DEL 1 Acteosid undertrykker RANKL-mediert osteoklastogenese ved å hemme C-Fos-induksjon og NF-KB-vei og dempe ROS-produksjon

Seung-Youp Lee^1,2., Keun-Soo Lee^3.¤, Sea Hyun Yi^2., Sung-Ho Kook², Jeong-Chae Lee^2,3*

1 Research Institute of Clinical Medicine ved Chonbuk National University, Biomedical Research Institute of Chonbuk National University Hospital, Jeonju, Chonbuk, Sør-Korea, 2 Department of Orthodontics, Institute of Oral Biosciences and School of Dentistry, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, South Korea, 3 Department of Bioactive Material Sciences, Research Center of Bioactive Materials, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Sør-Korea

Abstrakt

Tallrike studier har rapportert at inflammatoriske cytokiner er viktige mediatorer for osteoklastogenese, og derved forårsaker overdreven benresorpsjon og osteoporose.Akteosid, den viktigste aktive forbindelsen avRehmannia glutinosa, som brukes mye i tradisjonell orientalsk medisin, har antiinflammatoriske og antioksidantpotensialer. I denne studien fant vi detakteosidmarkant hemmet osteoklastdifferensiering og dannelse fra benmargsmakrofager (BMM) og RAW264.7 makrofager stimulert av reseptoraktivatoren til nukleær faktor-kappaB (NF-kB) ligand (RANKL). Acteosid-forbehandling forhindret også benresorpsjon av modne osteoklaster på en doseavhengig måte.Akteosid(10 mM) svekket RANKL-stimulert aktivering av p38-kinase, ekstracellulære signalregulerte kinaser og c-Jun N-terminal kinase, og undertrykte også NF-kB-aktivering ved å hemme fosforylering av p65-underenheten og inhibitoren kBa. I tillegg RANKL-mediert økning i ekspresjonen av c-Fos og nukleær faktor av aktiverte T-celler, cytoplasmatisk 1 (NFATc1), og i produksjonen av tumornekrosefaktor-a, interleukin (IL)-1b , og IL-6 ble tilsynelatende hemmet av akteosid-forbehandling. Videre muntligakteosidredusert ovariektomi-indusert bentap og inflammatorisk cytokinproduksjon for å kontrollere nivåene. Våre data tyder på detakteosidhemmer osteoklastdifferensiering og modning fra osteoklastiske forløpere ved å undertrykke RANKL-indusert aktivering av mitogenaktiverte proteinkinaser og transkripsjonsfaktorer som NF-kB, c-Fos og NFATc1. Samlet tyder disse resultatene på detakteosidkan fungere som et anti-resorptivt middel for å redusere bentap ved å blokkere osteoklastaktivering.

For mer informasjon vennligst kontakt:emily.li@wecistanche.com

Introduksjon

Bein omdannes konstant ved balansert osteoklast- og osteoblastaktivitet [1]. Osteoklaster oppstår fra hematopoietiske forløperceller fra monocytt/makrofag-linjen, mens osteoblaster er av mesenkymal-linjen [2]. Abnormalosteoklastaktivering eller redusert osteoblastogenese kan forstyrre benhomeostase, og til slutt forårsake sykdommer som osteoporose, leddgikt og beinkreft [3,4]. Osteoporose er en vanlig skjelettsykdom som fører til økt risiko for brudd. Den vanligste formen for osteoporose er forårsaket av østrogenmangel hos kvinner i overgangsalderen. Medisiner som kortikosteroider og antiepileptika kan også forårsake ubalanse mellom benresorpsjon og bendannelse, noe som kan resultere i osteoporose [5]. Mange anti-resorptive inhibitorer inkludert bisfosfonater, kalsitonin, østrogen og selektive østrogenreseptormodulatorer har blitt brukt til å behandle osteoporose. Disse inhibitorene opprettholder benmassen ved å hemme osteoklastfunksjonen [6]. Østrogenerstatningsterapi er den mest populære behandlingen for å forebygge og behandle postmenopausal osteoporose. Imidlertid kan langvarig østrogenerstatningsterapi øke risikoen for endometrie- og brystkreft. Derfor har mange etterforskere fokusert sin innsats på å utvikle et nytt anti-resorptivt middel som ikke har bivirkninger [7–10]. Fordi osteoklaster fungerer i benresorpsjon, har spesifikt hemmende osteoklaster blitt ansett som hovedmålet i en rekke studier. Osteoklaster er multinukleære gigantiske celler dannet av mononukleære stamceller fra monocytt/makrofagefamilien via sekvensiell proliferasjon, differensiering og fusjon av hematopoietiske forløperceller [11]. Makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og reseptoraktivator for nukleær faktor (NF)-kB (RANK)ligand (RANKL) er essensielle faktorer for osteoklastdifferensiering[12]. I tillegg bidrar flere inflammatoriske cytokiner, som tumornekrosefaktor (TNF) og interleukin (IL)-1b, til osteoklastogenese ved å modulere induksjonen av RANKL, osteoprotegerin og M-CSF [7,13]. RANKL-binding til celleoverflate-RANK-reseptoren resulterer i RANKL/RANK/TNFR

assosierte faktorer (TRAF) komplekser som sekvensielt aktiverer NFkB og mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK), inkludert cJun N-terminal kinase (JNK), p38 kinase og ekstracellulær signalrelatert kinase (ERK) [14]. Denne aktiveringen spiller en nøkkelrolle i å mediere osteoklastdifferensiering, aktivering og overlevelse.RANKL aktiverer også ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer som nukleær faktor av aktiverte T-celler, cytoplasmatisk 1 (NFATc1) og-Fos, som er essensielle for osteoklastutvikling [ 7,9]. Derfor regnes RANKL-signalering som hovedmålet for antiresorptive midler som undertrykker osteoklastaktivering og er benfrie.Akteosider den viktigste aktive forbindelsen til Rehmannia glutinosa, som brukes mye i tradisjonell orientalsk medisin [15,16].Akteosider en sterk antioksidant og har antihepatotoksiske, antiinflammatoriske og antinociseptive aktiviteter [17–20]. Det fant vi tidligereakteosidreduserer tyrosinaseaktivitet og melaninbiosyntese ved å regulere ERK-signalering [21], beskytter mot reaktive oksygenarter (ROS)-mediert gingivalskade [22], og undertrykker mykotoksin-mediert celleskade [23]. Disse effektene er nært knyttet tilakteosidsin evne til å fjerne ROS og regulere MAPK-mediert signalering. Spesielt er ROS foreslått for å formidle RANKL-induserte signalveier og cellulære hendelser i osteoklaster. Forbehandling med antioksidanter hemmet RANKL-indusert aktivering av NF-kB, ERK og IkBa, og undertrykte derved osteoklastogenese [24]. Disse funnene tydet sterkt på at i tillegg til anti-inflammatorisk aktivitet, og antioksidantaktivitet er avgjørende for et anti-resorptivt middel, dermedakteosidkan undertrykke RANKL-indusert osteoklastogenese. I denne studien undersøkte vi omakteosidhar en terapeutisk effekt på bentap. Vi undersøkte effektene avakteosidpå osteoklastdifferensiering og benresorpsjon og de relaterte cellulære mekanismene ved bruk av in vitro og in vivo eksperimentelle systemer.

akteosid

Materialer og metoder

Etikkerklæring

Dyrepleie og brukspraksis ble godkjent av Chonbuk National University Committee on Ethics in the Care and Use of Laboratory Animals (tillatelsesnr. CBU 2010-0007). Alle eksperimenter i denne studien ble utført i henhold til retningslinjene fra dyrepleie- og brukskomiteen ved universitetet.

Mus, kjemikalier og laboratorievarer

Fire uker gamle ICR-hunnmus ble kjøpt fra OrientBio Inc. (Seoul, Korea) og holdt ved 2261uC og 5565 prosent fuktighet i en 12 timers lys/mørke-syklus med fri tilgang til mat og vann. Akteosid (3,4-dihydroksy-b-fenetyl-Oa-rhamnopyranose syl-(1R3)-4-O-kaffeoyl-bD-glukopyranosid; C29H36O15) (Fig. S1) ble isolert fra bladene til Rehmannia glutinosa. Acteosid ble oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS) før bruk. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 og M-CSF ble kjøpt fra FoU-systemer (Minneapolis, MN, USA). Antistoffer spesifikke for c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa og b-actin ble hentet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Antistoffer for p-p38 og p38 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). CalciumAssay og Osteocalcin (OC) EIA-sett ble kjøpt fra henholdsvis BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) og Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), for å bestemme biokjemiske serumparametere. Muse-tartrat-resistent sur fosfatase (TRAP) analysesett (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) ble også brukt for å måle TRAP5b-nivået i serum. Med mindre annet er spesifisert, ble ytterligere kjemikalier hentet fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), og laboratorievarer var fra SPL Life Sciences (Pochun, Sør-Korea).

Cellekulturer

Benmargsceller ble hentet fra tibiae og femora av 6 uker gamle hunn-ICR-mus i henhold til metoder beskrevet tidligere [25]. Benmargssuspensjonen ble inkubert i en 100-mm kulturskål i nærvær av 50 ng/ml M-CSF. Etter 3 dager ble adherente celler brukt som benmargsmakrofager (BMM) for å indusere osteoklastisk differensiering. Noen benmargsceller ble også inkubert i 48 timer uten M-CSF, og adherente celler ble dyrket i et osteoblastdifferensieringsmedium, som beskrevet andre steder [25]. RAW264.7 makrofagceller ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L glutamin og antibiotika. Disse cellene ble brukt som en motpartscellelinje for BMMer for å utforske effekten av acteosid på osteoklastogenese.

Osteoklastisk differensiering og TRAP-farging

BMM-er ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner (0–50 mM) av akteosid i 2 timer før stimulering med 100 ng/ml RANKL. Kulturmedier ble erstattet med ferske medier på dag 2 og 5. Etter 7 dagers inkubering ble kulturene fiksert i 4 prosent PBS-bufret paraformaldehyd og farget med TRAP ved bruk av et sigma Aldrich-sett i henhold til produsentens instruksjoner. TRAP-positive celler ble talt ved hjelp av optisk mikroskopi, og celler som inneholdt 3 eller flere kjerner ble ansett for å være osteoklaster.RAW 264.7-celler ble også eksponert for 100 ng/ml RANKL etter forbehandling med acteosid i 2 timer, og etter 7 dagers inkubasjon, cellene ble behandlet for TRAP-farging.

Måling av cellelevedyktighet

Cellelevedyktighet ble bestemt ved å bruke et vannløselig tetrazoliumsalt (WST)-8-reagens. Kort fortalt ble BMM-er eller RAW264.7-celler dyrket i et vekstmedium inneholdende 10 prosent FBS og antibiotika behandlet med 10 mM akteosid eller fenoliske forbindelser som quercetin, luteolin, apigenin eller epigallocatechin-3-gallat (EGCG). WST-8-reagens ble tilsatt i kulturene etter 48 timers inkubering. Etter inkubering i ytterligere 4 timer ble den WST{10}}spesifikke absorbansen målt ved 450 nm ved bruk av en mikroplateleser (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Benresorpsjonsanalyse

BMM-er (16105 celler/ml) ble suspendert i a-MEM inneholdende 50 ng/ml M-CSF og 100 ng/ml RANKL, deretter delt over en 24-brønnplate belagt med kalsiumfosfat-nanokrystaller (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Sør-Korea) ved en tetthet på 26104 celler/cm2 med og uten akteosid. Etter inkubering i 7 dager ble cellene fjernet fra platene med 5% natriumhypokloritt, og gropdannelse ble observert under et optisk mikroskop. Det resorberte området ble også målt med en bildeanalysator og uttrykt som en prosentandel av kontrollverdien.

Western blot-analyse

Hele proteinlysater ble fremstilt i en lyseringsbuffer som beskrevet andre steder [26]. Cytosoliske og nukleære proteiner ble fremstilt som beskrevet tidligere [25]. Like mengder proteinekstrakt ble separert med 12–15 prosent SDS-PAGE og blottet på polyvinyldifluoridmembraner. Blottene ble probet med primære antistoffer over natten ved 4uC før inkubering med sekundært antistoff i blokkeringsbuffer i 1 time. Blottene ble utviklet med forbedret kjemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) og eksponert for røntgenfilm (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

MAPK aktivitetsanalyse

Celler ble forbehandlet med akteosid i 2 timer og deretter stimulert med RANKL i ytterligere -30 min. MAPK-aktiviteter ble bestemt ved bruk av immunometriske analysesett, slik som p-p38kinase-analysesettet (Assay Designs, Inc., MI, USA), p-ERK enzymanalysesett (Assay Designs) og p-SAPK/JNK sandwich ELISA-sett ( Cell Signaling Technology, MA, USA). Alle prosedyrer fulgte produsentens instruksjoner, og absorbansen ble målt med en mikroplateleser.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

DNA-proteinbindingsreaksjoner ble utført i 30 minutter ved romtemperatur, med 10–15 mg protein i 20 ml buffer inneholdende 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poly (dI-dC), 5 prosent glyserol ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM for [a-32P] dCTP-merkede oligonukleotider og Klenow-fragmentet av DNA-polymerase. Prøvene ble separert på 6 prosent polyakrylamidgeler, som ble tørket og eksponert for røntgenfilm (Eastman Kodak Co.) i 12–24 timer ved 270uC. Oligonukleotidprimersekvensene spesifikke for NF-var 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 og 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

NF-kB Luciferase-analyse

RAW264.7-makrofager i 24-brønnplater ble transfektert med 0,8 mg kB-luciferase-reportervektor ved bruk av 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. 24 timer etter transfeksjon ble cellene stimulert med RANKL i nærvær og fravær avakteosidi 24 timer. Celler ble resuspendert i 100 ml reporterlyseringsbuffer (Promega, Madison, WI, USA). Like mengder proteinprøver ble plassert i 96-brønnmikroplater og blandet med luciferasesubstrat. Luminescens ble målt ved å bruke et mikroplate-luminometer (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland). I dette eksperimentet ble et permeabelt NF-B-hemmerpeptid (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) brukt som en positiv kB-hemmer.

Måling av cytokiner

BMM-er eller RAW264.7-celler ble stimulert med RANKL i nærvær av akteosid i 24-brønnkulturplater. Etter 48 timers inkubering ble kultursupernatanter samlet og vurdert ved ELISA ved bruk av TNF-a-, IL-1b- og IL-6-spesifikke OptEIATM-sett i henhold til produsentens instruksjoner.

Sanntids revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)

mRNA-ekspresjonen av osteoklastiske markører, som c-Fos, NFATc1 og TNF-a, ble bestemt ved sanntids RT-PCR. Kort fortalt ble totalt RNA ekstrahert fra makrofager med Trizolreagens i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). cDNA ble syntetisert med 1 mg totalt RNA ved bruk av SuperScriptReverse Transcriptase II og primere (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ble brukt til å oppdage akkumulering av PCR-produkt under sykling med ABI 7500 sekvensdeteksjonssystemet (AppliedBiosystems). Etter denaturering ved 95uC i 10 minutter var PCR

Måling av intracellulær ROS

En stamløsning av 29,79-diklordihydrofluorescein-diacetat(DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Tyskland) ble fremstilt i DMSO og lagret ved 220uC i mørket. Kort fortalt ble BMM-er (106 celler/ml i 6-brønnplater) dyrket med 50 ng/MLM-CSF i 24 timer og deretter behandlet med ulike konsentrasjoner (0–10 mM) av akteosid 2 timer før stimulering med 100 ng/mlRANKL. Etter 1 time med co-inkubering ble disse cellene deretter inkubert med 25 mM DCFH-DA i 30 minutter. Den grønne fluorescensen til 29,79-diklorfluorescein (DCF) ble registrert ved 515 nm (FL 1) ved bruk av et FACS VantageH-system (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), og 10,000 hendelser ble telt per prøve.

Induksjon av ovariektomi-indusert osteoporose

ICR-hunnmus (6 uker gamle) ble brukt til denne studien. Mus fikk en falsk operasjon (Sham, n=10) eller kirurgisk ovariektomisert (OVX, n=20) under anestesi. En uke etter operasjonen ble OVX-musene tilfeldig delt inn i 2 grupper på 10 mus hver: bilateral OVX og bilateral OVX supplert med 200 ml PBS inneholdende 1 mM acteosid oralt (AC-gruppe). Muntligakteosidble administrert en gang hver tredje dag i 8 uker etter operasjonen, og samme mengde PBS ble administrert til Sham- og OVX-gruppene. Etter 1 dag etter siste administrering ble mus avlivet og deretter ble biokjemiske parametere i serum og 3-dimensjonal benstruktur analysert.

Bestemmelse av serum biokjemiske parametere

Blodprøver ble tatt via hjertepunktur og serum ble samlet ved sentrifugering. Serumprøver ble lagret ved 280uC for analyser av biokjemiske parametere. Serumnivåene av IL-1b og IL-6 ble estimert ved å bruke ELISA-settet som beskrevet ovenfor, mens alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet ble bestemt ved å bruke en biokjemisk kolorimetrisk analyse som måler mengden p -nitrofenol produsert fra et p-nitrofenolfosfatsubstrat, som beskrevet andre steder [27]. For å estimere biomarkørene for bendannelse og resorpsjon, ble serum-OC, kalsium og TRAP5b-nivåer også bestemt i henhold til produsentens instruksjoner.

Analyser av beinstruktur og morfometriske parametere

Lårbenet til mus (Sham-, OVX- og AC-grupper) ble dissekert og fylt med fysiologisk saltvann for mekanisk testing. Den mekaniske styrken til lårbenet ble målt som beskrevet andre steder [28]. Bruddbelastningen ble registrert som toppkraften i newton på det punktet som midtskaftet til høyre lårbensbrudd. I tillegg ble det lette lårbenet til hvert dyr histomorfometrisk analysert ved bruk av et mikrodatamattomografi (micro-CT) system (SkyScan 1076 mikrofokus røntgensystem, Kontich, Belgia). Kort fortalt ble beinene i 4 prosent formaldehydlagring tørket overfladisk på papirvev før de ble pakket inn i plast-''klamefilm'' eller i parafilm, for å forhindre tørking under skanning. Hvert plastinnpakket bein ble plassert i plast/polystyrenskumrør som ble montert vertikalt horisontalt i 1076 skannerprøvekammeret for mikro-CT-avbildning. Skanning ble utført ved bruk av 100 kV kildespenning og 140 mA kildestrøm med 35 mm oppløsning. Tredimensjonale modeller av de trabekulære beinene i lårbenet ble rekonstruert ved bruk av SkyScan CT Analyzer versjon 1.11. De strukturelle parameterne som trabekulær benmineraltetthet (BMD, g/cm3), prosent benvolum (benvolum (BV)/vevsvolum (TV), prosent ), tykkelse (Tb.Th, mm), separasjon (Tb.Sp) , mm), og antall (Tb.N, 1/mm) ble deretter målt.

Osteogen differensiering og mineraliseringsanalyse

Benmargsceller dyrket i {{{{10}}}}brønnkulturplater ble behandlet med DAG (10 nM deksametason, 50 mM askorbinsyre og 20 mM b-glyserofosfat) i nærvær av 10 mM akteosid. Etter 2 uker med differensiering ble cellene fiksert med iskald 70 prosent (vol/vol) etanol i 1 time og farget med 0,2 prosent alizarin rød Sin destillert vann i 30 minutter ved romtemperatur. Etter at cellene var avfarget og lufttørket, ble cellekulturplatene evaluert ved lysmikroskopi ved bruk av et invertert mikroskop (Nikon TS100, Japan). For å kvantifisere mengden rødt fargestoff ble flekken eluert med 10 prosent acetylpyridiniumklorid ved risting i 20 minutter og absorbansen ble målt ved 560 nm. Mengden kalsium avsatt i cellelagene ble også målt ved bruk av et kalsiumsett (Wako Chemical Inc. Osaka, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. I tillegg ble ekspresjonen av beinspesifikke mRNA-markører, slik som run-relatert transkripsjonsfaktor -2(Runx2), osterix, bensialoprotein (BSP) og OC bestemt ved sanntids RT-PCR. Oligonukleotidprimere av disse markørene ble designet med produktstørrelser mindre enn 200 bp ved bruk av PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) som beskrevet andre steder[27].

Statistisk analyse

Med mindre annet er angitt, er alle data uttrykt som gjennomsnitt 6 standardavvik (SD) for 3 eller flere uavhengige eksperimenter. En enveis ANOVA ble brukt for flere sammenligninger med SPSS versjon 12.0-programvare. En p-verdi ,0.05 ble ansett som statistisk signifikant.

Resultater

Acteosid hemmer osteoklastdannelse av makrofager på en doseavhengig måte

For å verifisere effekten av akteosid på BMM-differensiering til osteoklaster, ble cellene dyrket med forskjellige konsentrasjoner (0–20 mM) av akteosid i 7 dager i nærvær av 50 ng/ml M CSF og 100 ng/ml RANKL . Akteosid reduserte antall osteoklaster på en doseavhengig måte. Når cellene ble forbehandlet med 10 mM acteosid i 2 timer, sank osteoklasttallet med 43 prosent sammenlignet med celler supplert med M-CSF og RANKL (fig. 1A). Fig. 1B viser den RANKL-medierte osteoklastdifferensieringen og dens inhibering ved kombinert behandling med acteosid. I samsvar med dette resultatet reduserte akteosid-forbehandling den RANKL-stimulerte differensieringen av RAW264.7-celler og osteoklastdannelse (fig. 1C og D). Når det anti-osteoklastiske potensialet til akteosid på BMM-er ble sammenlignet med anti-osteoklastpotensialet til flere fenoliske forbindelser ved samme konsentrasjon (10 mM), viste luteolin den høyeste aktiviteten (fig. 2A). Imidlertid reduserte luteolin, quercetin eller apigenin i seg selv levedyktigheten til cellene (fig. 2B). Alle forbindelsene hemmet osteoklastisk differensiering av RAW264.7 makrofager med følgende relative aktiviteter: luteolin. quercetin=apigenin .EGCG=akteosid (fig. 2C). Luteolin, quercetin eller apigenin i seg selv viste også den reduserte levedyktigheten til cellene (fig. 2D). I motsetning til dette forårsaket behandling med quercetin bare en signifikant reduksjon av levedyktigheten i både BMM-er og RAW264.7-celler, når disse cellene ble eksponert for 10 mM av hver forbindelse i 2 dager med 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, eller begge (data ikke vist). Når konsentrasjonen av disse forbindelsene er nødvendig for å hemme 50 prosent av

osteoklastdannelse i BMMer (IC50) ble beregnet ved bruk av konsentrasjon-aktivitetskurver, IC50 for acteosid, quercetin, luteolin, apigenin og EGCG var henholdsvis 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 og 6,6 mM (fig. 2E). Dette resultatet var likt tilfellet at RAW264.7 makrofager ble undersøkt. Disse dataene antydet at luteolin og quercetin hadde anti-klastogene aktiviteter høyere enn akteosid. I motsetning til dette hadde quercetin ved IC50 også en mild toksisk effekt på cellene (data ikke vist).

AkteosidHemmer beinresorpsjon av makrofagerActeosid forhindret også RANKL-mediert benresorpsjon på en doseavhengig måte, målt med et in vitro modellsystem (fig. 3A). Benresorpsjon ble signifikant hemmet når BMM ble inkubert med 1 mM akteosid (fig. 3B). En 10 mM akteosidbehandling svekket nesten fullstendig RANKL-indusert gropdannelse av BMMer. Tilsvarende reduserte akteosid benresorpsjon i RANKL-stimulerte RAW264.7-celler (fig. S2A og B). Evnen tilakteosidå hemme benresorpsjon var avhengig av tidspunktet for behandlingen i forhold til RANKL-stimulering. Acteosid (10 mM) tilsatt 4 dager etter RANKL-stimulering reduserte ikke gropdannelse i BMM, mens det undertrykte antall dannede osteoklaster (fig. 3C). Dette forskjellige resultatet var delvis på grunn av gropen området allerede dannet etter 4 dager med RANKL stimulering formasjon (fig. 3D).

AkteosidNedregulerer tidlige RANKL-signalveier

RANKL induserer aktivering av 3 velkjente MAPKer og NF-kB i osteoklastforløpere, og denne aktiveringen er nødvendig for tidlig osteoklastdifferensiering. For å forstå de mulige mekanismene som acteosid hemmer osteoklastogenese, undersøkte vi effekten av acteosid på MAPK-er og NF-B-aktivering i makrofager. BMM-er og RAW264.7-celler ble forbehandlet med 10 mM akteosid i 2 timer og deretter stimulert med 100 ng/ml RANKL i 30 minutter. MAPK-fosforylering ble undersøkt ved Western blotting og immunometrisk analyse. RANKL induserte fosforylering av p38, ERK og JNK i BMM-er (fig. 4A) og RAW264.7-celler (fig. 4B). Acteoside forhindret disse RANKL-induserte økningene i p-p38, p-ERK og p-JNK. Dette resultatet ble støttet av immunometrisk analyse, som forbehandling med 10 mM acteosid signifikant hemmet nivåene av fosforylerte MAPK-er i disse makrofagene (fig. 4C). RANKL-behandling økte DNA-bindingen av NF-kB, mens acteosid hemmet RANKL-indusert aktivering av NF-kB-DNA-binding (fig. 5A). Denne hemmingen var mer fremtredende i BMM enn i RAW264.7-celler. Acteosid reduserte også RANKL-stimulert p65- og IkBa-fosforylering i BMM-er og RAW264.7-celler (fig. 5B og C). Tilsetning av 10 mMacteosid hemmet nesten fullstendig både nedbrytningen og aktiveringen av IkBa i BMMer (fig. 5B). For ytterligere å bekrefte at NF kB-aktivering er involvert i virkningen av acteosid, ble kB-promotor-luciferase-konstruksjoner forbigående transfektert inn i RAW264.7-celler. Cellene inkubert med 100 ng/ml RANKL hadde 3- ganger høyere kB-promoteraktivitet, som ble signifikant svekket av 10 mM akteosid (fig. 5D).

Acteosid undertrykker produksjonen av inflammatoriske cytokiner og uttrykket av TNF-a, c-Fos og NFATc1in RANKL-stimulerte makrofager

TNF-a, IL-1b og IL-6 er viktige i osteoklastdannelse og funksjon, som formidles av NF-kB-signalering i RANKL-stimulerte makrofager. RANKL stimulerte produksjonen av disse cytokinene, og denne produksjonen ble markant redusert med 10 mM akteosid-forbehandling i BMM (fig. 6A). Tilsvarende svekket acteosid den RANKL-induserte produksjonen av cytokiner, bortsett fra IL-6, i RAW264.7 makrofager (fig. S3). For å forstå de molekylære mekanismene for akteosidvirkning i osteoklastogenese, undersøkte vi videre effekten av akteosid på TNF-a, c-Fos og NFATc1-ekspresjon. RANKL oppregulerte mRNA-ekspresjonen av disse faktorene i BMM-er og RAW264.7-celler (fig. 6B og C). Forbehandling med 10 mM akteosid hemmet signifikant det RANKL-induserte uttrykket av disse faktorene i begge

BMM-er og RAW264.7-celler. Acteosid forbehandling reduserte også sterkt proteinnivåene av c-Fos og NFATc1 i RANKL-stimulerte BMMer (fig. 6D). Disse resultatene tyder på detakteosidnedregulerer RANKL-induserende mediatorer av osteoklastdannelse på gen- og proteinnivå.

Acteoside reduserer intracellulær ROS-generering i BMM-er på en doseavhengig måte

Siden det er kjent at intracellulær ROS-produksjon er korrelert med RANKL-stimulert osteoklastogenese, undersøkte vi om acteosid hemmer ROS-produksjon under RANKL-mediert osteoklastdifferensiering ved bruk av et cellegjennomtrengelig, oksidasjonsfølsomt fargestoff, DCFH-DA. Flowcytometrianalyse viste at det gjennomsnittlige fluorescenssignalet spesifikt for DCF i BMM-er tilsynelatende ble høyreforskjøvet etter stimulering med RANKL, sammenlignet med de ubehandlede kontrollcellene (fig. 7A). Dette skiftet var likt tilfellet at RAW264.7-makrofager ble observert etter RANKL-stimulering (data ikke vist). Behandling av BMM med akteosid reduserte signalintensiteten til DCF på en doseavhengig måte. Forbehandling med 10 mM akteosid reduserte nesten fullstendig nivåene av intracellulær ROS produsert under osteoklastdifferensiering til de ubehandlede kontrollnivåene (fig. 7B).

Oral akteosidadministrasjon hemmer endring av osteoporotiske biokjemiske markører og bentap hos ovariektomierte mus

For å utforske effekten av akteosid på bentap, utarbeidet vi en osteoporotisk dyremodell ved ovariektomi. Det var ingen signifikant forskjell i kroppsvekt mellom OVX og Shammice i løpet av forsøksperioden (data ikke vist). Gruppen hadde signifikant høyere serumnivåer av IL-1b og IL-6 enn Sham-gruppen (fig. 8). Ovariektomi-induserte økninger i disse inflammatoriske cytokinene ble dempet ved oral akteosidadministrasjon (AC-gruppe). Serumnivåene av beinomsetningsmarkører som ALP, kalsium, TRAP5b og OC var signifikant økt i OVX-gruppen. Av disse osteoporotiske markørene ble de økte nivåene av kalsium, TRAP5b og OC i OVX-mus tilsynelatende hemmet av akteosidbehandling, mens serumnivået av ALP ikke ble endret av behandlingen. Gjennomsnittlig maksimal bruddbelastning til midten av høyre lårbensskaft var signifikant lavere i OVX-gruppen enn i Sham-gruppen (Fig. 9A). Acteosid-behandling hevet den maksimale bruddsikkerheten til den for Sham-gruppen. Når det kortikale beinet i lårbenet ble dissekert og observert ved optisk mikroskopi, hadde de osteoporotiske trekkene vist i OVX-gruppen nesten fullstendig forsvunnet i AC-mus (fig. 9B). For å verifisere effekten av akteosid på den OVX-induserte osteoporosemodellen, ble BMD og benmorfologiske parametere i trabekulæren til den lette proksimale femur analysert med mikro-CT. Som vist i fig. 9C ble en endring av den femorale trabekulære arkitekturen funnet i OVX-mus, mens denne endringen ble redusert ved behandling med akteosid. Resultatene fra mikro-CT-analysen viste at BMD, et mål på beinstyrke, ble dramatisk redusert i OVX-mus (fig. 9D). Sammenlignet med Sham-gruppen, viste OVX-mus også betydelige endringer i BV/TV, Tb. Sp og Tb. N, men ikke Tb.Th. Oral akteosidbehandling av OVX-mus forhindret signifikant endringen i BMD samt BV/TV og Tb.N.