Del 1: Cistanoside Of Cistanche Herba forbedrer hypoksi-indusert mannlig reproduksjonsskade via undertrykkelse av oksidativt stress
Mar 26, 2022
Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Abstrakt:Økende bevis viser at hypoksi er en årsak til mannlig infertilitet, og hypoksi kan være relatert til oksidativt stress (OS). Cistanoside (Cis) er en fenyletanoid glykosidforbindelse som kan utvinnes fra CistanchesHerba og har ulike biologiske funksjoner. Denne studien hadde som mål å undersøke de beskyttende effektene av Cis på reproduktiv skade indusert av hypoksi og utforske de spesifikke underliggende mekanismene. Eksperimentelle modeller for hypoksi i celler og dyr ble konstruert, og de beskyttende effektene av forskjellige undertyper av Cis på det mannlige reproduksjonssystemet ble vurdert både in vitro og in vivo. Resultatene indikerte at hypoksi betydelig reduserte levedyktigheten til GC-1-celler gjennom cellesyklusstans og apoptoseaktivering, som var assosiert med økt OS. Dessuten viste Cis sterke antioksidative effekter både in vitro og in vivo, og gjenopprettet betydelig antioksidantenzymaktiviteter og nedregulering av reaktive oksygenarter (ROS) nivåer samtidig som cellelevedyktighet øker og apoptose reduseres. Det er viktig at Cis-subtypene (Cis-A, Cis-B, Cis-C og Cis-H) studert her alle viste visse antioksidanteffekter, blant hvilke effektene av Cis-B var de mest signifikante. Denne studien viser at Cis markant demper de skadelige effektene av hypoksi-indusert OS ved å påvirke antioksidant enzymaktiviteter i testikler og GC-1celler.
Nøkkelord: Cistanoside, hypobarisk hypoksi, mannlig infertilitet, oksidativt stress, reproduktiv beskyttelse
fersk cistanche plante
Introduksjon
For tiden er omtrent 48,5 millioner (15 prosent ) par i reproduktiv alder over hele verden påvirket av infertilitet [1], hvorav 40-50 prosent av tilfellene tilskrives mannlig infertilitet [2], en tilstand som er sterkt assosiert med miljø og livsstil faktorer. Bevis tyder på at følsomheten til mammaliantestis for lavt oksygentrykk er en årsak til noen former for mannlig infertilitet [3]. Som vist i tidligere studier, er spermatogenesen svekket og redusert ved eksponering for hypobarisk hypoksi [4-7].
For å utforske den underliggende mekanismen, har studier vist at eksponering for hypobar hypoksi øker produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) [8, 9]. ROS spiller en viktig rolle i tematikkens reproduktive system. Ved lave nivåer er de nødvendige for spermkapasitet, akrosomreaksjonen og spermatozo-oocyttfusjon [10]. Imidlertid kan overdreven ROS indusere spermnukleær/mitokondriell DNA-skade og peroksidativ skade på plasmamembranen, som igjen er viktige etiologiske faktorer for økt risiko for mannlig infertilitet [11, 12]. Dermed kan akkumulering av hypoksi-indusert ROS være en årsak til mannlig infertilitet.
Cistanches Herba, en flerårig parasittisk medisinplante, er vidt utbredt i tørre områder [13] og brukes mye på grunn av dens farmakologiske aktiviteter [14-17]. Blant alt det effektive innholdet i Cistanches Herba har PhGs blitt betraktet som den viktigste aktive komponenten. Til dags dato har 34 PhG-er blitt isolert fra Cistanches-planter [13]. Cistanoside (Cis), en aktiv PhG isolert fra Cistanches Herba, har fått oppmerksomhet for sine antioksidanteffekter.
Tatt i betraktning antioksidanteffektene av Cis og rollen til ROS i hypoksi-indusert mannlig infertilitet, anses Cis som en potensiell medikamentkandidat for behandling av hypoksi-indusert maleinfertilitet. Imidlertid har få rapporter tatt for seg antioksidanteffektene av Cis ekstrahert fra Cistanches Herba i behandlingen av hypoksi-indusert mannlig infertilitet eller de involverte signalveiene. I denne studien ble in vitro og in vivo hypoksi eksperimentelle modeller konstruert og effektkomponentene til forskjellige Cis ble vurdert.
Cistanche har enreproduktiv produksjonseffekt.
Materialer og metoder
Cellekultur og reagens
Musespermatogonia-cellelinjen GC-1spg(GC-1) ble kjøpt fra American TypeCulture Collection (ATCC) og dyrket i DMEM (Invitrogen, USA) supplert med 10 prosent føtalbovint serum, 1 prosent L- glutamin (100 mM), penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 ug/mL) ved 37 grader i en fuktet inkubator med 5 prosent CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) ble kjøpt fra Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Kina).
Cellelevedyktighetsanalyse
Cellelevedyktighet ble testet ved celletellesett{{0}}analyse (CCK-8). Kort fortalt ble GC-1-celler sådd i 96-brønnplater med 1,5×103 per brønn og dyrket ved 37 grader i 24 timer. Deretter ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner (20 prosent, 15 prosent, 10 prosent, 5 prosent) oksygen eller forskjellige konsentrasjoner (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) av Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C , Cis-H) for den nødvendige tiden. Deretter ble supernatanten kastet, og cellelevedyktighet ble oppdaget ved bruk av et CCK-8-sett (DojindoJapan). Absorbansen til hver brønn ble målt ved 450 nm ved bruk av en mikroplateleser (BioRad USA). Til slutt ble cellelevedyktigheten beregnet i henhold til følgende formel:
Cellelevedyktighet=(ODeksperimentell gruppe - ODblank gruppe)/(ODkontrollgruppe - ODblank gruppe) × 100 prosent .
Western blot-analyse
Høstede celler eller vev ble homogenisert i RIPA-buffer for å ekstrahere proteiner (RIPA BeyotimeKina; Cocktail Roche Sveits). Supernatanter ble samlet, og konsentrasjonen av proteiner ble testet ved BCA-metoden (Beyotime). Omtrent 40 ug av de ekstraherte proteinene fra hver prøve ble separert med SDS-PAGE og elektrooverført til nitrocellulose (NC) filtermembran (BeyotimeChina). NC-filtermembraner ble blokkert med 5 prosent fettfri melk i 1,5 time og inkubert med spesifikke antistoffer (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; alle antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, USA) over natten ved 4 grader. Deretter ble alle NC-membraner inkubert med det tilsvarende pepperrotperoksidase-konjugerte sekundære antistoffet i 1,5 time ved romtemperatur og avbildet med et bildesystem (Tannon, Kina).
cistanche ekstrakt pulvertilskudd
Cellesyklusdeteksjon
En flowcytometrisk analyse (FCM) ble utført for å analysere cellesyklusen. Celler ble behandlet under forskjellige forhold i 72 timer og høstet. Cellene ble deretter vasket med PBS, fiksert i 75 prosent etanol og farget med propidiumiodid (PI). For hver prøve ble 1×104 celler samlet og analysert ved hjelp av flowcytometri (FACSCalibur, BD Biosciences). Deretter ble andelen av G1/S/G2-faseceller og proliferasjonsindeksen [Fase(S pluss G2)/Fase(G1 pluss S pluss G2) × 100 prosent] beregnet.
Ki-67-farging
Celler ble dyrket i en konfokal skål og behandlet med hypoksi eller forskjellige undertyper av Cis i 72 timer. Etter å ha fikset alle cellene med 4 prosent paraformaldehyd, ble de inkubert med anti-Ki-67 antistoff (1:200, Cell Signaling Technology). Deretter ble alle cellene inkubert med et tilsvarende CY-3-konjugert anti-kanin IgG-antistoff (1:200, Boster, Kina) og DAPI-løsning (1,0 ug/ml, Beyotime). Fluorescens ble observert med et Fluoview FV1000 konfokalmikroskop (Olympus, Japan).
Påvisning av ROS
FCM ble introdusert for å måle intracellulære ROS-nivåer ved bruk av DCFH-DA. Suspenderte celler ble sådd i 6-brønnplater og utsatt for forskjellige behandlinger. Etter 72 timers behandling ble cellene suspendert i serumfritt DMEM med 10 μM DCFH-DA (Beyotime). ROS-innhold ble deretter bestemt ved fluorescensaktivert cellesortering på et Beckman Coulter Flow CytometrySystem med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og emisjonsbølgelengde på 525 nm [18].
Bestemmelse av lipidperoksidasjon (LPO)
Tiobarbitursyre-reaktive substanser (TBARS)-analysen ble utført for å påvise LPO. Alle operasjonstrinn ble utført i samsvar med instruksjonene (Sigma USA). Konsentrasjonene ble beregnet ved å bruke en molar ekstinksjonskoeffisient på 1,56×105/(M·cm), som ble oppnådd ved bruk av malondialdehyd som standard. Resultatene er uttrykt som nmol MDA-ekvivalenter/mg protein.
Bestemmelse av enzymaktivitet
Enzymaktivitetene ble testet ved bruk av analysesett inkludert glutationreduktase (GR), glutationperoksidase (GPx) og superoksiddismutase (SOD). Alle operasjonstrinn ble utført i samsvar med instruksjonene som følger med (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute China).
Dyr og eksperimentell protokoll
Voksne Wistar-hannrotter (180-220 g, 8 w gamle) ble hentet fra dyresenteret ved Fourth Military Medical University, Xi'an, Kina. Tillatelse til bruk av dyrene ble innhentet fra University Ethics Committee (Referansenummer) : 20190506). Dyreforsøket ble utført i henhold til universitetets retningslinjer for stell og bruk av forsøksdyr.
Alle rottene fikk tilpasse seg i omtrent en uke før forsøket startet. Etter akklimatisering ble rottene tilfeldig fordelt i 6 grupper med 5 dyr i hver gruppe. Rottene i kontrollgruppen ble oppdratt under normalt trykk (PO2: 20 prosent; lufttrykk: 101,3 kPa), mens rottene i modellen og Cistreated-gruppene ble oppdratt i et lavtrykksoksygenkammer (internt trykk på 61,6 kPa, tilsvarende en høyde på 4000 meter over havet; PO2: 14,55 prosent) for å simulere et hypoksisk miljø i stor høyde. Alle rottene hadde fri tilgang til mat og vann i plastbur ved 22±2 grader og fuktighetsforhold med en automatisk 12-t lys/mørke-syklus. Rottene i modellen og de Cis-behandlede gruppene forble under hypobariske tilstander, men ble overført til normobariske tilstander hver 96. time, da mat og vann ble gitt dem og burene renset. Varigheten av overgangen fra hypobar til hypobar var omtrent 2 timer. Alle behandlingsgruppene ble behandlet med tilsvarende Cis (8 mg/kg/d) via oral sonde i 8 uker, mens kontroll- og modellrottene ble behandlet med et like stort volum vann.
Etter 8 uker ble rotter avlivet under anestesi. Testes, epididymis og sædblærer ble separert og veid, og organindeksen ble beregnet i henhold til følgende formel: (vekt av organ/dyrevekt) ×100 prosent. Deretter ble sædceller i epididymis samlet inn, og deres motilitet og akrosomeenzymaktivitet ble testet. På samme måte ble testikkelvev samlet inn for histopatologiske studier og ROS, LPO og antioksidant enzymaktivitet deteksjon.
Evaluering av levende sperm rate
Epididymis ble skåret inn med kirurgisk saks, og sædsuspensjonen ble tilberedt i vanlig saltvann. For å evaluere den levende sædhastigheten ble 5 μL av sædsuspensjonen forsiktig blandet med et like stort volum eosin-Ystain. Sædcellene ble deretter talt under et lysmikroskop. Antall levende sædceller ble vurdert ved å beregne både farget (dødsperm) og ufarget sæd (levende sæd).
Cistanche tubulosa pulverøkerlevende sædfrekvens.
For mer informasjon, vennligst klikk her.
Bestemmelse av spermakrosomets enzymaktivitet
Spermakrosomenzymaktivitetsanalysen ble brukt for å evaluere spermakrosomenzymer [19]. Resultatene i hver gruppe ble beregnet ved å bruke følgende formel: Akrosomenzymaktivitet (μIU)=(ODEeksperimentgruppe - ODBlank gruppe)/(247,5×10) × 106.
Statistisk analyse
Alle kvantitative data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD og ble analysert med SPSS 22.0 programvare. Independent Students t-test ble brukt til å sammenligne data mellom to grupper. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
