Del 1: Kartlegging av det epigenomiske og transkriptomiske samspillet under minnedannelse og tilbakekalling i Hippocampal Engram Ensemble
Mar 15, 2022
For mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com
Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*
1Picower Institute for Learning ogHukommelse, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
2Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
3Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.
4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA.
5Broad Institute of Harvard og MIT, Cambridge, Massachusetts, USA.
Klikk for åCistanche vitaminbutikk og Cistanche for minne
Abstrakt
Epigenomet og den tredimensjonale (3D) -genomiske arkitekturen dukker opp som nøkkelfaktorer i den dynamiske reguleringen av forskjellige transkripsjonsprogrammer som kreves for nevronale funksjoner. Her bruker vi et aktivitetsavhengig merkesystem i mus for å bestemme den epigenetiske tilstanden, 3D-genomarkitekturen og transkripsjonslandskapet til engramceller over levetiden tilhukommelsedannelse og tilbakekalling. Våre funn avslører dethukommelsekoding fører til en epigenetisk priming-hendelse, preget av økt tilgjengelighet av forsterkere uten tilsvarende transkripsjonelle endringer.Hukommelsekonsolidering resulterer deretter i romlig omorganisering av store kromatinsegmenter og promoter-enhancer-interaksjoner. Til slutt, med reaktivering, bruker engram-neuroner en undergruppe av interaksjoner med denovolong-range, der primede forsterkere ble brakt i kontakt med deres respektive promotere for å oppregulere gener involvert i lokal proteinoversettelse i synaptiske rom. Samlet sett belyser vårt arbeid den omfattende transkripsjonen, og brukere kan se, skrive ut, kopiere og laste ned tekst og data-mine innholdet i slike dokumenter, for akademisk forskning, alltid underlagt de fullstendige vilkårene for bruk: http://www.nature. no/authors/editorial_policies/license.html#terms
*Korrespondanse til: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.
Forfatterbidrag:
AM og L.-HT konseptualiserte og designet prosjektet. AM og AZ utførte atferdseksperimenter, ISH, immunfarging og MARIS-analyse. CA utførte virusinjeksjon og immunfarging. AM og HSM utførte ATAC-seq-eksperimenter. AM og AZ utførte nukleære RNA-seq-eksperimenter. AM, HSM og VD utførte pc-Hi-C og Hi-C eksperimenter. AM, HSM, VD, RMR og JDV utførte ATAC-seq-analyse. AM, RMR, HSM, VD og FG utførte nukleær RNA-sekvensanalyse. AM, VD, HSM og RMR utførte pc-Hi-C og Hi-C analyse. Alle forfattere hjalp til med å tolke dataene. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK og LHT skrev manuskriptet med innspill fra alle forfattere. LHT leverte verktøyene og overvåket prosjektet.
Konkurrerende interesser:
Forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
det epigenomiske landskapet gjennom levetiden tilhukommelsedannelse og tilbakekalling i hippocampus engram-ensemblet.
Dannelsen og bevaringen av langtidsminner avhenger av koordinert genuttrykk og syntese av synaptiske proteiner1. Disse molekylære prosessene virker innenfor en spesifikk populasjon av nevroner, referert til som engramceller2–4. Nyere tilnærminger ved bruk av aktivitetsavhengig uttrykk for reportere ga et rammeverk for å utforske engram-ensemblet5–8, men de molekylære mekanismene som styrerhukommelselagring og henting forblir dårlig forstått. Spesifikt dukker epigenetiske modifikasjoner og 3D-genomisk arkitektur opp som en nøkkelfaktor i den dynamiske reguleringen av genuttrykk9–17, og det er en økende forståelse av deres betydning for nevronal funksjon, utvikling og sykdom14, 16, 18
Her brukte vi Targeted Recombination in Active Populations (TRAP) musemodell5,6, der aktiverte nevroner som uttrykker Activity Regulated Cytoskeleton Associated Protein, (Arc) genet, er permanent merket på en induserbar måte. Aktiverte nevroner underhukommelsekoding, konsolidering og tilbakekalling ble sortert og utsatt for kjernefysisk RNA-sekvensering (nRNA-seq), Assay for Transposase-Accessible Chromatin ved bruk av sekvensering (ATAC-seq) og kromosomkonformasjonsfangst (Hi-C). Våre data viser dethukommelsekoding fører til en genomomfattende økning i kromatintilgjengelighet, uten forventede endringer i genuttrykk. Videre demonstrerer vi at den sene fasen av minnekonsolidering var assosiert med re-lokalisering av store kromatinsegmenter (underavdelinger) fra inaktive til permissive miljøer, og omorganiseringen av promoter-enhancer interaksjonslandskapet. Til slutt, reaktivering av nevronene underhukommelsetilbakekalling er assosiert med denovopromoter-enhancer-interaksjoner, ved å bruke en stor undergruppe av forsterkerne som ble primet underhukommelsekoding. Disse promoter-enhancer-interaksjonene er assosiert med en robust endring i uttrykket av gener involvert i lokal proteinsyntese og synaptisk morfogenese.
Resultater
Tidsmessig og romlig identifikasjon av aktiverte og reaktiverte engramceller
Sporing av nevronal aktivitet over tid har vært en av de største utfordringene når man studerer engram-celler, ettersom markørene for nevronal aktivitet, kjent som umiddelbare tidlige gener (IEG), går tilbake til baseline kort tid etter induksjon1,2. For å overvinne denne begrensningen, tok vi fordel av TRAP5,6-modellen, som krever to transgener, en som uttrykker CreERT2 fra en aktivitetsavhengig Arc-promoter og en som tillater ekspresjon av det gule fluorescerende proteinet (eYFP) reporteren, i en Cre- avhengig måte. Administrering av tamoxifen (TAM) til TRAP-musene resulterer i en permanent eYFP-merking i de aktiverte Arc-neuronene. Uten TAM blir CreERT2 beholdt i cytoplasmaet og eYFP uttrykkes ikke (Utvidet data Fig. 1a). TRAP-mus ble utsatt for det klassiske Pavlovianske kontekstuelle fryktkondisjoneringsparadigmet (CFC) (fig. 1a), en vanlig metode for å studere aversive minner19. Omtrent 1,5–2 timer etter eksponering for FS, ble hjerner samlet for å identifisere i) RNA-bindende proteinrev-1 homolog 3 (Rbfox3) også kjent som NeuN plus og eYFP pluss merkede nevroner som ble aktivert under den første eksponeringen (aktivert -early), som kan skilles fra ii) NeuN pluss /eYFP- ikke-aktiverte basaltilstandsnevroner (Basal) (fig. 1a). Etter fem dager, i fravær av henting, samlet vi iii) NeuN pluss /eYFP pluss nevroner som ble merket på treningsdagen, som angir langsiktighukommelsekonsolidering (Aktivert-sent). I en
forskjellig kohort, mus ble eksponert på nytt for den betingede stimulus og påfølgende endogent ARC-proteinekspresjon ble analysert 1,5–2 timer etter gjeneksponering. Dette muliggjorde identifisering av iv) dobbeltpositive NeuN pluss /eYFP pluss / endogene Arc plus engram-neuroner som ble aktivert under trening og reaktivert underhukommelsetilbakekalling (aktivert på nytt). Spesielt, selv om DNA-rekombinasjon kanskje ikke helt oppstår 1,5–2 timer etter FS, observerte vi høy samlokalisering (gjennomsnitt på 84 prosent) mellom endogent Arc-protein og Arc:eYFP-reporteren (Utvidet data Fig. 1b), som også var i samsvar med tidligere rapporter20.
Å bekreftehukommelsekoding og tilbakekalling under CFC, fryseatferd ble registrert under trening og gjeneksponering for fryktfremkallende signaler (Utvidet data Fig. 1c). I samsvar med de tidligere publikasjonene6,20 viste dataene våre en betydelig økning i antall eYFP pluss (aktiverte-tidlig og -sen) nevroner i hippocampus, sammenlignet med mus som forble naive for CFC i hjemmeburet (F (2, 70)=240.3, s<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">
Minnedannelse er assosiert med økt kromatintilgjengelighet, hovedsakelig på forsterkere
For bedre å forstå de molekylære kreftene som styrer forskjellige transkripsjonsprogrammer, målte vi genomomfattende endringer av kromatintilgjengelighet over forskjellige faser avhukommelse. Hippocampale vev ble slått sammen og isolerte kjerner (utvidet data fig. 2a, tilleggstabell 1) ble utsatt for ATAC-seq bibliotek forberedelse. Differensielt tilgjengelige regioner (DAR)-analyse (Diffbind, DESeq2-modus) mellom alle populasjoner (fig. 2a) avslørte at de fleste endringene i kromatintilstanden skjer under den tidlige fasen av minnedannelse, hvor 7,862 regioner over genomet øker tilgjengelighet (Basal vs. tidlig, tilleggstabell 2). Derimot observerte vi relativt minimale endringer i kromatintilstand ved overgang fra Aktivert-tidlig til Aktivert-sent (582 DAR) og mellom Aktiverte-sene og Reaktiverte nevroner (725 DAR), med 48 prosent overlapping mellom dem (Utvidet data Fig. 2b) ). Bemerkelsesverdig nok identifiserte vi en stor prosentandel (52 prosent) av stabilt oppnådde DAR-er som ble mer tilgjengelige i Activated-early og forble tilgjengelige i både Activated-late og Reactivated neuronene (fig. 2b,c; tilleggstabell 2). Interessant nok, mens både tidlige endringer (Basal vs. Early) og stabilt oppnådde DAR-er ble beriket for intergene regioner, ble sene kromatinendringer (tidlig vs. sent og sent vs. reaktivert) for det meste beriket for promotersteder (fig. 2d).
Funksjonell innsikt ble gitt ved å vurdere hvordan DAR-er er merket med forskjellige histonmodifikasjoner. Vi brukte først ChromHMM for å etablere en kromatintilstandsmodell fra to uavhengige studier som brukte bulk hippocampusvev før og etter fotsjokk 21,22. Deretter utførte vi en fold anrikningsanalyse (observert over forventet distribusjon) av DAR-ene for disse forskjellige tilstandene og avslørte at tidlige kromatinforandringer og stabile DAR-er ble beriket for forsterkermerker (fig. 2e; utvidede data fig. 2c, tilleggstabell 3) .
Disse resultatene er i tråd med tidligere publikasjoner, som viser at stimulering av primær nevronkultur induserer forlenget forsterkeraktivitet12,23. Deretter analyserte vi overlappingen av individuelle stabile loki med H3K4me1 og H3K27ac21. Disse to histonmerkene avgrenser forskjellige populasjoner av forsterkere, som enten kan være 'primet' (bare H3K4me1), 'aktive' (H3K4me1 og H3K27ac), eller 'latente' (ingen merker)18. Stabile topper viste en fordeling på tvers av både primede og aktive forsterkere (Utvidet Data Fig. 2d), der 47 prosent av disse stedene ble spådd å være 'latente' (ingen overlapping mellom DAR-er og histonmerker21 oppnådd 1 time etter FS). For å bekrefte modellen vår utførte vi kromatinimmunutfelling (ChIP) for H3K4me1 og H3K27ac histonmarkører, etterfulgt av qPCR. Fire utvalgte steder ble valgt fra vår antatte forsterkermodelleringsanalyse (Utvidede data Fig. 2d; Enhancer 1 – predikert primet, Enhancer 2- predikert Active, Enhancer 3 og 4 – predikert latent). I samsvar med modellen vår identifiserte vi to 'latente' loci i basaltilstanden (Enhancers 3 og 4) som transformerte til en 'aktiv' tilstand underhukommelseformasjon (fig. 2f). Dessuten ble den antatte forsterkeren 1 funnet å være "primet" i basaltilstanden og ble aktiv, hvor det var en signifikant stabil økning i H3K27ac-markører under den sene fasen og tilbakekallingen (fig. 2f). Sammen indikerer disse dataene at repertoaret av nylig tilgjengelige forsterkere ble utvidet i de potensierte engram-nevronene, der latente eller primede regioner fikk H3K4me1- og H3K27ac-merker og dermed ble aktive forsterkere.
For å forstå den funksjonelle rollen til tilgjengelige promotere og enhancer-regioner, utførte vi motivberikelsesanalyse (tilleggstabell 4). Dataene våre indikerer at flertallet (70 prosent) av motivene på tilgjengelige promotere er like beriket og ble identifisert på tvers av alle faser avhukommelse(Utvidet data fig. 2e). I motsetning til dette viste flertallet av forsterkersteder distinkte mønstre av transkripsjonsfaktor (TF)-bindende motiver på tvers av forskjellige minnefaser. Interessant nok ble de allestedsnærværende uttrykte motivene fra Jun Proto-Oncogene, Ap-1 Transcription Factor Subunit (dvs. Jun-Ap1), og Regulatory Factor X (Rfx)-familien av TF-er, betydelig beriket først etter den innledende fasen av koding (utvidet data fig. 2e). Det ble tidligere rapportert at Jun-Ap1-komplekset spiller en sentral rolle i forsterkervalg og kan fungere som en pioner-TF for å definere forsterkersteder under hjerneutvikling og neuronal aktivitet12,24. Disse funnene samsvarer med våre data som viste en høy prosentandel av latente/primede loci i basaltilstanden (fig. 2f, utvidede data fig. 2c,d). Derfor ser det ut til at nevronal aktivitet kan utløse bindingen av Jun-Ap1 til latente forsterkere, som deretter rekrutterer kromatinmodifikatorer som aktiverer latente forsterkere. På samme måte antyder berikelsen av transkripsjonsfaktoren Yin Yang 1 (Yy1)-motiver bare i forsterkere fra tidlige og sene tilstander at promoter-enhancer-organisasjon er en aktiv prosess medhukommelseformasjon, ettersom det nylig ble rapportert at Yy1 letter dannelsen av disse langdistanseinteraksjonene25. Samlet antyder disse dataene at den innledende fasen avhukommelsedannelse endrer kromatintilgjengelighetslandskapet i aktiverte nevroner, med langvarige stabile endringer som hovedsakelig forekommer i forsterkerregioner.
Dynamiske endringer i romlig kjernefysisk arkitektur og kromatintilgjengelighet under innledendehukommelsedannelse korresponderer med økt promoter-enhancer interaksjonsfrekvens underhukommelseminnes
Nukleær 3D-arkitektur dukker opp som en nøkkelfaktor i den dynamiske reguleringen av genuttrykk, i mange nevronale funksjoner26–28. Derfor var vi interessert i å avgrense de nøyaktige endringene som skjer i romlig kromatinorganisasjon underhukommelsedannelse og konsolidering. Vi produserte Hi-C-data fra basaltilstand og eYFP pluss merkede nevroner (tidlig og sent, tilleggstabell 5). Kromatin er segregert i to romlig distinkte sub-nukleære rom, 'A' og 'B', tilsvarende det transkripsjonelt aktive og inaktive kromatinet, henholdsvis15, 16,26. Tidlige bevis tyder på at neuronal aktivitet og ytre signalering kan indusere en reorganisering av 3D-kromatinarkitektur14,27,28. Vår avdelingstilstandsanalyse15, 16,26 (fig. 3a–c) avslørte relokalisering av store kromatinsegmenter fra inaktive (B) til det permissive miljøet (A) (og omvendt) under den innledende og sene fasen avhukommelseformasjon (212 segmenter byttet fra A til B, 127 fra B til A, gjennomsnittlig størrelse på ~436Kbp). Interessant nok opprettholdt 52 prosent av regionene i den tidlige fasen som byttet fra B til A den tilstanden i den sene fasen (dvs. forble i tilstand A, fig. 3b,c; tilleggstabell 6). Dessuten overlappet nesten alle disse regionene med oppnådde DAR-er fra vår ATAC-seq-analyse, noe som bekrefter overgangen til underavdelingen fra inaktivt til det permissive miljøet (fig. 3d). Disse dataene indikerer at noen loci gjennomgår sub-compartment switching over forskjellige minnefaser, og derfor kan bidra til langsiktige endringer i nevronale egenskaper og funksjon etter første aktivering.
Mens Hi-C-dataene våre antydet omorganisering i stor skala, forble det uklart om denne reorienteringen muliggjorde samspillet mellom nye promoter-enhancer-repertoarer og finjustering av forskjellige transkripsjonsprogrammer (fig. 3e). Ved å bruke promoter-capture Hi-C (pc-HiC)-teknikken, studerte vi de nøyaktige endringene som skjer i promoter-enhancer-interaksjoner under prosessen medhukommelsedannelse og tilbakekalling. For denne studien brukte vi spesialdesignede "baits" målrettet mot ~5000 promotere29. I samsvar med tidligere publikasjoner29, oppdaget vi ~19 000 (per gruppe) signifikante promotor-forsterkere (67,5 prosent) og promotorer-promotere (46,2 prosent) interaksjoner (utvidet data fig. 3a,b).
Siden promotorer i pattedyrhjernen kan være under kontroll av flere regulatoriske elementer14,30,31, analyserte vi overlappingen mellom alle interagerende forsterkere og deres respektive promotorer. Det har vi funnet under hverhukommelsefase, interagerer de samme promoterne oftere med en distinkt undergruppe av forsterkere (dvs. unik, Basal – 3243, Tidlig - 7602, Sen - 7028, Reaktivert – 7244; Fig. 4a,b; Utvidet data Fig. 3c, tilleggstabell 7). Dette resultatet er i samsvar med tidligere publikasjoner som viser at flere forsterkere som omgir flere gener (c-Fos og Arc) er avgjørende for deres aktivering, og deres interaksjonsfrekvens med deres respektive promotere endres som svar på forskjellige depolariserende midler i dyrkede nevroner31. Vi identifiserte også en mindre undergruppe av interaksjoner der promotørene interagerte med de samme forsterkerne på tvers av forskjelligehukommelsefaser (dvs. vanlig, ~31 prosent av alle interaksjoner; tilleggstabell 7). Videre presenterte reaktiverte nevroner betydelig sterkere interaksjonsscore (som beregnet av Chicago, fig. 4b; utvidede data fig. 3d). Derfor, selv om antallet unike interaksjoner var likt i tidlige, sene og reaktiverte tilstander, indikerer sterkere interaksjonsscore at spesifikke promoter-enhancer-interaksjoner forekommer oftere under hukommelsen
minnes. Denne forestillingen ble ytterligere validert av 3C-eksperimenter, med primere designet for å måle frekvensen av interaksjon mellom utvalgt enhancer (E) og genpromotere (P) som koder for eukaryotisk translasjonsinitieringsfaktor 3 underenhet D (Eif3d) eller glutamatreseptor, ionotropisk, kainat 3 (Grik3) (Fig. 4c). Våre data viste at reaktiverte nevroner hadde en signifikant økning i interaksjonsfrekvensen mellom Eif3d-promoteren og den valgte forsterkeren, sammenlignet med de andre populasjonene (fig. 4c). Samlet indikerer disse dataene at promoter-enhancer-interaksjoner forekommer hyppigere i løpet avhukommelseminnes.
Deretter spurte vi om de dynamiske langdistanseinteraksjonene identifisert via pc-HiC tilsvarer kromatinregioner som blir mer tilgjengelige, som bestemt via ATAC-seq. Dette vil bekrefte at den økte tilgjengeligheten har en funksjonell konsekvens i å få til nye promoter-enhancer-interaksjoner. For å oppnå dette sammenlignet vi overlappingen mellom interagerende forsterkere i hver cellepopulasjon med DAR-er (observert) eller et tilfeldig sett med tilgjengelige genomiske loci (forventet). Analysen vår avslørte en signifikant overlapping mellom både oppnådde DAR-er i aktiverte tidlige nevroner og stabilt oppnådde DAR-er med de interagerende forsterkerne, i alle cellepopulasjoner (Alle Ps < 0.0001,="" utvidede="" data="" fig.="" 3e).="" i="" kontrast,="" endringer="" i="" kromatin="" tilgjengelighet="" som="" skjedde="" i="" den="" sene="" fasen="">hukommelsekonsolidering og reaktivering overlappet ikke signifikant med interagerende forsterkere (utvidet data fig. 3e). Sammen indikerer disse resultatene at gevinsten av tilgjengelighet under minnekoding er en priming-hendelse og disse primede lokiene engasjerer seg i de-novo funksjonelle promoter-enhancer-interaksjoner i senere faser avhukommelseformasjon. Dette dynamiske landskapet er illustrert ved å visualisere de genomiske områdene rundt genet for eukaryot translasjonsinitieringsfaktor 5 underenhet A (Eif5a) (fig. 4d). Denne tidsmessige molekylære disseksjonen av engrams levetid fremhever hvordan koordinert priming av den epigenetiske tilstanden til en celle underhukommelsekoding og konsolidering letter langdistanseinteraksjoner under reaktivering.