Del 2: Karbamylert Sortilin assosiert med kardiovaskulær forkalkning hos pasienter med kroniske nyresykdommer

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Klikkherfor del 2.

Karbamylert sortilin endrer ligandbinding

Sortilin er en koreseptor for flere ligander.8 Karbamylering av lysin endrer i betydelig grad egenskapene til lysinsidekjeden, hvorved den positivt ladede aminogruppen erstattes av en voluminøs polar gruppe, noe som potensielt påvirker ligandbindingen. Vi undersøkte interaksjonene til de hyppigst modifiserte sortilin lysin-sidekjedene som finnes ikronisk nyresykdom(aminosyresekvens [krystallstruktursekvens]), Lys95(62), Lys205(172), Lys260(227) og Lys294(261), ved in silico-modellering for å forutsi mulige struktur-funksjonskonsekvenser av lysinkarbamylering. Vi brukte den eksisterende sortilin-ektodomene-krystallstrukturen fra både den neurotensin-bundne formen ved nøytral pH (PDB Q24-fil: 4PO7; figur 3a) og den ligandfrie formen ved sur pH (PDB-fil: 6EHO; tilleggstabell S5).

Ved nøytral pH danner Lys95(62) en saltbro med Glu609(576) og en hydrogenbinding med hovedkjedekarbonylgruppen til Arg90(57). Ved sur pH er interaksjonen med Glu609(576) tettere ettersom avstanden mellom aminogruppen til Lys95(62) og karboksylgruppen til Glu609(576) nå tillater dannelsen av en hydrogenbinding, mens interaksjonen med Arg90(57) ) er ikke til stede. Derfor kan karbamylering ved Lys95(62) destabilisere begge sortilinkonformasjonene. Dermed vil karbamylering ved Lys205 muligens favorisere den sure pH-konformasjonen til sortilin. Lys294(261) har ingen interaksjoner ved både nøytral og sur pH.

Effekter av cistanche: behandle nyresykdommer

Til slutt, ved nøytral pH, interagerer Lys260(227) med neurotensin-Tyr11 i ligandbindingsstedet i b-propelltunnelen til sortilin. Siden den sure pH-sortilinstrukturen ikke har noen ligandaffinitet, finner vi ingen interaksjoner av Lys260(227) sidekjeden i denne strukturen. Interaksjonen med neurotensinTyr11 vil bli påvirket av karbamylering og kan føre til en lavere affinitet for neurotensin. Interleukin 6 (IL-6), en kjent sortilinligand,20 binder sortilin gjennom sin C-terminale hale, som inneholder et arginin i den ekvivalente posisjonen til neurotensin-Tyr11. Dermed kan karbamylering av Lys260(227) sannsynligvis øke affiniteten for IL-6, en potensiell bidragsyter til vaskulær forkalkning.

Påfølgende bindingsstudier ved bruk av overflateplasmonresonansspektroskopi og SortCo eller SortCarb avslørte mer effektiv binding av IL-6 til SortCarb (KD ¼ 23 nM) sammenlignet med Q25 med ikke-modifisert SortCo (KD ¼ 141 nM), noe som tyder på karbamylert sortilin som en potensiell IL -6 bindende partner (figur 3b og c). Progranulin, en annen kjent sortilinligand,22 bandt til SortCo, men en binding til SortCarb kunne ikke påvises (tilleggsfigur S7A og B). Både SortCo og SortCarb er bundet til humant reseptorassosiert protein smeltet til en GST-tag,23, men ikke til GST alene, og støtter den strukturelle Q26-integriteten til sortilin uavhengig av karbamyleringsstatus og demonstrerer spesifisiteten til vår eksperimentelle setting (tilleggsfigur S7C– F).

Deretter vurderte vi om den endrede affiniteten til IL-6 kan påvirke signalveier involvert i vaskulær forkalkning. Ved forkalkning av hSMC-er fremmet tilsetningen av IL-6 til SortCarb ALPL- og RUNX2-mRNA-ekspresjon (figur 3d og e) så vel som TNAP-aktivitet (figur 3f), mens det ikke hadde noen effekt i kombinasjon med SortCo. Disse dataene indikerer at sortilinkarbamylering øker evnen til ligandbinding til IL-6, noe som forårsaker økt glattmuskelcelleforkalkning.

figure 3-1

Sortilin karbamylering er assosiert med vaskulær forkalkning ikronisknyresykdompasienter På grunnlag av våre data som karbamylerte sortilinrester ble funnet å assosiere medkronisknyresykdomog forkalkning, studerte vi deretterkronisknyresykdomdeltakere i CARVIDA-studien, hvor computertomografiske skanninger kvantifiserte CAC. I likhet med deltakerne i CARE FOR HOME-studien, hadde de fleste CARVIDA-deltakerne 2 og 3 PTM, med lysinrestene 95 og 260 ofte påvirket (tilleggsfigur S8A). Sammenlignet med pasienter uten karbamylerte rester, var pasienter med 1 sortilin karbamyl-lysinrester eldre (P ¼ 0.002), hadde lavere eGFR (P ¼ 0,008), var mer ofte (tidligere) røykere (P ¼ 0,023), og hadde betydelig høyere CAC-volum (P < 0,001;="" figur="" 4a="" og="" tilleggstabell="">

Ln-(CAC pluss 1) ved baseline korrelerte med tilstedeværelsen og økningen av post-translasjonelt karbamylert sortilin (tilleggstabell S7). Videre var Ln-(CAC þ 1) også assosiert med mannlig kjønn, diabetes mellitus, antidiabetiske og lipidsenkende medisiner, høyere alder, serum IL-6 og hemoglobin A1c, og lavere eGFR og serum high-density lipoprotein ( Tilleggstabell S7). Likevel forble assosiasjonen mellom karbamylerte sortilinrester og baseline Ln-(CAC þ 1) signifikant etter justering for alle variablene nevnt ovenfor (P ¼ 0.029; Tabell 3).

cistanche

Effekter av cistanche: behandle nyresykdommer

Deretter vurderte vi om tilstedeværelsen av karbamylerte rester har en innvirkning på CAC-progresjon. Tilstedeværelsen av karbamylert sortilin (vs. ingen karbamylering) økte progresjonen av CAC (P ¼ 0.047). I detalj,kronisknyresykdompasienter med karbamylert sortilin (n ¼ 33) viste en signifikant økt CAC-progresjon over en median oppfølgingstid på 4,4 år (figur 4b), med en årlig økning i median CAC-volum på 30.32 Q27 (interkvartilt) område ¼ 84,0) (Figur 4C). I motsetning,kronisknyresykdompasienter uten sortilinkarbamylering (n ¼ 8) viste en årlig endring i median CAC-volum på 1,63 (interkvartilt område ¼ 8,54) og ingen signifikant CAC-progresjon over oppfølgingsperioden (figur 4b og c). Etter justering for kovariater assosiert med CAC-progresjon (baseline CAC-volum, alder, kjønn, kroppsmasseindeks, eGFR, diabetes mellitus, serum IL-6, serum high-density lipoprotein og lipidsenkende medisiner), var karbamyleringsstatusen ikke lenger assosiert med CAC-progresjon (P ¼ 0.286).

Pasienter med karbamyllysinrest 260 viste den høyeste økningen i CAC-volum enn pasienter uten karbamylerte rester eller karbamyllysinrester andre enn 260 (tilleggsfigur S8B).

Samlet sett indikerer dataene at post-translasjonelt karbamylert sortilin er assosiert med CAC-volum og dets progresjon hos pasienter medkronisknyresykdom.

DISKUSJON

I ulike eksperimentelle in vitro og in vivo studier og 2 uavhengige prospektive kohorter, viser vi at pasienter medkronisknyresykdomviser et spesifikt mønster av post-translasjonelle karbamylerte sortilinlysinrester i sirkulasjonen, som også kan påvises i vaskulærveggen. Videre var sortilinkarbamylering assosiert med CAC ikronisknyresykdompasienter uavhengig av alder,nyrefunksjon, og andre risikofaktorer for forkalkning. Mekanistisk kan vi vise at sortilinkarbamylering øker dens evne til å binde IL -6 og virker direkte på vaskulære celler for å fremme vaskulær forkalkning (Figur 4d). Til sammen avslørte denne studien en ny utradisjonell risikofaktor for forkalkning, som potensielt kan bidra til den høye belastningen avkardiovaskulærsykdommer ikronisknyresykdom.

Proteinkarbamylering kan formidles av cyanat, som utvikles under spontan nedbrytning av urea eller genereres av myeloperoksidase-katalysert tiocyanatoksidasjon på steder med betennelse.24 Vi viste atkronisk nyresykdompasienter med høyere ureanivåer på grunn av redusertenyrefunksjonen viste flere sortilin-karbamyleringsrester enn friske kontroller. Imidlertid fant vi ingen sammenheng mellom totale nivåer og aktivitet av myeloperoksidase og sortilinkarbamylering, noe som tyder på uremi som en primær driver for sortilinkarbamylering ikronisknyresykdom. I tillegg viser våre data at alder, NT-proBNP og et lavere inntak av aldosteronantagonister er assosiert med flere karbamylerte rester. Våre data er i samsvar med tidligere rapporter som identifiserte aldring som en signifikant mediator av proteinkarbamylering.25 Det har blitt vist at de antihypertensive medikamentene hydroklortiazid og amlodipin påvirker homocitrullinnivåer, en ureasyklusrelatert aminosyre og et karbamyleringsavledet produkt.26 Hvorvidt inntak av aldosteronantagonister senker homocitrullin, og dermed reduserer karbamylerte rester ikronisknyresykdompasienter, er ukjent. Drechsler et al. viste en korrelasjon mellom serum karbamylert albumin og NT proBNP, som var assosiert med hjertesvikt i dialyseavhengigekronisknyresykdompasienter.27 Hvorvidt karbamylering av sortilin også kan tjene som en risikofaktor for hjertesvikt er ikke kjent, men økt koronar forkalkning med potensielt påfølgende skadelige effekter på hjertefunksjonen kan forklare sammenhengen mellom karbamylerte sortilinrester og NT proBNP-nivåer i vår studie.

cistanche

Effekter av cistanche-tilskudd: behandle nyresykdommer og forbedre immuniteten

Nyere studier identifiserte rollen til sortilin i patogenesen av vaskulære og metabolske forstyrrelser, men fokuserte hovedsakelig på vevsekspresjon av sortilin i stedet for å utforske funksjonen til den løselige formen.7 Sirkulerende sortilin kan stamme fra cellulær utskillelse av deres luminale domene, som vist in vitro , 28–30, og fra utskilte sortilinpakkede ekstracellulære vesikler.9,31 Karbamylering fører til endringer i ladnings-, strukturelle og funksjonelle egenskaper til proteiner, medierende tap av funksjon og potensielt patofysiologiske cellulære og molekylære responser.5 Vi etablerte for det første tid et spesifikt lysinrest-karbamyleringsmønster for sirkulerende sortilinkronisknyresykdom, ved å bruke en målrettet MS-tilnærming, og spådde funksjonelle og strukturelle endringer ved in silico-modellering. Vi foreslår at lysinkarbamylering vil favorisere den sure pH-konformasjonen til sortilin, og påvirke den pH-avhengige ligandaffiniteten til sortilin. Tidligere krystallstrukturstudier har vist at ved pH 5,5, som representerer et miljø som ligner på det for sene endosomer, gjennomgår sortilin konformasjonsendringer og dimerdannelse, noe som gjør kjente bindingssteder utilgjengelige for ligandbinding.32,33

Lysin 260 danner en hydrogenbinding til et tyrosin av neurotensin inne i b-propelltunnelen, noe som antyder at andre ligander som binder seg på samme måte som neurotensin også vil bli påvirket. Vår undersøkelse fant økt affinitet av IL-6 til karbamylert sortilin, noe som tyder på deltakelse i IL-6-signalveier. Flere studier antydet at IL-6 kan bidra til vaskulær forkalkning ikronisknyresykdom.22,34,35 funksjonell rolle i calcific vaskulær patologi. Løselig karbamylert sortilin fremmet vaskulær forkalkning in vitro og ex vivo ved å øke osteogene målgener, TNAP-aktivitet og matrisemineralisering. Dessuten økte tillegget av IL-6 til karbamylert sortilin ytterligere osteogene målgener og TNAP-aktivitet.

Karbamylering har vært assosiert med ekstracellulær matriseendring,36 oksidativt stress,25 endoteldysfunksjoner,37 og aterosklerose,38 alle involvert i initiering og progresjon av forkalkning. Selv om Mori et al. rapporterte at proteinkarbamylering fremmer vaskulær forkalkning gjennom karbamylering av mitokondrielle proteiner,6 ble ingen spesifikke målproteiner identifisert. En fersk studie viste at karbamylering av uromodulin resulterte i tap av dets anti-kalkegenskaper in vitro. 39 Begge studiene brukte Western blot for å påvise karbamylering generelt. Vi demonstrerte at in vitro karbamylert sortilin etterligner det spesifikke in vivo lysinmodifikasjonsmønsteret som finnes ikronisknyresykdompasienter som bruker MS. Dermed gir vår studie ledetråder til spesifikke mekanismer som kobler sammenkronisknyresykdom, proteinkarbamylering, IL-6 og forkalkning.

Tidligere var høye sortilinnivåer i serum assosiert med både abdominal aortaforkalkning ogkardiovaskulærevents independent of traditional Framingham risk factors in a community-dwelling cohort of men aged >50 år.10 Hos pasienter med lav til middels risiko for brystsmerte var sortilinnivået ikke assosiert med alvorlighetsgraden av koronarsykdom.40 I denne studien kunne vi vise at pasienter medkronisknyresykdomhar høyere sortilinnivåer enn kontroller med normalnyrefunksjon. Sortilinnivåene økte ikke med redusertenyrefunksjon når en pasient hadde enkronisknyresykdommed eGFR<60 ml/min="" per="" 1.73="" m2.="" however,="" we="" observed="" an="" increase="" of="" carbamylated="" sortilin="" residues="" with="" decreased="">nyrefunksjon. Tilsvarende har Kalim et al. rapporterte ingen sammenheng mellom totalt og karbamylert albuminnivåer ikronisknyresykdompasienter.41 Sortilin karbamylering, som følge av svekketnyrefunksjon, kan ytterligere forsterke vaskulær forkalkning relatert tilkronisknyresykdom-tilknyttede mineralforstyrrelser. Vår studie har flere styrker og begrensninger. Styrker inkluderer å analysere data innhentet in vitro, ex vivo og hos pasienter som bruker forskjellige eksperimentelle tilnærminger. Den nøye karakteriseringen av pasienter medkronisknyresykdom, inkludert standardiserte spørreskjemaer for å vurdere deltakernes egenskaper, personlige studiebesøk utført av trente studiesykepleiere, og målinger av mange laboratorieverdier og forkalkning, er en spesiell styrke ved studien. Den lille kohorten kan se ut til å begrense studien vår; imidlertid brukte vi uavhengigekronisknyresykdomkohorter med oppfølgingsdata for forkalkning for å validere karbamyleringsstatusen til sortilin ved møysommelig målrettet MS. De kliniske funnene ble gjort på tyskkronisknyresykdompasienter og kan dermed begrense generaliserbarheten av funnene til andre land eller etnisiteter. Til slutt, selv om studiedesignet tillot justering for mange viktige konfoundere, kan gjenværende forvirring, som i enhver observasjonsstudie, ikke utelukkes helt.

cistanche

Effekter av cistanche: forhindre nyresvikt

Konklusjon

Avslutningsvis er dette den første studien som viser spesifikke aminosyrer som er post-translasjonelt modifisert i sirkulerende sortilin. Våre data tyder på at tilstedeværelsen avkronisknyresykdomfremmer karbamyleringen av sirkulerende sortilin og at karbamylert sortilin viser procalcific egenskaper, som demonstrert in vitro, ex vivo, og ved tilstedeværelse i forkalket vev. Sortilin karbamylering var assosiert med CAC, selv etter justering for alder,nyrefunksjon, og flere andre risikofaktorer, som tyder på at forebygging av sortilinkarbamylering kan redusere risikoen forkardiovaskulærforkalkning og dermedkardiovaskulærkomplikasjoner hos pasienter medkronisknyresykdom. Dermed peker resultatene våre på karbamylert sortilin som en bidragsyter tilkardiovaskulærsykdomsbyrde ikronisknyresykdompasienter.

cistanche