DelⅡ: Dereplikasjonsveiledet isolering av nye fenylpropanoid-substituerte diglykosider fra Cistanche Salsa og deres hemmende aktivitet på NO-produksjon i makrofager
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
En 3-metylbutenylgruppe, en aglykonsubstruktur, ble foreslått av COZY-korrelasjonene til H-2 med H-1a og H-1b og HMBC-korrelasjonene mellom H{{ 4}} og H-5 og de olefiniske karbonene, ved kC 120,7 (C-2) og 136,4 (C-3). To sukkerdeler ble etablert ved NMR-spektraanalyse og HPLC-spektraanalyse av syrehydrolysatet, med MS-fragmentmønster. Den absolutte konfigurasjonen av dem ble bestemt til å være D-glukose og L-rhamnose ved bruk av HPLC-analyse av syrehydrolysatet [17]. Disse sukkerdelene ble definert som en -glukose og en a-rhamnose ved koblingskonstanter for de anomere protonene. 1H-1H COSY-spekteret viste sekvensielle korrelasjoner fra H-13 til H-63 og fra H-133 til H-633 (figur 4).
Et nedskiftet glukoseproton ved kH 4,70 (H-43) antydet en acylsubstituent på glukose. Fra HMBC-spekteret bekreftet korrelasjonen mellom H-43 og C-9333 posisjonen til kaffeoylsubstituenten. HMBC-korrelasjonene mellom H-13 og C-1 (kC 64,5) og mellom H-33 (kH 3,68) og C-133 (kC 101,2) antydet posisjonene til hver substituent . Følgelig ble strukturen til 6 bestemt som 3-metylbutenyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-kaffeoyl- -D- glukose-pyranosid og kalt cistansalside B.
Cistansalside C (12), et brunt amorft pulver, ble bestemt til å ha en molekylformel på C26H38O13 ved (pluss)-HR-ESI-QTOF-MS, som viste en topp ved m/z 581,2213 [M pluss Na] pluss (kalk. for C26H38O13Na, 581,2205). Et karakteristisk ion ved m/z 163 antydet at en kaffeoylsubstituent eksisterte i strukturen. Fragmentionene ved m/z 325 og m/z 471 antydet eksistensen av en rhamnoseenhet og en glukoseenhet.
Sammenligning av NMR-spektrene på 12 med de på 6 viste at de var like bortsett fra aglykonstrukturen. I NMR-spektrene på 12 ble to parafiniske karboner ved kC 38.0 (C-2) og 24.4 (C-3) observert i stedet for to olefiniske karboner ved kC 12{{16 }}.7 (C-2) og 136.4 (C-3) i aglykonet på 6. De germinale metylgruppene (kH 0.88) i aglykonet på 12 ble forskjøvet oppover feltet i forhold til H-4 og H-5 (kH 1,71 og 1,63) i aglykonet på 6 (tabell 2). Aglykonet av 12 ble foreslått å være en 3-metylbutylgruppe, noe som ble bekreftet av 1H og COSY NMR-spektrene. Topper av 3-metylbutylgruppen ble observert ved 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m) , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) og 0,88 (H-4, 5).
To sukkerdeler ble bekreftet ved HPLC-analyse av syrehydrolysatet og NMR-spektraanalysen samt MS-fragmentmønster. De absolutte konfigurasjonene av sukkerene ble identifisert som D-glukose og L-rhamnose ved bruk av HPLC-analyse av syrehydrolysatet [17]. En -glukosedel og en a-rhamnosedel ble bekreftet ved koblingskonstanter for de anomere protonene. 1H-1H COSY-spekteret viste sekvensielle korrelasjoner fra H-13 til H-53, fra H-133 til H-333 og fra H{{11} } til H-433 (Figur 4).
Posisjonen til substituenter ble bekreftet ved hjelp av HMBC-analysen. I HMBC-spekteret er korrelasjonene mellom H-13 og C-1 (kC 67,2), mellom H-33 (kH 3,68) og C-133 (kC 101,2) og mellom H-43 (kH 4,70) og C-9333 (kC 165,7) ble påvist. Følgelig ble strukturen til 12 etablert å være 3-metylbutyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-kaffeoyl- -D-glukose-pyranosid og kalt cistansalside C.
Cistansalside D (17), et amorft brunt pulver, ble bestemt til å ha en molekylformel av C31H38O14 ved positiv modus høyoppløselig ESI-QTOF-MS, som viste en adduksjons-topp ved m/z 657,2147 [M pluss Na] pluss (beregnet for C31H38O14Na, 657,2154). Fragmentioner inkludert et [M pluss H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] pluss ion ved m/z 147, et [M pluss H x Aglycone x Rha] pluss ion ved m/z 351 og et [M pluss H x Aglycone] pluss-ion ved m/z 497 ble også påvist. Et karakteristisk ion ved m/z 147 antydet at en kumaroylsubstituent var tilstede i strukturen. Fragmentionene ved m/z 351 og m/z 497 antydet eksistensen av en rhamnoseenhet og en acetylsubstituert glukoseenhet.
Cistansalside fracistanche urt
13C-NMR-spekteret avslørte tilstedeværelsen av 31 karbonatomer. To anomere protoner ved kH 4,61 (1H, m, H-13) og 4,60 (1H, s, H{{10}}) ble observert i 1H- og HSQC-spektrene . 1H-NMR-spekteret indikerte tilstedeværelsen av en metylgruppe ved 1,97 (3H, s, acetyl-CH3), en trans-olefin ved kH 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{ 25}}) og 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) og to para-substituerte benzenringer ved kH 7,53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) og 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H-2333, 6333)/kH 6,98 (2H, d, J {{5 0}},0 Hz, H-2, 6) og 6,65 (2H, d, J=8,0 Hz, H-3, 5) (tabell 2) . Fra HMBC NMR-spekteret, korrelasjonene mellom et karbonylkarbon ved kc 165,5 (C-9333) og H-8333 og mellom H-2333, 6333 og C-7333 (kc 145,4) foreslo en (E)-kumaroylgruppe. HMBC-korrelasjonen mellom en metylprotontopp og et karbonylkarbon ved kc 169,0 bekreftet tilstedeværelsen av en acetylgruppe.
En 4-hydroksyfenylgruppe ble foreslått basert på HMBC-korrelasjonene mellom H-3, 5 og kvaternære aromatiske karboner ved kC 155,6 (C-4) og 128,6 (C-1) . En hydroksylert etylgruppe ble bekreftet av COSY NMR-signalene ved kH 2,66 (2H, t, J=6,1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a ) og 3,54 (1H, m, H-8b). HMBC-korrelasjonene mellom H-7 og C-1 (kC 128,6) og C-2, 6 (kC 129,7) antydet en 4-hydroksyfenyletylgruppe, som en aglykonsubstruktur.
To sukkerdeler, foreslått fra MS-fragmentmønster, ble bekreftet på nytt ved HPLC-analyse av syrehydrolysatet og NMR-spektra. D-glukose og L-rhamnose ble belyst ved hjelp av HPLC-analyse av syrehydrolysatet [17]. En -glukosedel og en a-rhamnosedel ble etablert ved koblingskonstanter for de anomere protonene. 1H-1H COSY-spekteret viste sekvensielle korrelasjoner fra H-13 til H-53 og fra H-133 til H-633 (figur 4).
Fra 1H-NMR-spekteret antydet nedfeltforskyvningen av H-23 (kH 4,69) og H-43 (kH 4,80) den acyl-substituerte posisjonen på glukose. Forbindelsene mellom glukose og to acylgrupper ble bekreftet av HMBC-korrelasjonene mellom H-43 (kH 4,80) og C-9333 og mellom H-23 og karbonylkarbon i en acetylgruppe (kC 169,0 ). Posisjonene til en aglykon og rhamnose ble gitt av HMBC-korrelasjonene mellom H-33 (kH 3,95) og C-1333 og mellom H-8 og C-13. Følgelig ble strukturen til 17 tildelt som 4-hydroksyfenyletyl-2-O-acetyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- coumaroyl- -D-glukopyranosid og kalt cistansalside D.
Cistansalside E (18) ble isolert som et amorft brunt pulver. Dens molekylformel ble bestemt til å være C31H38O14 ved 13C-NMR-data og den positive modus høyoppløselige ESI-QTOF-MS-toppen ved m/z 657.2166 [M pluss Na] pluss (beregnet for C31H38O14Na, 657.2154). I tillegg ble fragmentioner inkludert et caffeoylion ved m/z 163, et [M pluss H x Aglycone x Rha] pluss ion ved m/z 367 og et [M pluss H x Aglykon]ion ved m/z 513 også påvist. Fragmentionene antydet eksistensen av en rhamnoseenhet og en acetylsubstituert glukoseenhet.
1H-NMR-spekteret antydet tilstedeværelsen av to anomere protoner ved kH 4,63 (1H, d, J=8,2 Hz, H-13) og 4,60 (1H, s, H-133 ) og to acyl-substituerte glukoseprotoner ved kH 4,71 (1H, dd, J=8.9, 8,2 Hz, H-23) og 4,81 (1H, dd, J=9.7 , 9,5 Hz, H-43). 1H- og HMBC-spektrene antydet eksistensen av en acetylgruppe ved kH 1,94 (3H, s, acetyl-CH3), en (E)-kaffeoyldel ved kH 7,48 (1H, d, J=15,9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8.1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8,1 Hz, H-5333) og 6,21 (1H, d, J=15,9 Hz, H{ {67}}) og en mono-substituert benzenring ved kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) og 7,20 (1H, m, H-4) (tabell 2). En fenylmetylgruppe, en aglykonsubstruktur, ble foreslått av HMBC-korrelasjonene mellom H-7 (2H, kH 2.80, m) og C-1 (kC 138.8) og mellom H-7 og C -2, 6 (kC 128,9) og COSY NMR-signalene til H-7 med H-8a (1H, kH 3,99, m) og H-8b (1H, kH 3,63, m).
To sukkerdeler ble bekreftet ved HPLC-analyse av syrehydrolysatet og NMR-spektraanalyse. De absolutte konfigurasjonene av sukkerene ble belyst ved hjelp av HPLC-analyse av syrehydrolysatet, som ble bekreftet å være D-glukose og L-rhamnose [17]. En -glukosedel og en -rhamnosedel ble etablert ved koblingskonstanter for de anomere protonene. 1H-1H COSY-spekteret viste sekvensielle korrelasjoner fra H-13 til H-53, fra H-133 til H-233 og fra H{{11} } til H-333 (Figur 4).
Fra HMBC-spekteret er korrelasjonene mellom H{{0}} og C-8 (kC 69,4), mellom H-23 og karbonylkarbon i en acetylgruppe (kC 169,1), mellom H-33 (kH 3,95) og C-133 (kC 102,0) og mellom H-43 (kH 4,81) og C-9333 (kC 165,6) bekreftet posisjonen til substituenter i strukturen. Derfor ble strukturen til 18 bestemt til å være fenyletyl-2-O-acetyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-kaffeoyl- -D-glukopyranosid og kalt cistansalside E.
De fleste av trans-cinnamoyl-substituentene ble isomerisert til cis-isoformen in vitro. Lys har blitt rapportert å konvertere trans-kanelsyrederivater til cis-isoformer [18,19]. Likevekten for trans-cis-omdannelsen av cinnamoyl-substituentene ble observert å opprettholde omtrent 70 prosent av isolatene i trans-isoformen. For olefinprotonene i cis-formen, topper ved omtrent 6,90 ppm(d, J=12~13 Hz, H-7333) og 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) kunne tilordnes i 1H-NMR-spektrene, mens topper ved omtrent 7,55 ppm (d, J=15,8 Hz, H-7333) og 6,40 ppm (d, J { {28}}.8 Hz, H-8333) ble observert for transformasjon [20]. I 1H-NMR-spekteret av trans-cis-blandinger ble topper for to olefiniske protoner (H-7333 og H-8333) observert i forholdet 7:3 (trans:cis). 13C-NMR-topper av cis-formen var lik de for transformasjonen.
Effektive ingredienser fra cistanche: akteosider
Alle isolatene ble testet for deres hemmende effekter på LPS-indusert NO-produksjon i RAW
Alle isolatene ble testet for deres hemmende effekter på LPS-indusert NO-produksjon i RAW 264.7-celler. Deksametason ble brukt som en positiv kontroll og dens IC50 var 7.0 uM. Av de testede forbindelsene, forbindelser 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) og 18(IC50 27.9 o 0.8 uM) viste moderate hemmende aktiviteter på induserbar NO-syntase, mens de andre forbindelsene var inaktive i denne analysen (IC50 verdier > 100 uM). For å verifisere om disse forbindelsene hadde cytotoksisitet, ble cellelevedyktighet målt ved å bruke MTT-analyse. Som et resultat viste ingen av dem signifikant cytotoksisitet (tilleggsfigur S6-1). Disse fire forbindelsene ble valgt for å evaluere for deres hemmende aktivitet mot NF-λB-veien i LPS-stimulerte RAW 264.7-celler. Stimulering av RAW 264.7-celler med LPS induserte fosforylering av I入B og NF-入B (p65) etter 0,5 timers inkubering. Fosforyleringen av NF-入 B (p65) ble signifikant redusert ved forbehandling med forbindelsene 11, 13 og 18 som vist ved western blot-analyse (figur 5). Derfor kan forbindelsene 11, 13 og 18 utøve anti-inflammatoriske effekter via hemming av NF-入B i makrofager.
Figur 5.Effekt av fire forbindelser på fosforylering av I入B og NF-入B (p65) i LPS-stimulerte RAW 264.7-celler. (A) Western blottene ble utført i LPS og prøvebehandlede RAW 264.7-celler; (B, C) Immunoblot-signalene ble kvantifisert ved bruk av Molecular Analyst/PC densitometri-programvare (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Densitometrisk analyse av fosforylerte isoformer er rapportert. NF-入 B i RAW 264.7 celle ble normalisert til innholdet av -aktin.
3. Materialer og Metoder
3.1. Generelt eksperiment Fremgangsmåte
Optiske rotasjoner ble målt med et Jasco P-2000 digitalt polarimeter (Jasco, Tokyo, Japan). UV-spektre ble registrert på et Chirascan pluss Circular Dichroism-spektrometer (Chirascan, APL, UK). IR-spektra ble registrert med Jasco FT/IR-4200-spektrofotometer. Høyoppløselig elektrosprayionisering kvadrupol-time-of-flight massespektrometri (HR-ESI-qTOF-MS) ble utført på en Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS utstyrt med Agilent 1260 Infinity-serien (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA), og kolonnen som ble brukt var en Jasco SFCpak Crest C18T-5 kolonne (id 150 4.6 mm, 5 um). MassHunter Workstation Software ble brukt til datainnsamling.
1D (1H og 13C) og 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR-spektra ble oppnådd med en Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japan), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 og Bruker AVANCE 800 HD-spektrometre kombinert med en kryoprobe (Bruker, Ettlingen, Tyskland). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, i Cistanche Andover, MA, USA) ble brukt som NMR-løsningsmiddel og referansetopper (kH 2,50 og kC 39,5). Kolonnekromatografi (CC) ble utført ved bruk av Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Sverige) eller Kieselgel 60 silikagel (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt , Tyskland). Tynnsjiktskromatografi (TLC) ble utført på forhåndsbelagte Kieselgel 60 silikagel F254-plater (Art. 5715; Merck). Flekker på TLC ble detektert ved bruk av en UV-lampe ved 254 nm og 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Frankrike). Medium trykk væskekromatografi (MPLC) ble utført på en RediSep 120 g silika flash kolonne (Isco, Lincoln, NE, USA) og Kiesegel 60 silikagel (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck) ved bruk av en Combiflash-ledsager (Isco). Høytrykksvæskekromatografisystemet (HPLC) var en Gilson HPLC utstyrt med en Gilson 321-pumpe og UV.VIS 151-detektor (Gilson, Middleton, WI, USA), ved bruk av semi-preparative ODS-kolonner (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Tyskland; Inno C18 kolonne 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Det analytiske RP-HPLC-systemet var et Waters 2695 alliansesystem med en 996 Photodiode Array (PDA)-detektor (Waters Corp, Milford, MA, USA), og kolonnen som ble brukt var en Hypersil™ BDS C18-kolonne (130 Å, id 150: 4,6) mm, 5 um, Thermo Scientific™). Maursyre ble kjøpt fra Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seoul, Korea). Løsemidler av HPLC-kvalitet ble kjøpt fra Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Korea). H2SO4, Na2CO3 og førsteklasses løsemidler for ekstraksjon, fraksjonering og isolering ble kjøpt fra Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seoul, Korea). L- og D-cystein-metylesterhydroklorid og o-tolylisothiocyanat ble kjøpt fra Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan).
3.2. Anlegg Materiale
Hele plantene avCistanche salsa, som ble samlet inn fra Shinjang Uyghur, ble importert gjennom Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Korea). De ble identifisert av prof. Dr. Jehyun Lee (Dongguk University, Seoul, Korea). Kupongprøven (SNUPH2016-03) ble deponert i Herbarium of Medicinal Plant Garden, College of Pharmacy, Seoul National University.
3.3. Utvinning og Isolering
De tørkede hele plantene avCistanche salsa(5,7 kg) ble hakket og ekstrahert tre ganger med MeOH (20 L) ved romtemperatur med sonikering i 99 min. Etter fjerning av løsningsmidlet i vakuum, ble råekstraktet (1,35 kg) suspendert i H2O (5 L), deretter fordelt med EtOAc (5 L). EtOAc-resten (55,3 g) ble separert i 16 fraksjoner (E01-16) på silikagelkromatografi under eluering med CHCl3/MeOH (50:1–0:1, trinn-gradientsystem).
E08 (611,7 mg) ble utsatt for silikagel middels trykk væskekromatografi (25 g) og eluert med CHCl3/MeOH (18:1–0:1, trinn-gradientsystem) og ga 11 brøker (E08a-k). Fra E08g ble forbindelsene 13 (0,7 mg) og 18 (0,6 mg) renset ved bruk av en Luna 5 um HPLC-kolonne og isokratisk eluering med 28 prosent aq. MeCN. HPLC-rensing (Hypersil GOLD, 25 prosent aq. MeCN) av E08h (138,5 mg) ga forbindelsene 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) og 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) ble ytterligere renset på en silika-MPLC-kolonne (20 g) under eluering med CHCl3/MeOH (10:1–0:1, trinn- gradientsystem) for å gi 11 underfraksjoner (E09a-k). E09e (398,7 mg) ble utsatt for Sephadex LH-20 (MeOH) og ga åtte underfraksjoner (E09e1-8). E09e6 ble deretter renset ved å bruke en Hypersil GOLD HPLC-kolonne (22 prosent aq. MeCN) for å gi forbindelse 11 (0,4 mg). Fra E09e7 ble forbindelse 5 (0,6 mg) renset ved isokratisk eluering fra en Luna 5 um HPLC-kolonne med 40 prosent aq. MeOH.
E10 (1,20 g) ble separert i ni fraksjoner (E10ai) på Sephadex LH-20 kolonne under eluering med MeOH. Fra E10g (147,5 mg), ble forbindelsene 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) og 15 (5,0 mg) isolert ved HPLC-separasjon (Inno, 23 prosent aq. MeCN). Fraksjon E10h (470,0 mg) ble renset på en Hypersil GOLD-kolonne ved isokratisk eluering (40 prosent vandig MeOH) for å gi forbindelsene 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) og 16 (3,0 mg).
E11 (2,96 g) ble utsatt for Sephadex LH-20 under eluering med MeOH for å gi ni fraksjoner (Ella-i). E11e ble separert med Sep-Pak C18-patron som eluerte trinnvis med 10 prosent, 20 prosent, 30 prosent, 50 prosent og 100 prosent aq. MeOH for å gi syv fraksjoner (E11e1-7), etterfulgt av Luna 5 um HPLC (28 prosent vandig MeCN) for å gi forbindelsene 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) og 12 (1,2 mg).
E12 (19,0 g) ble utsatt for silika MPLC (120 g) ved bruk av et CHCl3/MeOH trinn-gradientsystem for å gi seks fraksjoner (18:1–0:1 , E12a-f). E12f ble kromatografert på en Sephadex LH-20 kolonne (MeOH), og ga syv fraksjoner (E12f1-7). HPLC-rensing (Hypersil GOLD, 25 prosent aq. MeCN) av E12f7 ga forbindelse 2 (3,3 mg). Alle løsningsmidler brukt for HPLC var 0,05 prosent maursyrebuffer. Den vanlige strømningshastigheten for HPLC- og MPLC-kromatografi var henholdsvis 3 og 40 ml/min.
3.4.Karakterisering
Cistansalside A (5): brunt amorft pulver; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (ren) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) og 13C-NMR (200 MHz) data, se tabell 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M pluss Na] pluss 645,2146 (beregnet for C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalside B (6): brunt amorft pulver; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (ren) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1H-NMR (500 MHz) og 13C-NMR (125 MHz) data, se tabell 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M pluss Na] pluss 579,2054 (beregnet for C26H36O13Na, 579,2048).
Cistansalside C (12): brunt amorft pulver; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (ren) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) og 13C-NMR (200 MHz) data, se tabell 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M pluss Na] pluss 581,2213 (beregnet for C26H38O13Na, 581,2205).
Cistansalside D (17): brunt amorft pulver; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (ren) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; 1H-NMR (400 MHz) og 13C-NMR (75 MHz) data, se tabell 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M pluss Na] pluss 657,2147 (beregnet for C31H38O14Na, 657,2154).
Cistansalside E (18): brunt amorft pulver; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (ren) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) og 13C-NMR (200 MHz) data, se tabell 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M pluss Na] pluss 657,2166 (beregnet for C31H38O14Na, 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analyse
Kromatografisk massespektrometrianalyse ble utført på et Agilent 1260 Infinity series LC-system (Agilent Technologies, Inc., USA). Den analytiske kolonnen var en SFCpak Crest C18T-5 kolonne (id 15{{10}}: 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japan). Den mobile fasen besto av 0,1 prosent (v/v) maursyre i MeCN (A) og vann (B) ved bruk av en gradienteluering på 0–35 minutter (23 prosent A), 35–45 minutter ( 23–28 prosent A), 45–75 min (28 prosent A) og 75–80 min (90 prosent A). Strømningshastigheten ble holdt på 0,3 ml/min. Absorbansen ble målt ved 320 nm. Betingelsene for ESI-kilden var som følger: strømningshastighet for tørkegass (N2), 10 l/min; tørkegasstemperatur, 350 grader; forstøver, 30 psig; kappegassstrømningshastighet, 12,0 l/min; kappegasstemperatur, 350 grader; kapillær, 4000 V; skimmer, 60 V; oktapol RF, 750 V; fragmentorspenning, 180 V; positiv modus. Systemet ble operert under Masshunter arbeidsstasjonsprogramvare. Masseområdet ble satt til m/z 50–1000.
3.6. Syre Hydrolyse
Forbindelsene ble hydrolysert ved å bruke 1 N H2SO4 (100 uL) oppvarmet med et vannbad ved 90 grader i 2 timer, deretter nøytralisert med mettet vandig Na2CO3-løsning. Etter at løsningene var tørket under en strøm av N2, ble produktene og standardsukker (D-Glc, L-Glc, L-Rha) oppløst i pyridin (100 ul) inneholdende L-cystein-metylesterhydroklorid (0,5 mg). En L-rhamnoseprøve ble oppløst i pyridin (100 ul) inneholdende D-cystein-metylesterhydroklorid (0,5 mg). Etter det ble de varmet opp til 60 grader i 1 time. Løsningene ble behandlet med 1 uL (1,11 mg) o-tolylisothiocyanat, som ble oppvarmet igjen ved 60 grader i 1 time. Hver endelig blanding ble direkte analysert ved analytisk RP-HPLC (Hypersil™ BDS C18 kolonne, 17 prosent vandig MeCN, 0,8 ml/min, 40 minutter, 35 grader). tR for toppen ved 21,9 og 40,4 minutter falt sammen med den for tiokarbamoyltiazolidinderivatet av henholdsvis D-glukose og L-rhamnose.
3.7. Celle Kultur
Murine makrofager, RAW 264.7, ble hentet fra Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Daejeon, Korea), og dyrket i RPMI-medium inneholdende 10 prosent føtalt bovint serum og 100 U/mL penicillin/streptomycinsulfat. Celler ble inkubert i en fuktet 5 prosent CO2 atmosfære ved 37 grader.
3.8.Medikamenter og kjemikalier
RPMI, penicillin og streptomycin ble kjøpt fra HyClone (Logan, UT, USA). Bovint serumalbumin og LPS ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA).
3.9.Måling av NO-produksjon
Nitrittkonsentrasjonen i kulturmediet ble målt som en indikator på NO-produksjon i henhold til Griess-reaksjonen. Cellene ble sådd ved 2:105 celler/brønn i 96-brønnkulturplater. Etter pre-inkubering av RAW 264.7-cellene i 18 timer, ble cellene forbehandlet med forbindelser (50 uM, 10 uM, 5 uM eller 1 uM) og stimulert med LPS (500 ng/ml) i 24 h. Testforbindelser oppløst i DMSO. Celler ble også behandlet med 0,05 prosent DMSO som bærerkontroll. RAW 264,7 celler (2: 105 celler/brønn) ble dyrket i 96-brønnplater ved bruk av RPMI uten fenolrødt og forbehandlet med prøver i 0,5 time. Cellulær NO-produksjon ble indusert ved tilsetning av 500 ng/ml sluttkonsentrasjon LPS og en 24 timers inkubering. Etter inkubering ble 100 ul kondisjonert medium blandet med samme volum av Griess-reagens og inkubert i 15 minutter. Absorbansen til blandingen ved 540 nm ble målt med en ELISA mikroplateleser (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). Verdiene som ble oppnådd ble sammenlignet med de for standardkonsentrasjoner av natriumnitritt oppløst i RPMI, og konsentrasjonene av nitritt i det kondisjonerte mediet til prøvebehandlede celler ble beregnet.
3.10.3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analyse for cellelevedyktighet
Celler ble sådd i {{0}}brønnplater med en tetthet på 5:104 celler/brønn og inkubert med serumfritt medium i nærvær av prøver. Testforbindelser oppløst i DMSO. Celler ble også behandlet med 0,05 prosent DMSO som bærerkontroll. Etter inkubering i 24 timer ble 10 uL MTT (5 mg/ml i saltvann) tilsatt og inkubasjonen ble fortsatt i ytterligere 4 timer. Mitokondriell succinatdehydrogenase i levende celler konverterer MTT til synlige formazankrystaller under inkubering. Formazankrystallene ble deretter solubilisert i dimetylsulfoksid og absorbansen ble målt ved 540 nm ved bruk av en enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) mikroplateleser (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Relativ cellelevedyktighet ble beregnet sammenlignet med absorbansen til den ubehandlede kontrollgruppen. Alle forsøk ble utført i tre eksemplarer.
3.11.Immunoblotanalyse
Proteinekspresjon ble vurdert ved western blotting i henhold til standardprosedyrer. Kort fortalt ble RAW264.7-celler dyrket i 6{{20}} mm kulturskåler (2:106/ml), etterfulgt av forbehandling av 50 uM forbindelser . Celler ble vasket to ganger i iskald PBS (pH 7,4), cellepelletene ble resuspendert i lyseringsbuffer på is i 15 minutter, og celleavfall ble deretter fjernet ved sentrifugering. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalysereagens i henhold til produsentens instruksjoner. Protein (20–30 ug) ble blandet 1:1 med 2: prøvebuffer (20 prosent glyserol, 4 prosent SDS, 10 prosent 2- ME, 0,05 prosent bromfenolblått og 1,25 M Tris [pH 6,8]), lastet på 8 eller 15 prosent SDS-PAGE geler, og kjørt ved 150 V i 90 min. Cellulære proteiner ble overført til Immunoblot polyvinylidendifluoridmembraner (Bio-Rad) ved bruk av et Bio-Rad halvtørt overføringssystem i henhold til produsentens instruksjoner. Membranene ble deretter inkubert over natten med de respektive p-NF-入B, NF-入B, pI入B og -aktin primære antistoffer (Abcam, Cambridge, UK) i Tris-bufret saltvann inneholdende 5 prosent skummet melk og 0,1 prosent Tween 20. Dagen etter ble blottene vasket tre ganger med Tris-bufret saltvann (0,1 prosent Tween 20) og inkubert i 1 time med et HRP-konjugert sekundært anti-IgG-antistoff (fortynnet 1:2000–1 :20 000). Blottene ble vasket igjen tre ganger med Tris-bufret saltvann (0,1 prosent Tween 20), og immunreaktive bånd ble utviklet ved bruk av det kjemiluminescerende substratet ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).
3.12.Statistisk analyse
Eksperimentelle data presenteres som gjennomsnittet av SEM. Nivået av statistisk signifikans ble bestemt ved variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Dunnetts t-test for flere sammenligninger.p Verdier mindre enn 0.05 ble ansett som signifikante.
Cistanche salsa ekstrakt
4. Konklusjoner
I denne studien isolerte og belyste vi strukturene til fem nye fenylpropanoid-substituerte glykosider, kalt cistansalside AE (5, 6, 12, 17 og 18), i tillegg til å isolere og identifisere 13 kjente forbindelser ved å bruke en dereplikasjonsstrategi. De kjente forbindelsene ble bestemt til å være lipedosid AI (1) [21], 23-acetylakteosid (2) [22], issocistanosid C (3) [15], osmanthusid B (4) [21], epimeridinosid A ( 7) [15], cistanosid D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubulosid E (10) [16], cistanosid M (11) [15], isomartynosid (13) [24], salsaside C (14) [6], jionosid C (15) [25] og salsaside F (16) [6]. Deres strukturer ble etablert gjennom analyse av omfattende spektroskopiske data og ved sammenligning med rapporterte data i litteraturen. Det ble bekreftet at foreløpig forutsagte strukturer av fenylpropanoid-substituerte glykosider var korrekt tilpasset deres virkelige strukturer.
Fordel med Cistanche salsaekstrakt
Referanser
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Undertrykkelse av SOS-induserende aktivitet av Trp-P-1 av fettsyrer fra Cistanche-salsa i Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu-testen. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Anti-spredningseffekter av Cistanches salsa på progresjonen av godartet prostatahyperplasi. Kan. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Rapid Discrimination of Herba Cistanches ved flertrinns infrarød makrofingeravtrykk kombinert med myk uavhengig modellering av klasseanalogi (SIMCA). Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Differensiering av Herba Cistanches ved fingeravtrykk med høyytelses væskekromatografi-diodearraydeteksjon-massespektrometri. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Studies on the Constituents of Cistanchis Herba. V. Isolering og strukturer av to nye fenylpropanoidglykosider, cistanosider E og F. Chem. Pharm. Okse. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6. Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Nye glykosider fra Cistanche salsa. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Komposisjonsstudie av fenoliske forbindelser av Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, som vokser i republikken Kasakhstan. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Forbedret akkumulering av fenyletanoidglykosider ved forløpermating til suspensjonskultur av Cistanche-salsa. Biochem. Eng. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, H. Cistanche salsaekstrakt virker på samme måte som proteinbundet
polysakkarid-K (PSK) på ulike typer cellelinjer. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Fenyletanoidglykosider fra Cistanches salsa hemmer apoptose indusert av 1-metyl-4-fenylpyridiniumion i nevroner. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11. Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Nye konsepter, eksperimentelle tilnærminger og derepliseringsstrategier for oppdagelsen av nye fytoøstrogener fra naturlige kilder. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12. De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Derepliseringsveiledet isolasjon av depsides theaflavins ST og lecanora DF fra den endofytiske soppen Setophoma sp. Fytokjemi 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13. Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Hill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Antiproliferative og antiplasmodiale forbindelser fra utvalgte Streptomyces-arter. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14. Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Derepliseringsveiledet isolering av nye hepatobeskyttende triterpenoid-saponiner fra Celosiae Semen ved høyytelses væskekromatografi kombinert med elektrosprayionisering tandem kvadrupol-time-of-flight massespektrometri. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15. Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. LTQ-Orbitrap-basert strategi for tradisjonell kinesisk medisin målrettet klasseoppdagelse, identifisering og hennes omics-forskning: En casestudie på fenyletanoidglykosider i tre forskjellige arter av Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. The Constituents of Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Isolering og strukturer av et nytt fenyletanoidglykosid og et nytt neolignglykosid. Chem. Pharm. Okse. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Facile Discrimination of Aldose Enantiomers by Reversed-Phase HPLCistancheChem. Pharm. Okse. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Studie av cis-kanelsyre i Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Biochem. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19. Kahnt, G. Trans-Cis-likevekt av hydroksykanelsyrer under bestråling av vandige løsninger ved forskjellig pH. Phytochemistry 1967, 6, 755–758. [CrossRef]
