Del 3: Echinacoside isolert fra Cistanche Tubulosa stimulerer antatt veksthormonsekresjon via aktivering av ghrelinreseptoren
Mar 06, 2022
Echinacoside isolert fra Cistanche tubulosa stimulerer antatt veksthormonsekresjon via aktivering av ghrelinreseptoren
Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4,* og Jason TC Tzen 1,*
1 Graduate Institute of Biotechnology, National Chung-Hsing University, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)
2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw
3 Institutt for veterinærmedisin, National Chung-Hsing University, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw
4 Graduate Institute of Pharmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Taiwan
* Korrespondanse: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tlf.: pluss 886-4-22840328 (ekst. 776) (JTCT); Faks: pluss 886-4-22853527 (JTCT)
Akademisk redaktør: Pinarosa Avato
Mottatt: 22. januar 2019; Godkjent: 14. februar 2019; Publisert: 17. februar 2019
Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstrakt:Cistanchearter, ørkenens ginseng, har blitt registrert å ha mange biologiske aktiviteter i tradisjonell kinesisk farmakope og har blitt brukt som antialdringsmedisin. Tre fenyletanoidglykosider—echinacoside, tubulosid A og acteosid - ble påvist i vannekstraktet avCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight og hovedbestanddelen,echinacoside, ble ytterligere renset.Echinacosidemed en konsentrasjon høyere enn 10_6 M viste signifikant aktivitet for å stimulere veksthormonsekresjon av rottehypofyseceller. I likhet med veksthormonfrigjørende hormon-6, en syntetisk analog av ghrelin, ble stimuleringen av veksthormonsekresjon av echinakosid hemmet av [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substans P , en invers agonist av ghrelinreseptoren. Molekylær modellering viste at alle de tre fenyletanoidglykosidene interagerte tilstrekkelig med bindingslommen til ghrelinreseptoren, og echinakosid viste en litt bedre interaksjon med reseptoren enn tubulosid A og acteosid. Resultatene tyder på at fenyletanoidglykosider, spesielt echinacoside, er aktive bestanddeler som antas å være ansvarlige for antialdringseffektene av C. tubulosa og kan anses å utvikle seg som ikke-peptidylanaloger av ghrelin.
Nøkkelord: cistanchetubulosa;echinacoside; ghrelin; veksthormonsekresjon;fenyletanoidglykosider
echinacosideicistanchehar mange effekter
Vennligst klikk her til del 2
4. Materialer og metoder
4.1. Kjemikalier og plantematerialer
Cistanchedeserticola YC Ma ble hentet fra et lokalt marked og autentisert av Dr. Nan-Hei Lin.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight ble kjøpt fra Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, Kina). HPLC-kvalitet acetonitril, maursyre og metanol ble kjøpt fra ECHO Chemical Co., Ltd, (Miaoli, Taiwan). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), dialysert føtalt bovint serum (DFBS) og Trypsin-EDTA ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). DNase I ble kjøpt fra Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, USA). Veksthormonfrigjørende hormon-6 (GHRP-6) ble hentet fra Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA). Kollagenase type I og [D-Argl, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substans P ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Rotteveksthormon ELISA-sett ble kjøpt fra Sunred Biological Technology Corporation (Shanghai, Kina).
4.2. HPLC/UV og LC_MSn-analyser av vannekstraksjon av Cistanche spp.
Tørket stilk (25 g) avCistanchedeserticola YC Ma ellerCistanchetubulosa (Schenk) R ble ekstrahert tre ganger med 500 ml destillert vann i 60 minutter ved 50 grader i vannbad. Løsningen ble filtrert gjennom et 13 mm syrisk filter med 0,45 um PP membranfilter (Pall Corporation, Glen Cove, NY, USA), og utsatt for følgende analyser. De kjemiske bestanddelene i ekstraktene ble analysert
ved å bruke en Syncronis C18-kolonne (4,6 × 250 mm indre diameter, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) i HPLC-systemet kombinert med en modell 600E fotodiodearraydetektor (Waters Corporation,
Milford, MA, USA). Den mobile fasen besto av (A) vann inneholdende {{0}},1 prosent maursyre og (B) acetonitril. Elueringsgradienten var som følger: 0–60 min, lineær gradient fra 14 prosent B; 0–3 min, 14 prosent til 17 prosent B; 3–4 min, 17 prosent B; 4–15 min, 17 prosent til 20 prosent B; 15–20 min, 20 prosent B; 20–50 min, 20 prosent til 14 prosent B; 50–60
min, 14 prosent B. Den ultrafiolette (UV) absorbansdeteksjonsbølgelengden ble satt til 330 nm. Et lineært felle quadrupole (LTQ) tandem massespektrometer (Thermo Electron, San Jose, CA, USA) utstyrt med elektrospray ionisering (ESI) grensesnitt ble koblet til et Surveyor LC system (Thermo Electron)
med en 5 uL prøvesløyfe. Elueringsgradienten var som følger: 0–90 min, lineær gradient fra 14 prosent B; 0–24 min, 14 prosent til 17 prosent B; 24–25 min, 17 prosent B; 25–36 min, 17 prosent til 20 prosent B; 36–37 min, 20 prosent B; 37–80 min,
20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 prosent) som kollisjonsgassen.
4.3. Isolering av Echinacoside
Vannekstraktet fra den tørkede stilken (25 g) av C. tubulosa ble konsentrert under redusert trykk for å gi dyp brun sirup. Råekstraksjonen ble suspendert med destillert vann og lyofilisert med en frysetørker. Pulveret på 100 mg ble oppløst i destillert vann på 5 ml og utsatt for rensing ved bruk av Sephadex LH-20-kolonne (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sverige) eluert med 10 prosent vandig metanolløsning og overvåket med HPLC . Fraksjonene som inneholdt echinacosid ble detektert ved å lese absorbansen ved 245 nm og høstet ved å bruke en autosampler.
4.4. Dyr
Eksperimentene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved National Chung_Hsing University med godkjenningsnummeret til IACUC 106-079. Hann-Sprague_Dawley-rotter som veide 250_300 g ble kjøpt fra BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). To dyr per bur ble holdt i et kontrollert miljø med 23 o2, 60 o 10 prosent fuktighet og en 12 timers lys/mørke-syklus. Rottene ble matet med en standard chow-diett (kalorier gitt
med 28,7 prosent protein, 13,4 prosent fett og 57,9 prosent karbohydrat, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, USA) og destillert vann ad libitum.
4.5. Primær hypofysecellekultur
Hypofyseceller ble isolert i henhold til en modifisert enzymatisk dispersjonsmetode utviklet av Yamazaki et al. [29]. Kort fortalt ble Sprague Dawley-hannrotter bedøvet med Zoletil 50 (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, Frankrike), og de fremre hypofysen ble fjernet og spredt for å dyrke hypofyseceller i suspensjon, som beskrevet tidligere [30].
4.6. Veksthormonsekresjonsanalyse
De primære hypofysefremre cellene på 4 × 104 celler/brønn ble dyrket ved 37 grader under 5 prosent CO2 i 2 dager før veksthormonsekresjonsanalysen i henhold til protokollen beskrevet tidligere [30].
Etter fjerning av kulturmediet ble cellene sultet i serumfritt Dulbecco's Modifiserte Eagles medium (DMEM) i 90 minutter for å stabilisere basal hormonsekresjon. Sultmediet ble erstattet med fersk DMEM som inneholdt echinacosid (fra 10_8 til 10_5 M) eller GHRP-6 (en agonist av en human ghrelinreseptor, GHSR, 10_7 M) som en positiv kontroll, og cellene ble inkubert i 15 og 30 minutter ved 37 grader under 5 prosent CO2. For påvisning av antagonisteffekt ble cellene inkubert med en GHSR
invers agonist, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substans P (0.5 uM), og deretter behandlet med DMEM som inneholder echinacoside (10_5 M) eller GHRP-6 (10_7 M) i 30 min. Mediet ble samlet for
bestemmelse av veksthormonsekresjon av et rotteveksthormon ELISA-sett (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).
4.7. Statistisk analyse
Dataene ble presentert som middelverdier o SD. Forskjellene ble analysert med T-Test. Statistiske beregninger ble utført av GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Et nivå på p < 0.05="" ble="" ansett="" for="" å="" være="" statistisk="">
4.8. Homologimodellering og dokking
Homologimodellering og dokking til en human ghrelinreseptor, veksthormonsekretagogreseptor (GHSR, aksessnummer AAI13548), ble etablert ved å følge vår tidligere konstruksjon [21,24]. Kort fortalt ble krystallstrukturer av 1 og 2 adrenerge reseptorer (PDB 2YCY og 3PDS) med bundne ligander, cyanopindolol og FAUC50 brukt som maler for å konstruere GHSR-strukturen [31,32]. GHSR-strukturen med den laveste PDF-totalenergien ble valgt for videre dokking med GHRP-6, echinacoside, tubuloside A og acteosid. Alle modelleringsprosesser ble utført ved hjelp av Discovery Studio 2.1-plattformen (http://accelrys.com/).
3D-strukturen til GHRP-6 ble lastet ned fra Pub-Chem-sammensetningsdatabasen på NCBI-nettstedet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 3D-strukturene til echinacoside, tubulosid A og acteosid ble bygget ved hjelp av Chem3D-programmet (http://www.cambridgesoft.com/). Ligandbindingsstedet til GHSR ble definert som det sfæriske rommet med en radius på 14 Å fra midten av bindingslommen i dokkingsimuleringen. Dokking av GHRP-6, echinacosid, tubulosid A eller acteosid til bindingsstedet til GHSR ble utført i silico ved å bruke LibDock-modulen i Discover Studio 2.1-pakken og ytterligere minimert med smart minimeringsalgoritme med CHARMm kraftfelt i Oppdag Studio 2.1-pakken [33]. For å sammenligne de relative bindingsaffinitetene til echinacosid, tubulosid A og acteosid i GHSR, ble det aktive senterområdet konstruert med GHRP-6 i GHSR brukt for dokkingen, og bindingsenergien ble beregnet av GEMDOCK (The Institute of Bioinformatics , National Chiao Tung University, Taiwan).
Forfatterbidrag: Dyreforsøk, C.-JW, Y.-CL og W.-YC; Identifikasjon og rensing: MY.C., N.-HL og C.-HC; Molekylær modellering: C.-JW, Y.-CL og JTCT; Prosjektdesign og skriving: C.-HC og JTCT
Finansiering: Arbeidet ble delvis støttet av et stipend til Jason TC Tzen fra National Chung-Hsing University (NCHU-102D604).
Anerkjennelser: Forfatterne takker Tian-Shun Weng for å dele sin profesjonelle erfaring med bruk av Cistanche-arter.
Interessekonflikter: Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikter.
Referanser
1. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W. Cistanche deserticola YC Ma, "Desert ginseng": En anmeldelse. Er. J. Chin. Med. 2012, 40, 1123–1141. [CrossRef] [PubMed]
2. Wang, T.; Chen, C.; Yang, M.; Deng, B.; Kirby, MG; Zhang, X. Cistanche tubulosa etanolekstrakt medierer rottekjønnshormonnivåer ved induksjon av testikkelsteroidogene enzymer. Pharm. Biol. 2016, 54, 481–487. [CrossRef] [PubMed]
3. Lin, WY; Chun, Y.; Jack, C.; Kao, ST; Tsai, FJ; Liu, HP Molekulære veier relatert til fremme av lang levetid og kognitiv forbedring av Cistanche tubulosa i Drosophila. Fytomedisin 2017, 26, 37–44. [CrossRef]
4. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Reversering av vandige ekstrakter av Cistanche tubulosa fra atferdsmessige mangler i Alzheimers sykdomslignende rottemodell: Relevans for amyloidavsetning og sentral nevrotransmitterfunksjon. BMC-komplement. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]
5. Xuan, GD; Liu, CQ Forskning på effekten av fenyletanoidglykosider (PEG) av Cistanche deserticola på antialdring hos gamle mus indusert av D-galaktose. Zhong Yao Cai 2008, 31, 1385–1388. [PubMed]
6. Jiang, Y.; Tu, PF Analyse av kjemiske bestanddeler i Cistanche-arter. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]
7. Gao, C.; Wang, C.; Wu, G. Cistanche totale glykosider på innflytelsen av vaskulære demensrotter læring og hukommelse og mekanismeforskning. Hake. Urt. Med. 2005, 36, 1852–1855.
8. Li, F.; Yang, Y.; Zhu, P.; Chen, W.; Qi, D.; Shi, X.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Echinacoside fremmer beinregenerering ved å øke OPG/RANKL-forholdet i MC3T3-E1-celler. Fitoterapia 2012, 83, 1443–1450. [CrossRef]
9. Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH De hypokolesterolemiske effektene av Cistanche tubulosa-ekstrakt, en kinesisk tradisjonell råmedisin, hos mus. Er. J. Chin. Med. 2009, 37, 1125–1138. [CrossRef]
10. Tang, F.; Hao, Y.; Zhang, X.; Qin, J. Effekt av echinacoside på nyrefibrose ved hemming av TGF- 1/Smads signalvei i DB/DB-musemodellen for diabetisk nefropati. Drug Des. Devel. Ther. 2017, 11 2813–2826. [CrossRef]
11. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; Sol, HX; Liu, X. Antihyperglykemiske og hypolipidemiske effekter av Cistanche tubulosa i type 2 diabetiske DB/DB-mus. J. Ethnopharmacol. 2013, 150, 935–945. [CrossRef] [PubMed]
12. Bao, XX; Ma, HH; Ding, H.; Li, WW; Zhu, M. Foreløpig optimalisering av en formel for kinesisk urtemedisin basert på de nevrobeskyttende effektene i en rottemodell av rotenon-indusert Parkinsons sykdom. J. Integr. Med. 2018, 16, 290–296. [CrossRef] [PubMed]
13. Kojima, M.; Hosoda, H.; Dato, Y.; Nakazato, M.; Matsuo, H.; Kanagawa, K. Ghrelin er et veksthormonfrigjørende acylert peptid fra magen. Nature 1999, 402, 656–660. [CrossRef] [PubMed]
14. Zigman, JM; Jones, JE; Lee, CE; Saper, CB; Elmquist, JK Uttrykk av ghrelinreseptor-mRNA i rotte- og musehjernen. J. Comp. Neurol. 2006, 494, 528–548. [CrossRef] [PubMed]
15. Castaneda, TR; Tong, J.; Datta, R.; Culler, M.; Tschop, MH Ghrelin i regulering av kroppsvekt og metabolisme. Front. Nevroendokrinol. 2010, 31, 44–60. [CrossRef] [PubMed]
16. Rudman, D.; Feller, AG; Nagraj, HS; tyskere, GA; Lalitha, PY; Goldberg, AF; Schlenker, RA; Cohn, L.; Rudman, IW; Mattson, DE Effekter av humant veksthormon hos menn over 60 år. N. Engl. J. Med. 1990, 323, 1–6. [CrossRef] [PubMed]
17. Liu, H.; Bravata, DM; Olkin, I.; Nayak, S.; Roberts, B.; Garber, AM; Hoffman, AR Systematisk gjennomgang: Sikkerheten og effekten av veksthormon hos friske eldre. Ann. Turnuskandidat. Med. 2007, 146, 104–115. [CrossRef] [PubMed]
18. Giordano, R.; Bonelli, L.; Marinazzo, E.; Ghigo, E.; Arviat, E. Veksthormonbehandling i menneskelig aldring: fordeler og risikoer. Hormoner 2008, 7, 133–139. [CrossRef] [PubMed]
19. Sattler, FR Veksthormon hos den aldrende hannen. Beste praksis. Res. Clin. Endokrinol. 2013, 27, 541–555. [CrossRef]
20. Se, YH; Chen, YJ; Chang, CI; Lin, YW; Chen, CY; Lee, MR; Lee, VS; Tzen, JTC Teaghrelins, unike acylerte flavonoidtetraglykosider i Chin-shin oolong-te, er antatte orale agonister av ghrelinreseptoren.
J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5085–5091. [CrossRef]
21. Hsieh, SK; Se, YH; Wu, CC; Chung, TY; Tzen, JTC Identifikasjon av biosyntetiske mellomprodukter av teaghreliner og teaghrelinlignende forbindelser i oolong-teer, og deres molekylære docking til ghrelinreseptoren.
J. Food Drug Anal. 2015, 23, 660–670. [CrossRef]
22. Hsieh, SK; Chung, TY; Li, YC; Se, YH; Lin, NH; Kuo, PC; Chen, WY; Tzen, JTC Ginkgoghrelins, unike acylerte flavonoidglykosider i Folium Ginkgo, stimulerer veksthormonsekresjon via aktivering av ghrelinreseptoren. J. Ethnopharmacol. 2016, 193, 237–247. [CrossRef]
23. Han, L.; Mavis, BY; Liu, E.; Zhang, Y.; Li, W.; Song, X.; Fu, F.; Gao, X. Strukturell karakterisering og identifisering av fenyletanoidglykosider fra Cistanches deserticola YC Ma av UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Phytochem. Anal. 2012, 23, 668–676. [CrossRef]
24. Lu, D.; Zhang, J.; Yang, Z.; Liu, H.; Li, S.; Wu, B.; Ma, Z. Kvantitativ analyse av Cistanches Herba ved bruk av høyytelses væskekromatografi kombinert med diodearraydeteksjon og høyoppløselig massespektrometri kombinert med kjeometriske metoder. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef]
25. Moon, M.; Kim, HG; Hwang, L.; Seo, JH; Kim, S.; Hwang, S.; Kim, S.; Lee, D.; Chung, H.; Å, MS; et al. Nevrobeskyttende effekt av ghrelin i 1-metyl-4-fenyl-1, 2, 3, en 6-tetrahydropyridinmusemodell av Parkinsons sykdom ved å blokkere mikroglial aktivering. Neurotox. Res. 2009, 15, 332–347. [CrossRef]
26. Lupien, SJ; Isabelle, OM; Hupbach, A.; Tu, MT; Buss, C.; Walker, D.; Pruessner, J.; Mcewen, BS Utover stresskonseptet: Allostatisk belastning - Et utviklingsbiologisk og kognitivt perspektiv. I utviklingspsykopatologi: bind to: utviklingsnevrovitenskap; John Wiley & Sons, Inc.: New York, NY, USA, 2015; s. 578–628.
27. Rizzo, M.; Rizvi, AA; Sudar, E.; Soskic, S.; Obradovic, M.; Montalto, G.; Boutjdir, M.; Mikhailidis, DP; Isenovic, ER En gjennomgang av de kardiovaskulære og anti-aterogene effektene av ghrelin. Curr. Pharm. Des. 2013, 19, 4953–4963. [CrossRef]
28. Holst, B.; Lang, M.; Brandt, E.; Bach, A.; Howard, A.; Frimurer, TM; Beck-Sickinger, A.; Schwartz, TW Ghrelin reseptor inverse agonister: Identifikasjon av en aktiv peptidkjerne og dens interaksjonsepitoper på reseptoren. Mol. Pharmacol. 2006, 70, 936–946. [CrossRef]
29. Yamazaki, M.; Nakamura, K.; Kobayashi, H.; Matsubara, M.; Hayashi, Y.; Kanagawa, K.; Sakai, T. Reguleringseffekt av ghrelin på veksthormonsekresjon fra perfuserte rottehypofyseceller. J. Neuroendocrinol. 2002, 14, 156–162. [CrossRef]
30. Se, YH; Chen, YJ; Chung, TY; Lin, NH; Chen, WY; Chen, CY; Lee, MR; Chou, CC; Tzen, JTC Emoghrelin, et unikt emodinderivat i Heshouwu, stimulerer veksthormonsekresjon via aktivering av ghrelinreseptoren. J. Ethnopharmacol. 2015, 159, 1–8. [CrossRef]
31. Moukhametzianov, R.; Warne, T.; Edwards, PC; Serrano-Vega, MJ; Leslie, AG; Tate, CG; Schertler, GF To distinkte konformasjoner av helix 6 observert i antagonistbundne strukturer til en beta1-adrenerg reseptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 8228–8232. [CrossRef]
32. Rosenbaum, DM; Zhang, C.; Lyons, JA; Holl, R.; Aragao, D.; Arlow, DH; Rasmussen, SG; Choi, HJ; Devree, BT; Sunahara, RK; et al. Struktur og funksjon av et irreversibelt agonist-beta(2) adrenoceptorkompleks. Nature 2011, 469, 236–240. [CrossRef]
33. Brooks, BR; Bruccoleri, RE; Olafson, BD; stater, DJ; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM—Et program for makromolekylær energi, minimering og dynamikkberegninger. J. Comput. Chem. 1983, 4, 187–217. [CrossRef]
