Del 2 Deteksjon av Cistanches Herba (Rou Cong Rong) legemidler ved bruk av artsspesifikke nukleotidsignaturer

Ved å søke etter nukleotidsignaturene utviklet i denne studien fant vi at 15 av 31 kinesiske patentmedisiner merket som inneholdendeCistanches Herbainneholdt i stedet utroskapsstoffer, inkludert åtte forfalskede ingredienser og syv utroskapsstoffer (tabell 2). For eksempel ble seks batcher erstattet med Cy. songaricum, inkludert tre partier med Shihu Yeguang-piller, ett parti med Kangguzhi Zengsheng-piller, ett parti med Sanbao-kapsler og ett parti med Wenweishu-partikler.

Dessuten ga forskjellige partier fra samme produsent noe forskjellige resultater. For eksempel, blant tre batcher fra én produsent (ZCY16, ZCY69 og ZCY71), besto en batch av en blanding av Ci.deserticolaog Cy. songaricum, en batch besto av en blanding avCi. deserticolaogCi. tubulosaog kun ett parti inneholdtCi. tubulosa. To partier fra en annen produsent (ZCY44 og ZCY70) var også forskjellige: en batch inneholdt Cy. songaricum, mens den andre batchen inneholdtCi. deserticolaogCi. tubulosa.

Cistanches Herbable oppdaget i 23 av de 31 kinesiske patentmedisinene som ble testet (tabell 2), og bare 16 prøver var autentiske, f.eks. uten forfalskning eller forfalskede ingredienser.Ci. tubulosable oppdaget i 16 partier av kinesiske patentmedisiner, og Ci. deserticola ble påvist i 10 batcher. O. coerulescens ble ikke påvist i noen av produktene (tabell 2).

Cistanche deserticola har mange effekter, klikk her for å vite mer

DISKUSJON

Nødvendigheten av å utvikle en ny metode for overvåking av kommersielt tilgjengelige legemidler som inneholderCistancherHerba

Cistanches Herbaer en tonic som er mye brukt i gjenopprettende kinesiske patentmedisiner og andre legemidler. Kvalitetskontrollen av kinesiske patentmedisiner utgjør imidlertid en stor utfordring på grunn av ingrediensenes mangfold og kompleksitet. På grunn av mangelen på regulatorisk tilsyn, er det betydelige muligheter for produktforfalskning eller forfalskning. I tillegg bør alle produkter behandles i samsvar med farmakopé eller andre standarder; forfalskning eller forfalskning er ikke tillatt under behandlingen. Det er derfor etablert varianter av kvalitetskontrollmetoder, som multihjerteskjærende todimensjonal væskekromatografi (Yao et al., 2015), nær-infrarød reflektansspektroskopi (Zhang og Su, 2014; Zhang et al., 2015) ), og væskekromatografi-massespektrometri (Wang et al., 2016b). Imidlertid kan ikke de analytiske kjemimetodene i den kinesiske farmakopékommisjonen (2015) brukes til å autentisere alle ingrediensene i kinesiske patentmedisiner eller for å oppdage tilstedeværelsen av utroskapsingredienser. Studier har dessuten vist at målrettede metabolitter i planter endres under produktbehandling, noe som resulterer i betydelig variasjon i testresultater eller fullstendig feil på testmetoder (Ananingsih et al., 2013). Dermed er molekylære verktøy som artsspesifikke nukleotidsignaturer klar til å forsterke kvalitetskontrollsystemer mot risikoen for uredelig produktsubstitusjon og forfalskning og inkludering av umerkede ingredienser.

Selv om ITS/ITS2 anses som et høyeffektivt verktøy for identifisering av urtemedisiner, kan ikke disse sekvensene amplifiseres fra høyt bearbeidede prøver (Newmaster et al., 2013; de Boer et al., 2015). Wang et al. rapporterte at ITS2 ikke kunne forsterkes fra Angelicae Sinensis Radix-ekstrakt eller avkok kokt i mer enn 120 minutter (Wang et al., 2016a). I henhold til tradisjonelle teknologier og den kinesiske farmakopékommisjonen (2015), er Cistanches Herba alltid høyt behandlet for å øke sin medisinske effekt; disse prosessene inkluderer ovnstørking, salting og damping med vin (Zou et al., 2017), som fører til DNA-nedbrytning. I tillegg tilsettes ulike hjelpestoffer under bearbeiding, som honning, stivelse og dekstrin. Hvis disse hjelpestoffene ikke fjernes fullstendig, vil renheten til DNA påvirkes. For eksempel brukes følgende produksjonsprosess for å generere Sanbao-kapsler som inneholder Cistanches Herba: "Kok de medisinske skivene i 1,5 timer to ganger, kombiner avkokene og filtrer blandingen. Konsentrer filtratet til en relativ tetthet på 1,20-1,25 (ved 80°C) ◦C). Tilsett andre malte pulvere og bland dem for å oppnå en homogen blanding. Tørk deretter blandingen ved 60◦C, og mal den til en fin

pulver." Etter produksjonsprosessen beskrevet ovenfor kan det imidlertid oppstå vanskeligheter under DNA-ekstraksjonen av kinesiske patentmedisiner, og lange fragmenter vil kanskje ikke bli forsterket fra det nedbrutt DNA, noe som ville forhindre identifikasjon av utroskapsstoffer. For å sikre at kvalitet og renhet av DNA, la vi til ytterligere trinn før den genomiske DNA-ekstraksjonen, inkludert vask med forhåndsvaskebuffer og eluering av ti parallelle rør i ett rør for hver batch.

Selv om alle de kinesiske patentmedisinene som ble brukt i denne studien inneholdt 6–25 ingredienser, kunne primerparene som ble utviklet spesifikt forsterke sekvensene til forfalskningsstoffene i disse kinesiske patentmedisinene. Direkte sekvensering av PCR-produktene viste rene sporfiler. Dermed er denne nukleotidsignaturmetoden i stand til å identifisere både autentiske artsingredienser og forfalskning og bør utvide bruken av DNA-baserte molekylære diagnostiske verktøy for markedstilsyn.

nyreskade og sykdom kan behandles med cistanche

Nukleotidsignaturer for effektiv identifikasjon av Cistanches Herba-produkter

Molekylære verktøy som benytter PCR-teknologi er svært lovende for legemiddelautentisering innen kvalitetskontrollsystemer. Den vellykkede applikasjonen av primerne for å identifisere DNA-nedbrytede utroskapsmidler fra Cistanches Herba antyder at en PCR-basert deteksjonsmetode kan brukes mye. I det kinesiske urtemedisinmarkedet er prisen på autentiske ingredienser fra Cistanches Herba-arter mer enn fem ganger høyere enn prisene på utroskapsstoffene. Resultatene våre viste at Cy. songaricum er den vanligste utroskapen av Cistanches Herba på markedet, etterfulgt av Ci. Sinensis. Cy. songaricum ble tilsatt fordi disse medisinene deler lignende morfologiske egenskaper. I tillegg kommer den kjemiske sammensetningen av Ci. sinensis ligner på Cistanches Herba. Som kvalitetskontrollmarkører forCistanches Herbaekstrakter, echinacosid og acteosid kan utvinnes billig fra Ci. sinensis. Dermed bruker noen farmasøytiske fabrikker Ci. sinensis som en erstatning i produksjonen av Cistanches Herba-ekstrakter. Samlet indikerer resultatene av denne studien at det er betydelig svindel i markedet for legemidler.

Forfalskning i kinesisk patentmedisin er lik det som finnes i andre land. Lignende nivåer av forfalskning er registrert i Nord-Amerika (Newmaster et al., 2013), Europa (Raclariu et al., 2017) og Asia (Cheng et al., 2014; Shanmughanandhan et al., 2016; Gao et al. , 2017). I denne studien var den forfalskede frekvensen av kinesiske patentmedisiner omtrent 48,4 prosent, med bare 16 av de 31 prøvene som var autentiske Cistanches Herba. I tillegg spekulerte vi i at de forskjellige resultatene produsert i produkter fra samme produsent kunne tilskrives forskjeller i kvalitetene til de forskjellige partiene av kinesisk medisinmateriale. Derfor, for å kontrollere kvaliteten på kinesiske patentmedisiner, bør råvarene autentiseres før de bearbeides til produkter.

Forfalskning avCistanches Herbahar tradisjonelt vært assosiert med spørsmål om tilbud og etterspørsel av råvarer.Ci. deserticolaogCi. tubulosaer de to opprinnelige plantene som for tiden brukes til å formulereCistanches Herba. Imidlertid, Ci. deserticola er den eneste originale arten i tradisjonelle autentiske Cistanches Herba oppført i Chinese Pharmacopoeia Commission (2000), der Ci. tubulosa er identifisert som en hor. På grunn av mangel på Ci. deserticola ressurser,Ci. tubulosahar vært oppført som et supplement i den kinesiske farmakopéen siden 2005 (Jiang og Tu, 2009). Inntil nylig har prisene på disse urtene variert markant; Ci. tubulosa har vært mye rimeligere enn Ci. deserticola fordi det er et mye større tilbud av førstnevnte. Her viste resultatene våre at Ci. tubulosa er mer utbredt i kommersielt tilgjengelige Cistanches Herba-produkter.

Som konklusjon, nukleotid signaturer og PCR-basert

Metoder utviklet i denne studien kan tjene som nyttige verktøy for legemiddelindustrien for å autentisere ingredienser og oppdage utroskapsstoffer iCistancherHerba produkter. I henhold til sensitivitetsresultatet, selv om andelen av utroskapsmiddel var én av ti tusen, kan det oppdages via qRT-PCR. Det betyr at når en nukleotidsignatur er oppdaget iCistancherHerba-holdige funksjonelle produkter, det kan identifiseres som en utuktig eller forfalsket ingrediens. En ny løsning for å oppdage forfalskede ingredienser eller forfalskede Cistanches Herba ble levert som ikke tidligere var tilgjengelig via kjemiske deteksjonsmetoder i den kinesiske farmakopéen. I tillegg kan denne metoden brukes til å validere økende typer medisin og for å utvide bruken av DNA-baserte molekylære diagnostiske verktøy for markedstilsyn.

For å avlastekronisknyresykdommedcistanche

FORFATTERBIDRAG

JH unnfanget studien og deltok i utformingen av den. XW, RX og JC bidro med prøver og utførte eksperimentene. XW analyserte dataene. XW, JH, ZZ, S-GN, JS og SC utarbeidet manuskriptet. Alle forfattere har lest og godkjent det endelige manuskriptet.

FINANSIERING

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China [tilskuddsnummer 81673552], CAMS Innovation

Fund for Medical Sciences [stipendnummer 2016-I2 M- 3-016], og United Fund Key Project fra National Natural Science Foundation of China [stipendnummer U1403224].

TAKK

Vi vil gjerne takke våre kolleger som hjalp til med prøveinnsamling, identifisering, laboratoriearbeid og manuskriptforberedelse, inkludert Chaokui Sun, Dianyun Hou og Piao Zhang.

TILLEGGSMATERIALE

Tilleggsmaterialet for denne artikkelen kan finnes online på: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/full#tilleggsmateriale

Tilleggsfigur S1|Justeringsresultatet av ITS2-sekvens fra seks arter.

Tilleggsfigur S2|Agarosegelelektroforese av alle prøver.

Tilleggstabell S1|Sampling av informasjon om Cistanches Herba og dens utroskaper.

Tilleggstabell S2|Sekvensinformasjon for beslektede arter lastet ned fra GenBank.

Tilleggstabell S3|De erklærte sammensetningene av forskjellige kinesiske patentmedisinprøver.

Tilleggsdatablad S1|Alle sekvensene oppnådd i denne studien.

Cistanchedeserticola har mange effekter

REFERANSER

Ananingsih, VK, Sharma, A. og Zhou, W. (2013). Grønn te-katechiner under matforedling og lagring: en gjennomgang av stabilitet og deteksjon. Mat Res. Int. 50, 469–479. DOI: 10.1016/j.foodres.2011.03.004

Chen, H., Jing, FC, Li, CL, Tu, PF, Zheng, QS og Wang, ZH (2007). Echinacoside forhindrer de striatale ekstracellulære nivåene av monoamin

nevrotransmittere fra reduksjon i 6-hydroksydopaminlesjonsrotter. J. Ethnopharmacol. 114, 285–289. DOI: 10.1016/j.jep.2007.07.035

Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Song, J., Shi, L., et al. (2010). Validering av ITS2-regionen som en ny DNA-strekkode for å identifisere medisinske plantearter. PLoS ONE 5:e8613. DOI: 10.1371/journal.pone.0008613

Cheng, X., Su, X., Chen, X., Zhao, H., Bo, C., Xu, J., et al. (2014). Biologisk ingrediensanalyse av tradisjonell kinesisk medisinpreparat basert på sekvensering med høy gjennomstrømning: historien til Liuwei Dihuang Wan. Sci. Rep. 4:5147. DOI: 10.1038/srep05147

Kinesisk farmakopékommisjon. (2000). Farmakopéen til Folkerepublikken Kina. Del I. Beijing: China Medical Science Press.

Kinesisk farmakopékommisjon. (2015). Farmakopéen til Folkerepublikken Kina. Del I. Beijing: China Medical Science Press.

de Boer, HJ, Ichim, MC og Newmaster, SG (2015). DNA-strekkoding og legemiddelovervåking av urtemedisiner. Drug Saf. 38, 611–620. DOI: 10.1007/s40264-015-0306-8

Dubey, B., Meganathan, PR og Haque, I. (2011). DNA-ministrekkoding: en tilnærming for rettsmedisinsk identifikasjon av noen truede indiske slangearter. Rettsmedisinsk. Sci. Int. Genet. 5, 181–184. DOI: 10.1016/j.fsigen.2010.03.001

Edgar, RC (2004). MUSKEL: multippel sekvensjustering med høy nøyaktighet og høy gjennomstrømning. Nucleic Acids Res. 32, 1792–1797. DOI: 10.1093/var/gkh340

Fu, L. (1991). Kina Plant Red Data Book. Del I. Beijing: Science Press, 502.

Gao, Z., Liu, Y., Wang, X., Song, J., Chen, S., Ragupathy, S., et al. (2017). Avledet teknologi for DNA-strekkoding (nukleotidsignatur og SNP-dobbeltoppmetoder) oppdager forfalskning og substitusjon i kinesiske patentmedisiner. Sci. Rep. 7:5858. DOI: 10.1038/s41598-017-05892-år

Gu, CM, Yang, XY og Huang, LF (2016). Cistanches Herba: en nevrofarmakologisk gjennomgang. Front. Pharmacol. 7:289. DOI: 10.3389/fphar.2016.00289

Hajibabaei, M., Smith, MA, Janzen, DH, Rodriguez, JJ, Whitfield,

JB og Hebert, PDN (2006). En minimalistisk strekkode kan identifisere en prøve hvis DNA er degradert. Mol. Ecol. Noter 6, 959–964. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2006.01470.x

Japans farmakopekonvensjon. (2016). The Japanese Pharmacopoeia, 17. utg. Tokyo: Departementet for helse, arbeidskraft og velferd i Japan, 1831–1832.

Jiang, Y. og Tu, PF (2009). Analyse av kjemiske bestanddeler i Cistanche-arter. J. Chromatogr. 1216, 1970–1979. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.07.031

Keller, A., Schleicher, T., Schultz, J., Müller, T., Dandekar, T., og Wolf, M. (2009). 5.8S-28S rRNA-interaksjon og HMM-basert ITS2-kommentar. Gene 430, 50–57. doi: 10.1016/j.gene.2008.10.012

Lei, L., Yang, F., Zhang, T., Tu, P., Wu, L. og Ito, Y. (2001). Preparativ isolering og rensing av acteosid og 2'-acetylacteosid fra Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck ved høyhastighets motstrømskromatografi. J. Chromatogr. A 912, 181–185. DOI: 10.1016/S0021-9673(01)00583-0

Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J. og Tzeng, CM (2016). Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): en av de beste farmasøytiske gaver innen tradisjonell kinesisk medisin. Front. Pharmacol. 7:41. DOI: 10.3389/fphar.2016.00041

Liu, XM, Li, J., Jiang, Y., Zhao, MB og Tu, PF (2013). Kjemiske bestanddeler fra Cistanche Sinensis (Orobanchaceae). Biochem. Syst. Ecol. 47, 21–24. DOI: 10.1016/j.bse.2012.09.003

Liu, Y., Wang, X., Wang, L., Chen, X., Pang, X. og Han, J. (2016). En nukleotidsignatur for identifikasjon av amerikansk ginseng og dets produkter. Front. Plant Sci. 7:319. DOI: 10.3389/fpls.2016.00319

Lo, YT, Li, M. og Shaw, PC (2015). Identifikasjon av bestanddeler av urter i ginseng-avkok ved hjelp av DNA-markører. Hake. Med. 10:1. DOI: 10.1186/s13020-015-0029-x

Meusnier, I., Singer, GA, Landry, JF, Hickey, DA, Hebert, PD og Hajibabaei, M. (2008). En universell DNA-ministrekkode for biodiversitetsanalyse. BMC Genomics 9:214. DOI: 10.1186/1471-2164-9-214

Newmaster, SG, Grguric, M., Shanmughanandhan, D., Ramalingam, S., og Ragupathy, S. (2013). DNA-strekkoding oppdager forurensning og substitusjon i nordamerikanske urteprodukter. BMC. Med. 11:222. DOI: 10.1186/1741-7015-11-222

Raclariu, AC, Mocan, A., Popa, MO, Vlase, L., Ichim, MC, Crisan, G., et al. (2017). Veronica officinalis-produktautentisering ved bruk av DNA-metabarcoding og HPLC-MS avslører utbredt forfalskning med Veronica chamaedrys. Front. Pharmacol. 8:378. DOI: 10.3389/fphar.2017.00378

Shanmughanandhan, D., Ragupathy, S., Newmaster, SG, Mohanasundaram, S., og Sathishkumar, R. (2016). Estimering av autentisering og forfalskning av urteprodukter i India ved å bruke et bilagt, DNA-basert biologisk referansematerialebibliotek. Drug Saf. 39, 1211-1227. DOI: 10.1007/s40264-016- 0459-0

Sun, ZY, Song, JY, Yao, H. og Han, JP (2012). Molekylær identifikasjon av Cistanches Herba og dens utroskapsmidler basert på nrITS2-sekvens. J. Med. Planter Res. 6, 1041–1045. DOI: 10.5897/JMPR11.1115

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., og Kumar, S. (2011). MEGA5: molekylær evolusjonær genetikkanalyse ved bruk av maksimal sannsynlighet, evolusjonær avstand og maksimal sparsomhetsmetoder. Mol. Biol. Evol. 28, 2731–2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121

Wang, Q., Song, W., Qiao, X., Ji, S., Kuang, Y., Zhang, ZX, et al. (2016b). Samtidig kvantifisering av 50 bioaktive forbindelser av den tradisjonelle kinesiske medisinformelen Gegen-Qinlian avkok ved bruk av ultra-høyytelses væskekromatografi kombinert med tandem massespektrometri. J. Chromatogr. 1454, 15–25. DOI: 10.1016/j.chroma.2016. 05.056

Wang, T., Zhang, XY og Xie, WY (2012). Cistanche deserticola

YC Ma, "Desert ginseng": en anmeldelse. Er. J. Chin. Med. 40, 1123–1141. DOI: 10.1142/S0192415X12500838

Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J. og Chen, S. (2016a). En nukleotidsignatur for identifisering av Angelicae Sinensis Radix (Danggui) og dens produkter. Sci. Rep. 6:34940. DOI: 10.1038/srep34940

Yao, CL, Yang, WZ, Wu, WY, Dai, J., Hou, JJ, Zhang, JX,

et al. (2015). Samtidig kvantifisering av fem Panax notoginseng-saponiner ved multi-hjerteskjærende todimensjonal væskekromatografi: metodeutvikling og anvendelse til kvalitetskontroll av åtte Notoginseng-holdige kinesiske patentmedisiner. J. Chromatogr. 1402, 71–81. DOI: 10.1016/j.chroma.2015.05.015

Zhang, C. og Su, J. (2014). Anvendelse av nær-infrarød spektroskopi til analyse og rask kvalitetsvurdering av tradisjonelle kinesiske legemidler. Acta. Pharm. Synd. B 4, 182–192. DOI: 10.1016/j.apsb.2014.04.001

Zhang, W., Qu, Z., Wang, Y., Yao, C., Bai, X., Bian, S., et al. (2015). Nær-infrarød reflektansspektroskopi (NIRS) for rask bestemmelse av ginsenosid Rg1 og Re i kinesisk patentmedisin Naosaitong-pille. Spectrochim. Acta. A Mol. Biomol. Spectrosc. 139, 184–188. DOI: 10.1016/j.saa.2014.11.111

Zou, P., Song, Y., Lei, W., Li, J., Tu, P., og Jiang, Y. (2017). Anvendelse av 1H NMR-basert metabolomikk for diskriminering av forskjellige deler og utvikling av en ny prosesseringsarbeidsflyt for Cistanche deserticola. Acta. Pharm. Synd. B 7, 647–656. DOI: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

Erklæring om interessekonflikt: Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Copyright © 2018 Wang, Xu, Chen, Song, Newmaster, Han, Zhang og Chen. Dette er en artikkel med åpen tilgang distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution License (CC BY). Bruk, distribusjon eller reproduksjon i andre fora er tillatt, forutsatt at den(e) originale forfatteren(e) og opphavsrettseieren(e) krediteres og at den originale publikasjonen i dette tidsskriftet er sitert, i samsvar med akseptert akademisk praksis. Ingen bruk, distribusjon eller reproduksjon er tillatt som ikke er i samsvar med disse vilkårene.