Del 2: Cannabinoidreseptor type 2 fremmer nyrefibrose gjennom orkestrering -cateninsignalering

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Figur 4| -arrestin 1(-arr1)/SRC proto-onkogen (Src) komplekset medierer cannabinoid reseptor type 2(CB2)-indusert aktivering av -catenin(-cat) signalering. (a) Representative grafer viser bindingen av CB2 med -arr1 eller Src. Menneskelignyreproksimaltrørformet(HKC-8)-celler ble behandlet med aminokylindol (AM1241; 10 uM) alene eller samtidig behandlet med XL-001(10 uM) i 24 timer. Helcellelysater ble immunutfelt med et antistoff mot CB2 og blottet med antistoffer mot -arr1 og Src. (Fortsettelse)

Cistanche er bra for nyrefibrose

CB2 forsterker Wnt-signalering ved å fremme -arrestin 1/Src/ -catenin-banen

Som vist i figur 6a-c, induserte ektopisk ekspresjon av CB2 eller Wnt1 oppreguleringen av -arrestin 1 og fosfo-Src (Tyr15), en aktiv form av Src. Ekspresjonsnivåene av -arrestin l og fosfo-Src(Tyr416) ​​ble ytterligere forbedret ved samuttrykk av CB2 og Intl. Vi utførte deretter cos-trening for CB2 med -catenin ved in situ hybridisering og immunfluorescens i UIRI-mus med samuttrykk av CB2 og Wnt1. Nesten alle CB2-positive tubulære celler uttrykte -catenin, noe som impliserer den potensielle rollen til -catenin i CB2-banen (figur 6d). Vi testet deretter uttrykket av -arrestin 1 og aktivt -catenin ved immunfluorescensfarging. Som vist i figur 6e, samarbeidet CB2 med Wntl for å øke deres uttrykk. Videre, i UIRI-mus ble CB2-- eller Wntl-indusert aktivering av -catenin og dets mål MMP-7 og Snail ytterligere økt ved samekspresjon med hverandre (figur 6f-i). Det lignende ekspresjonsmønsteret til Kim-1, vurdert ved immunhistokjemi og Western blot-analyse, viste også at CB2 hadde en synergistisk stimulerende effekt på Wnt1-indusert tubulær skade (figur 6e, f og j).

Cistanchekan forbedrenyrefunksjon

Eksogen CB2 og Wnt1 induserer synergistisk -catenin-signalering og nyrefibrose ved folsyreindusert nefropati

Den detaljerte eksperimentelle designen er vist i figur 7a. Som vist i figur 7b og c, i folsyre-indusertnyrer, induserte ektopisk ekspresjon av CB2 eller Wntl oppreguleringen av CB2, og CB2-nivåene ble ytterligere forhøyet ved samuttrykk av CB2 og Wntl. Vi undersøkte deretter uttrykket av -arrestin 1 og fosfo-Src(Tyr416). Som vist i figur 7d-g, økte eksogen CB2 og Wnt1 synergistisk ekspresjon av både -arrestin 1 og fosfo-Src. Videre viste immunfarging av aktivt -catenin at CB2 eller Wntl økte aktiveringen av -catenin, og de hadde en samarbeidende effekt (Figur 7d). Lignende resultater ble oppnådd når uttrykket av aktivt -catenin og dets nedstrømsmål MMP-7 og Snail ble vurdert ved Western blot (Figur 7h-k). De ekspresjonelle nivåene av Kim-1, fibronektin og a-SMA ble oppregulert av ektopisk ekspresjon av CB2 eller Wnt1 og ytterligere forhøyet av deres samuttrykk (figur 7h og l, og 8a-c). Lignende resultater ble oppnådd når fibronektin, kollagen I, Kim-1 og Massons trikromfarging ble vurdert (figur 8d). Disse resultatene tyder videre på at CB2 spiller en aktiv rolle i den -arrestin 1/Src-induserte -catenin-veien.

Cistanchekan forbedrenyrefunksjon

Knockdown av -arrestin 1 forbedrer -catenin-signalering og nyrefibrose hos AM1241-induserte UIRI-mus

Vi undersøkte deretter rollen til kort hårnåls-RNA-mediert in vivo-demping av -arrestin 1 i UIRI-mus injisert med AM1241 (figur 9a). Dempningseffekten til -arrestin l ble bekreftet ved kvantitativ sanntids-PCR (Figur 9b). Administrering av AM1241 økte serumkreatinin og nitrogennivåer av urea i blodet ytterligere; knockdown av -arrestin 1 hemmet imidlertid disse økningene betydelig selv i UIRI-mus etter AM1241-administrasjon (figur 9c og d). Kvantifiseringen av periodisk syre-Schiff-farging (tilleggsfigur S3) viste at knockdown av -arrestin 1 i stor grad beskyttet mot AM1241-indusert tubulær skade (figur 9e). Immunfargingsresultatene viste at knockdown av -arrestin 1 hemmet AM1241-oppregulert aktivt -catenin-uttrykk (figur 9f). Videre bekreftet fargeresultatene av fibronektin, kollagen I og Kim-1 ytterligere den beskyttende rollen til interferens med -arrestin 1 inyrefibrogenese(Figur 9g). Lignende resultater ble observert når ekspresjonen av aktivt -catenin, MMP-7, Snail, fibronektin, a.-SMA eller Kim-1 ble vurdert ved Western blot-analyse (Figur 9h-n). Interessant nok observerte vi at -arrestin 1 knockdown hemmet CB2-ekspresjon, noe som tyder på en aktiveringsløkke blant CB2, -arrestin 1 og -catenin (Figur 9h og o). Massons trikromfarging og kvantifisering av det fibrotiske området demonstrerte ytterligere -arrestin 1-demping kraftig hemmet AM{17}}akselerertnyrefibrose(Figur 9g og p).

CB2 er et nedstrømsmål for -catenin og letter en aktiveringssløyfe med -catenin

Det var flere kopier av perfekte antatte T-cellefaktor/lymfoidforsterkerbindende faktorbindingsseter i promotorregionene til både humane og muse CB2-gener (figur 10a). HKC-8-celler ble transfektert med N-terminalt trunkert, FLAG-merket, konstitutivt aktivert

Cistanchekan forbedrenyrefunksjon