMR).

5.2.2. Massespektrometri

Bruken av MS direkte koblet til U/HPLC-instrumenter har revolusjonert karakteriseringen av komplekse ekstrakter, og gir høy følsomhet og forbedrer analytisk kapasitet på relativt kort tid. Av den grunn har denne teknikken blitt en stabil praksis for karakterisering og identifisering av fenoliske forbindelser generelt, inkludert PT-er. Tandem MS eller MS/MS tillater påvisning av masse-til-ladning-forholdet (m/z) av forbindelsenes pseudomolekylære ioner (vanligvis generert via elektrosprayionisering) når de eluerer fra kolonnen, og oppnår videre deres respektive fragmentering mønstre via kollisjonsindusert dissosiasjon (CID) [118]. Dette er et avgjørende trinn i tildelingen av PT-er fordi de dannede fragmentene kan gi viktig informasjon om de strukturelle egenskapene til det overordnede ionet som oppsto dem. Vanligvis presenterer nesten hver PT en basetopp ved MS2 som tilsvarer tapet av en eller to vanndeler [46]. På samme måte er tap av 126 Da et vanlig trekk ved disse forbindelsene siden dette tilsvarer floroglucinol-delen, som er byggesteinen til PT-er [119]. Utseendet til visse nøytrale tap til skade for andre er viktig for å forstå typen koblinger som er etablert mellom floroglucinolenheter. For eksempel, hvis vi antar at C−C-bindinger vanligvis krever høyere energi for å bryte enn C−O−C-bindinger, vil fukoler, floretoler og fukofloretoler med samme grad av polymerisering vise samme molekylvekt, men til slutt produsere forskjellige fragmenteringsmønstre. I floretoler kan fragmentering forekomme på hver side av eterbindingen, og generere nøytrale tap på 126, 142 eller 110 Da (Figur 5A), tilsvarende floroglucinol, tetrahydroksybenzen eller resorcinol, så vel som deres kombinasjon med ytterligere floroglucinol eller vann enheter. I motsetning til dette kan brudd på CC-bindinger som er karakteristiske i drivstoff bare gi opphav til nøytraltap på 126 Da (floroglucinol), og fordi disse bindingene krever høyere energi for å brytes, gir drivstoff også ofte nøytrale tap på 14, 28, 44 og 84 Da (Figur 5B), så vel som deres kombinasjoner med ytterligere floroglucinol- eller vanngrupper, som indikerer kryssring-spalting. Forbindelser som viser begge typer spaltninger er mest sannsynlig fukofloretoler (Figur 5A, B) [48]. Fuhaloler er derimot litt lettere å skille siden disse forbindelsene har et kloretyllignende arrangement som inneholder minst en ekstra hydroksylgruppe. Derfor presenterer det pseudomolekylære ionet til en hall med en gitt polymerisasjonsgrad alltid en m/z 16 Da høyere sammenlignet med dens floretinekvivalent (figur 5C). Dessuten presenterer MS/MS-spektrene til disse forbindelsene ofte flere produktioner og/eller nøytrale tap tilsvarende tetrahydroksybenzen og dets kombinasjon med floroglucinol (f.eks. [MH]- ved m/z 265, 389, 513, og så videre) [92].

【For mer informasjon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】