Fenyletanoide glykosider fra Paraboea Martinii beskytter rottefeokromocytom (PC12) celler fra hydrogenperoksid-indusert celleskade
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Xue Gong†a , Yan Xu†b , Kai Renc , Xiaorong Baid
Oksidativt stress er kjent for å spille en viktig rolle i patogenesen av flere sykdommer. Det er knyttet til etiologien til Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), epilepsi og andre sykdommer [1–3]. For tiden har det blitt gjort stadige fremskritt i studiet av patogenesen av AD, PD og andre sykdommer. På grunn av den begrensede kunnskapen om de molekylære mekanismene som ligger til grunn for AD, PD og andre sykdommer, har imidlertid ikke effektive forebyggende eller kurative strategier for disse sykdommene blitt realisert [4]. H2O2 er en viktig komponent i reaktive oksygenarter (ROS). Følgelig er H2O2-indusert PC12-celleskade den mest brukte modellen for oksidativt stress og er mye brukt i eksperimentelle studier av nevrobeskyttende effekter [5]. Heme oksygenase 1 (HO-1) og glutamat-cystein-ligase-katalytisk underenhet (GCLC) er viktige cellulære antioksidantenzymer, og begge genene er regulert nedstrøms for nukleær faktor erytroid 2 (Nrf2), som fremstår som et lovende terapeutisk middel mål for nevrobeskyttelse [6,7]. Fenyletanoidglykosider, avledet fra C-6-C-3-enheten, inneholder mange fenoliske hydroksylgrupper og har betydelige antioksidant- og antialdringsaktiviteter. I løpet av de siste årene har studier vist at mange medisinplanter inneholder fenyletanoidglykosider som viser betydelig antioksidantaktivitet. For eksempel fenyletanoidglykosider avledet fraHerba cistancheer kjent for å ha beskyttende effekter på kognitive underskudd ved AD. Denne studien undersøkte den tilknyttede beskyttelsesmekanismen ved å bruke en AD senescens-akselerert utsatt mus 8 (SAMP8) modell. Resultatene indikerte at evnen til fenyletanoidglykosider til å forbedre kognitive underskudd hos SAMP8-mus kan være relatert til fremme av synaptisk plastisitet som involverer antioksidantprosesser [8]. I denne studien ble to fenyletanoidglykosider separert og renset fra Tectona grandis (teak) treknuter; disse forbindelsene viste bemerkelsesverdige antioksidanteffekter som ble bestemt ved hjelp av en amperometrisk metode [9]. Videre utøver koffeoylfenyletanoidglykosidforbindelser fra Lindernia ruellioides doseavhengige antioksidant- og superoksydanion-frie radikaler-fjernende effekter in vitro [10]. Virkningsmekanismene til fenyletanoidglykosider er relatert til reguleringen av Nrf2/ARE-signalveien, som påvirker syntesen av SOD, CAT, GSH-PX og andre antioksidantenzymer [11]. Familien Gesneriaceae, som inneholder 150 slekter og omtrent 3700 arter, er primært distribuert i de tropiske og tempererte områdene i østlige og sørlige Asia, Oseania, Sør-Amerika, Afrika, Sør-Europa og Mexico [12].
Gesneriaceae i Kina. Det ble rapportert at omtrent 100 arter har medisinsk effekt, og de fleste av disse er hovedsakelig distribuert i provinsene Guangxi og Guizhou [13]. De siste årene har forskningen på Gesneriaceae-planter gradvis økt i forskjellige områder av verden, og det er funnet noen nye bestanddeler med fysiologisk aktivitet [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt tilhører Parabola (Gesneriaceae) og er en urteaktig plante. Basert på "The Chinese Traditional Medicine Resource Records", ble det registrert at hele planten brukes som medisin. Dessuten kan det utøve mange farmakologiske aktiviteter på tilstander som hematemese, ødem, dysenteri, traumatisk skade og brudd [15]. Bai beviste at fenyletanoidglykosider er en av de viktigste kjemiske bestanddelene i Gesneriaceae-planter [16]. Noen forskere har også funnet at fenyletanoidglykosider har betydelige antioksidantaktiviteter [17]. Li demonstrerte at fenyletanoidglykosider avCistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 prosent) av åtte fenylpropanoidglykosider ble målt ved HPLC-topparealnormaliseringsmetoden. Som et eksempel er kromatografidiagrammene for paraboside B og paraboside II vist i figur 1, og deres relative innhold ble funnet å være henholdsvis 98,23 prosent og 99,20 prosent. Den dårlig differensierte rotte adrenal feokromocytomcellelinjen (PC12) ble kjøpt fra Cell Bank ved China Academy of Science (Shanghai, Kina). Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) og hesteserum ble kjøpt fra Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Fetalt bovint serum (FBS) ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA). H2O2 ble hentet fra Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Kina). Trizol ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). PrimeScriptTM RT reagenssett (Perfect Real Time) ble hentet fra TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, Kina). Primere for HO-1, GCLC og GAPDH ble syntetisert av Sangon Biotech (Shanghai, Kina). CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (MTS) ble oppnådd fra Promega Corp. (Madison, USA). Inhibitorer av HO-1 sinkprotoporfyrin (ZnPP) ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). En Thermo311 CO2-inkubator (Thermo, USA), StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument Thermal Cycling Block (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo), og xCELLigence RTCA DPlus Analyzer og E-Plate 16 (ACEA Biosciences, USA) ble også brukt .
Cistanche deserticola
Cellekultur og behandling
PC12-celler ble dyrket i DMEM som inneholdt 5 prosent FBS og 5 prosent hesteserum ved 37 grader i en fuktet 5 prosent CO2-atmosfære. PC12-celler ble delt inn i tre grupper som følger: en kontrollgruppe, en modellgruppe og en behandlingsgruppe. Åtte fenylpropanoidglykosider ble oppløst i DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">
Bestemmelse av H2O2
Vi bestemte den passende konsentrasjonen av H2 O2 ved bruk av sanntids cellulær analyse (RTCA). PC12-celler ble sådd i en CIM-plate-16 mikroplate ved et volum på 100 µL og deretter inkubert i 12 timer ved 37 grader i en atmosfære på 5 prosent CO2. PC12-cellene ble delt inn i kontroll- og modellgrupper. Deretter ble 10 μL H2O2 (50, 100, 200 og 400 μM) tilsatt modellgruppene, og kontrollgruppene ble behandlet med 10 μL komplett DMEM, satt opp i tre komplekse brønner. E-Plate 16 ble plassert i xCELLigence RTCA, overvåket hvert 15. minutt, og resultatene ble registrert i 32 timer. Effekten av H2O2 på PC12-celler ble analysert ved å bruke xCELLigence RTCA-dataanalyseprogramvaren. Celleindeksverdien (CI) ble brukt for å bestemme den optimale H2O2-konsentrasjonen og virkningsvarigheten.
Sammensatt ekstraksjon og isolering
Fraksjoner ble separert basert på deres polaritet ved bruk av tidligere beskrevne metoder. Lufttørket, pulverisert P. martini (4 kg) ble suksessivt ekstrahert tre ganger med en 75 prosent vandig etanolløsning [20]. De oppnådde ekstraktene ble deretter konsentrert ved bruk av en rotasjonsfordamper for å fjerne etanol, og råekstrakter ble oppnådd. Prøvene ble oppløst i avionisert vann og deretter ekstrahert suksessivt med petroleumseter, etylacetat, n-butanol og vann. N-butanolekstraktet (400 g) ble fraksjonert ved bruk av en AB-8 makroporøs harpikskolonne og en etanol-H2O2-løsning (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 og 95 prosent). Seks fraksjoner (fraksjon 1–6) ble til slutt oppnådd. Fraksjon 3 og 4 ble utsatt for separasjon ved bruk av en MCI-kolonne med en trinn-gradient av MeOH-H2O2 (10–100 prosent). Deretter ble produktene isolert ved å bruke Sephadex LH-20 med 50 prosent MeOH som elueringsmiddel. Forbindelser 1 (41,0 mg) og 6 (15,6 mg) ble isolert fra fraksjon 3. Forbindelser 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) og 8 (26,0 mg) ble oppnådd fra fraksjon 4 ved bruk av Sephadex LH-20-kromatografi med 50 prosent MeOH som elueringsmiddel. Endelige isolasjoner ble utført ved semi-prep, reversert-fase HPLC (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) med 50 prosent MeOH og UV-deteksjon ved 280 nm for å gi forbindelser 4 (39,0 mg) og 5 (9,0 mg) [20].
Cellelevedyktighetsanalyse
PC12-celler ble sådd i 96-brønnplater med en tetthet på 2 × 1{{10}}4 celler/brønn ved et sluttvolum på 100 µL . PC12-celler ble inkubert ved 37 grader med 5 prosent CO2 i 12 timer. Deretter ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av råekstrakter (0.025, 0.05, 0.1, 0.2 og 0.4 mg/ml) og forbindelsene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 ved fem konsentrasjoner (3,125, 6,25, 12,5, 25 og 50 μM). Etter forbehandling i 24 timer ble cellelevedyktighet bestemt ved MTS-analyser. PC12-celler ble preinkubert med eller uten HO-1-hemmeren uten ZnPP (15 μM) i 30 minutter, deretter inkubert med eller uten kaleolariosid B, parabosid B og parabosid II (3,125 μM) i 12 timer, og til slutt inkubert med 400 μM H2O2 i ytterligere 6 timer. Etter behandling ble antall overlevende celler bestemt ved en MTS-analyse [6].
Beskyttende effekter av råekstrakter og monomere forbindelser på H2O2-behandlede PC12-celler
Cellene ble dyrket i en {{0}}brønnplate med et sluttvolum på 100 µL. Seriefortynninger av råekstrakter (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 og 0,4 mg/ml) ble tilsatt til den behandlede gruppen. Etter forbehandling i 12 timer ble 400 μM H2O2-løsning (optimal konsentrasjon) tilsatt til den behandlede gruppen og H2O2-gruppen i hver brønn i 6 timer. MTS-løsning ble deretter tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i 3 timer ved 37 grader C. Platene ble oscillert ved lav hastighet i 5 minutter ved romtemperatur til alle krystaller var fullstendig oppløst. Cellebeskyttelse ble bestemt basert på MTS-analyseresultater i henhold til produsentens 2204 X. GONG ET AL. Lastet ned fra https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 av gjest 27. august 2021instruksjoner. Den optiske tettheten ble bestemt ved en absorbansbølgelengde på 490 nm. Vi fulgte videre aktiviteten til forbindelsene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 isolert fra fraksjonene 3 og 4. Seriefortynninger av forbindelsene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 (3.125, 6.25, 12.5, 25 og 50 μM) ble lagt til den behandlede gruppen for å bestemme deres respektive beskyttende effekter på H2O2-induserte PC12-celler.
fenyletanoidglykosider fra Cistanche deserticola: Beskytter nevroner og anti-aldring
Kvantitativ sanntids-PCR (qRT-PCR)
PC12-celler ble høstet 12 timer etter behandling med 3,125 μM kaleolariosid B, parabosid B og parabosid II. Totalt RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol-reagens, og alikvoter av totalt RNA ble reverstranskribert ved bruk av et Primescript RT Master Kit i henhold til produsentens instruksjoner. Følgende primere ble brukt for eksperimentene i samsvar med en tidligere rapport [21]. HO-1: Forover 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, Revers 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: Fremover 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, Revers 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Forover 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, Revers 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. Alikvoter av de oppnådde cDNA-ene ble deretter amplifisert ved PCR. Reaksjonsbetingelsene var som følger: initial denaturering ved 95 grader (30 s), etterfulgt av 40 sykluser på 95 grader (5 s), 60 grader (34 s) og 72 grader (35 s). Alle primere ble testet og FL-fluorescenssignalet ble påvist; deretter ble △Ct-verdien beregnet og de relative verdiene ble sammenlignet med verdiene til kontrollgruppen ved å bruke følgende ligning: △Ct=Ct (prøve) − Ct (endogen kontroll), △△Ct {{36} } △Ct (prøve) −△Ct (ubehandlet), og fold endring=2-△△Ct. Glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH) ble brukt som internkontroll.
Proteinekstraksjon
PC12-celler ble sådd på 100-mm skåler med 1 × 107 celler/skål. Etter festing ble cellene behandlet med henholdsvis kaleolariosid B, parabosid B og parabosid II (3,125 µM) i 12 timer. Glykosidene ble deretter fjernet, og cellene ble inkubert med H2O2 i ytterligere 6 timer. Etter inkubering ble cellene vasket to ganger med kald PBS og skrapet fra skålene med 1 ml PBS. Cellehomogenater ble sentrifugert ved 1500 rpm i 10 minutter. Etter behandling ble cellulære proteiner ekstrahert ved bruk av en Beyotime RIPA cellelyseringsbuffer med 1 mM PMSF i henhold til produsentens instruksjoner. I tillegg ble cytoplasmatiske og nukleære proteiner isolert som beskrevet i Beyotimes kjernefysiske og cytoplasmatiske ekstraksjonssett-protokoll. Proteinkonsentrasjonene til prøvene ble oppdaget ved hjelp av et Beyotime BCA-proteinanalysesett, og alle prøvene ble lagret ved -80 grader for western blotting-analyse [6].
Western blot-analyse
SDS-PAGE-elektroforese ble utført etter ekstraksjon og påfølgende denaturering av totalt protein fra forskjellige grupper. Etter elektroforese ble proteinet overført til PVDF-membraner, som deretter ble blokkert med 5 prosent skummetmelkpulver i 4 timer. Etter vask, primært antistoff (kanin polyklonalt antistoff GAPDH (1:10,000 fortynning), kanin polyklonalt antistoff HO-1 (1:1000 fortynning), eller kanin polyklonalt antistoff GCLC (1:1000 fortynning) ble tilsatt til membranene, som ble inkubert over natten ved 4 grader Neste dag ble PVDF-membranene vasket tre ganger i TTBS. Deretter et sekundært antistoff (konjugert affinitetsrent geit-anti-kanin-IgG (1:1000 fortynning) merket med pepperrotperoksidase ble tilsatt til membranene, som deretter ble inkubert ved romtemperatur i 2 t. PVDF-membranene ble vasket og utsatt for ECL kjemiluminescensdeteksjonsreagens for å signalisere eksponering på røntgenfilm, som deretter ble fikset og skannet [22].
Statistisk analyse
Dataene ble analysert med SPSS 19.0, og resultatene presenteres som gjennomsnitt med standardavvik (SD) for tre uavhengige eksperimenter. Verdier på p < 0.05="" ble="" ansett="" for="" å="" indikere="" statistisk="" signifikante="">
Resultater Etablering av H2O2-modell
Som vist i figur 2, forårsaket ikke H2O2 ved 50, 100 og 200 μM det passende nivået av celledød. Imidlertid virket 400 μM H2O2 på PC12-celler innen 2–6 timer, og den oksidative skaden på cellene hadde en tendens til å være stabil. Derfor vurderte vi at induksjon med H2O2 i en konsentrasjon på 400 μM i 6 timer var passende for å etterligne oksidativt stress-indusert skade på PC12-celler.
Beskyttende effekter av råekstrakter på PC12-celler behandlet med H2O2
Sammenlignet med det i H2O2-modellgruppen (figur 3), n-butanolekstrakt i konsentrasjoner på 0.05, 0.1, {{10} }.2, og 0.4 mg/ml forbedret signifikant oksidativ skade på PC12-celler indusert av H2O2 (p < 0.05)="" på="" en="" konsentrasjonsavhengig="" måte.="" disse="" dataene="" antydet="" at="" n-butanolfraksjonen="" inneholdt="" kraftigere="" beskyttende="" aktivitet.="" petroleumseter-="" og="" etylacetatekstrakter="" viste="" imidlertid="" beskyttende="" aktivitet="" bare="" ved="" høye="" konsentrasjoner="" (petroleumseter:="" 0.1="" og="" 0.2="" mg/ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5;="" etylacetat:="" 0,2="" og="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" dessuten="" viste="" forskjellige="" konsentrasjoner="" av="" vannfaseekstrakter="" ingen="" beskyttende="" effekter="" (p=""> 0,05). Videre har vi lagt til data fra en valideringsstudie med SH-SY5Y humane neuroblastomcellelinjer (SH-SY5Y) i tilleggsfilen. Behandling med 250 μM H2O2 resulterte i redusert cellelevedyktighet; behandling med kaleolariosid B, parabosid B og parabosid II (3,125, 6,25, 12,5, 25 og 50 μM) svekket imidlertid SH-SY5Y-celledøden betydelig. Eksperimentresultatene viste at kaleolariosid B, parabosid B og parabosid II beskyttet SHSY5Y-celler mot H2O2-indusert celleskade.
Strukturer av forbindelser isolert fra n-butanolfraksjonen
For å bekrefte at n-butanolekstraktet inneholdt aktive komponenter, fraksjonerte vi ytterligere åtte forbindelser fra ekstraksjonen. Strukturene til forbindelsene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 ble identifisert ved hjelp av forskjellige spektraldata (1H-NMR, 13C-NMR og ESI-MS) basert på sammenligninger med publiserte data for paraboside A , parabosid B, parabosid I, parabosid II, parabosid III, henholdsvis nuomiosid A, kaleolariosid B og isonuomiosid A [20]. For eksempel var dataene for parabosid B som følger: brunt gummi; ½ 20 D -55,7 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH maks nm (loge): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr maks cm−1: 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm−1 [200]; for 1H og 13C NMR spektroskopiske detaljerte data vist i referanse 20; HR-ESI-MS (negativ) m/z 741,2231 [MH]- (beregnet for C33H41O19, 741,2242) [20]. Dataene for parabosid II var som følger: hvite amorphous pulvere; ½ 20 D -80,5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH maks nm (loge): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr maks cm−1: 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm−1 [20]; for 1H og 13C NMR spektroskopiske detaljerte data vist i referanse 20; ESI-MS (negativ) m/z 637
Beskyttende effekter av isolerte forbindelser mot H2O2-indusert toksisitet i PC12-celler
MTS-analyser ble brukt for å undersøke effekten av isolerte forbindelser på levedyktigheten til PC12-celler eksponert for H2O2-indusert toksisitet. Som vist i figur 5, sammenlignet med det i kontrollgruppen, ble PC12-celler forbehandlet med fem forskjellige konsentrasjoner av kaleolariosid B, parabosid B, parabosid II eller parabosid A (3.125, 6.25, 12.5, 25 og 50 μM) i 24 timer viste ingen signifikante forskjeller i cellelevedyktighet (p > 0,05). Forbehandling av PC12-celler med kaleolariosid B, parabosid B og parabosid II resulterte således i ingen cytotoksisitet. Som vist i figur 6, reduserte 400 µM H2O2 cellelevedyktigheten signifikant sammenlignet med den i kontrollgruppen. Videre økte cellelevedyktigheten til H2O2--behandlede PC12-celler markant etter forbehandling av PC12-celler med forskjellige konsentrasjoner av kaleolariosid B, parabosid B og parabosid II; videre var cellelevedyktigheten den høyeste etter behandling med 50 µM kaleolariosid B, 50 µM parabosid B og 12,5 µM parabosid II. De andre fem forbindelsene viste ingen signifikante beskyttende effekter på H2O2-behandlede PC12-celler. For å illustrere dette funnet, diskuterer vi en av disse som et eksempel, mens de andre ikke er beskrevet i manuskriptet.
Transkripsjonsnivåer av HO-1 og GCLC
Vi testet deretter transkripsjonsnivåene av HO{{0}} og GCLC i PC12-celler behandlet med kaleolariosid B, parabosid B og parabosid II. Totalt mRNA ble samlet fra behandlede og ubehandlede PC12-celler i 12 timer og deretter utsatt for ekspresjonsanalyse ved qRT-PCR. Som vist i figur 7(a,c,e), økte transkripsjonsnivåene av HO-1 signifikant etter at PC12-celler ble forbehandlet med de angitte konsentrasjonene av kaleolariosid B, parabosid B og parabosid II i 12 timer (p < 0.05).="" som="" vist="" i="" figur="" 7(b),="" økte="" transkripsjonsnivåene="" av="" gclc="" også="" signifikant="" i="" pc12-celler="" forbehandlet="" med="" de="" angitte="" konsentrasjonene="" av="" kaleolariosid="" b="" i="" 12="" timer.="" imidlertid="" reduserte="" nivåene="" av="" gclc="" i="" pc12-celler="" forhåndsbehandlet="" med="" parabosid="" b="" i="" 12="" timer="" signifikant="" sammenlignet="" med="" de="" i="" modellgruppen="" (p="">< 0,05;="" figur="" 7(d)).="" videre,="" med="" paraboside="" ii-behandling,="" var="" nivåene="" av="" gclc="" i="" pc12-celler="" ikke="" signifikant="" forskjellig="" sammenlignet="" med="" de="" i="" modellgruppen="" (p=""> 0,05; figur 7(f)).
Uttrykk for HO-1 og GCLC
HO{{0}} og GCLC er viktige cellulære antioksidantenzymer, og begge er Nrf2-regulerte nedstrømsgener. Proteinekspresjonen av HO-1 og GCLC ble også observert etter behandling [6]. Figur 8 viser proteinnivåene til HO-1 og GCLC i PC12-celler etter behandling med 400 μM H2O2; resultatene indikerte at FL-fluorescensintensiteten til HO-1 i kaleolariosid B- og parabosid B-gruppene var større enn de i de H2O2-behandlede gruppene (figur 8(a,c)). Ekspresjonen av GCLC ble imidlertid ikke signifikant endret av forbindelsene, bortsett fra kaleolariosid B (figur 8(b)). Deretter ble kjemiske hemmere av HO-1 brukt for å ytterligere evaluere rollene til antioksidantenzymer i å regulere de beskyttende effektene som utøves av kaleolariosid B, parabosid B eller parabosid II mot H2O2-indusert cytotoksisitet. Caleolariosid B, parabosid B og parabosid II (3,125 µM) forhindret H2O2-indusert cytotoksisitet, men slike beskyttende effekter ble reversert av HO-1-hemmeren ZnPP (p < 0,01)="" ved="" 15="" µm="" (figur="" 8)="">
Fordelen med Cistanche: Øk mannlig reproduksjon
Diskusjon
Befolkningens aldring er et alvorlig globalt problem. Mange sykdommer er relatert til senilitet, som AD og PD, som er alvorlige trusler mot folkehelsen. AD og PD har dukket opp som de tredje mest dødelige sykdommene globalt, etter hjerte- og karsykdommer og kreft. Derfor har nevrodegenerasjon blitt et presserende forskningstema over hele verden. Imidlertid har patogenesen til AD og PD, nevrodegenerative sykdommer i sentralnervesystemet, forblitt uklar til dags dato. Videre er det bare noen få legemidler som effektivt kan behandle AD eller PD på grunn av deres komplekse patogene mekanismer [23]. Tidligere studier har vist at ROS, som superoksidanion (O2−) og H2O2, er hovedfaktorene som bidrar til nevrodegenerative sykdommer. Patologiske endringer under PD inkluderer neuronal degenerasjon og død av substantia nigra og striatal dopamin [24,25]. Følgelig er det viktig å utvikle effektive antioksidantmedisiner for å behandle PD, og slik medikamentoppdagelse har blitt en viktig forskningsretning [26]. For øyeblikket ser det ut til at Nrf2/ARE-signalveien er den viktigste endogene antioksidant-stressveien [27]. Ares er lokalisert i 5′-oppfyllingsrangeringsregionene til gener, slik som HO-1 og GCLC [28,29]. HO-1 og GCLC er Nrf2--relaterte gener som er regulert nedstrøms for dette proteinet [6]. ARE-er kan deretter påvirke nivåene av antioksidanter og aktivere nedstrømsekspresjonen av HO-1 og andre beskyttende gener, noe som kan forbedre cellebeskyttelsesaktivitetene [30,31]. Videre antydet funn at de beskyttende effektene av resveratrol mot A {{2{{50}}}}-indusert toksisitet i PC12-celler oppstår gjennom oppregulering av HO-1-ekspresjon via aktivering av Nrf2-intracellulære signalvei [32]. PC12-celler er en akseptert modell av nevrale celler og er mye brukt i nevrobeskyttende effektstudier [33]. H2O2 kan lett passere gjennom cellemembranen og kombineres med jern for å danne høyaktive frie radikaler, som induserer oksidativt stress og celleskade [34]. H2O2 er en viktig ROS, og frie radikaler genereres lett og er relativt stabile, derfor brukes de vanligvis til å etablere en oksidativt stressmodell ved bruk av PC12-celler [5]. I denne studien induserte forbehandling av PC12-celler med ikke-toksiske konsentrasjoner av planteekstraktet beskyttet celler fra H2O2- cytotoksisitet ved å redusere genereringen av ROS. Fenyletanoidglykosider inneholder mange fenoliske hydroksylgrupper som har antioksidant- og antialdringsaktiviteter. I denne studien fant vi at n-butanolekstraksjon ga bedre beskyttelse enn andre polaritetsfraksjoner (figur 3). Dermed screenet vi ytterligere beskyttelsesaktivitetene til åtte forbindelser isolert fra n-butanolfraksjonen. Resultatene viste for første gang at Figur 8. Analyse av HO-1- og GCLC-proteinnivåer på PC12-celler. (a) Western blotting-analyse av ekspresjonen av HO-1 og GCLC og GAPDH ble brukt som en belastningskontroll. (b) Western blot-analyse GCLC-proteinekspresjon. (c) Western blot-analyse HO-1-proteinuttrykk. (d) HO-1-hemmer ZnPP reduserte den nevrobeskyttende effekten. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD, n=3. ***p < 0.001="" kontra="" kontrollgruppe;="" #p="">< 0,05="" versus="" h2o2-gruppe="" (uten="" znpp-behandlet),="" ##p="">< 0,01="" versus="" h2o2-gruppe="" (uten="" znpp-behandlet),="" ###p="">< 0,001="" versus="" h2o2-gruppe="" (uten="" znpp-behandlet);="" og="" p="">< 0,01,="" versus="" h2o2-gruppen="" (med="" znpp="" behandlet),="" og="" &p="">< 0,001,="" versus="" h2o2-gruppen="" (med="" znpp="" behandlet).="" (kontrollgruppe;="" modellgruppe:="" h2o2;="" znpp="" negativ="" gruppe:="" kaleolariosid="" b="" pluss="" h2o2,="" parabosid="" b="" pluss="" h2o2,="" parabosid="" ii="" pluss="" h2o2;="" znpp="" positiv="" gruppe:="" znpp="" pluss="" kaleolariosid="" b="" pluss="" h2o2,="" znpp="" pluss="" parabosid="" b="" pluss="" h2o2,="" znpp="" pluss="" parabosid="" ii="" pluss="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" lastet="" ned="" fra="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145="" av="" gjest="" 27.="" august="" 2021caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" og="" paraboside="" ii="" har="" betydelige="" beskyttende="" effekter="" mot="" h2o2--indusert="" oksidativt="" skade="" i="" pc12-celler.="" resultatene="" indikerte="" også="" at="" h2o2-behandling="" induserte="" betydelig="" pc12-celleskade="" og="" redusert="" cellelevedyktighet,="" mens="" behandling="" med="" kaleolariosid="" b,="" parabosid="" b="" og="" parabosid="" ii="" dempet="" disse="" effektene="" betydelig="" (figur="" 6).="" en="" tidligere="" studie="" rapporterte="" at="" nrf2/are-veien="" er="" en="" av="" de="" viktigste="" endogene="" antioksidantveiene,="" og="" kan="" oppregulere="" uttrykket="" av="" nedstrømsmarkører,="" slik="" som="" ho-1,="" for="" å="" beskytte="" celler="" [7].="" resultatene="" av="" qrt-pcr="" og="" western="" blotting-analyser="" viste="" at="" kaleolariosid="" b,="" parabosid="" b="" og="" parabosid="" ii="" betydelig="" oppregulerte="" nivåene="" av="" ho-1.="" imidlertid="" økte="" transkripsjonsnivåene="" av="" gclc="" signifikant="" i="" pc12-celler="" forbehandlet="" med="" kaleolariosid="" b,="" men="" reduserte="" i="" de="" som="" ble="" forbehandlet="" med="" parabosid="" b="" sammenlignet="" med="" de="" i="" modellgruppen.="" videre="" endret="" ikke="" paraboside="" ii="" uttrykket="" til="" denne="" markøren,="" sammenlignet="" med="" det="" i="" modellgruppen="" (figur="" 7="" og="" 8(a–c)).="" i="" tillegg="" ble="" de="" beskyttende="" effektene="" av="" kaleolariosid="" b,="" parabosid="" b="" og="" parabosid="" ii="" mot="" h2o2-indusert="" pc12-celleskade="" reversert="" av="" ho-1-hemmeren="" znpp="" (figur="" 8(d)).="" konklusjonen="" er="" at="" fenyletanoidglykosidene="" kaleolariosid="" b,="" parabosid="" b="" og="" parabosid="" ii="" effektivt="" beskyttet="" pc12-celler="" fra="" h2o{113}}indusert="" oksidativ="" skade.="" følgelig="" kan="" disse="" forbindelsene,="" isolert="" fra="" p.="" martini,="" representere="" potensielle="" medikamentkandidater="" for="" behandling="" av="" nevrodegenerative="">
Fordelen med Cistanche:behandling av nevrodegenerative sykdommer
Referanser
[1] Butterfield DA. Perspektiver på oksidativt stress ved Alzheimers sykdom og spådommer om fremtidige forskningsvekter. J Alzheimers Dis. 2018;64:1–11.
[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Oksidativt stress og amyloid-beta-peptidet ved Alzheimers sykdom. Redox Biol. 2018;14:450–464.
[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, et al. Skade på dopaminerge nevroner ved oksidativt stress ved Parkinsons sykdom (gjennomgang). Int J Mol Med. 2018;41:1817–1825.
[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH, et al. Sammenslutning av rs823128, rs1572931 og rs823156 polymorfismer med redusert risiko for Parkinsons sykdom. Nevrorapport. 2017;27:936–941.
[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX, et al. Antioksidantvirkning av 7,8-dihydroksyflflavon beskytter PC12-celler mot 6-hydroksydopaminindusert cytotoksisitet. Neurochem Int. 2014;64:18–23.
[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, et al. Nevrobeskyttende effekter av fire fenyletanoidglykosider på H2O2-indusert apoptose på PC12-celler via Nrf2/ARE-veien. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.
[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Nrf2-ARE-vei: et voksende mål mot oksidativt stress og nevroinflammasjon i nevrodegenerative sykdommer. Pharmacol Therapeut. 2016;157:84–104.
[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP, et al. Effektene av fenyletanoidglykosider, avledet fraHerba cistanche, om kognitive underskudd og antioksidantaktiviteter hos SAMP8 hannmus. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.
[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, et al. Fenyletanoidglykosider fra teak-knuter og deres antioksidantaktivitet. J Biol Active Prod Nat. 2016;6:272–281.
[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ, et al. Antioksidantaktivitet av caffeoyl fenylethanoid glykosidforbindelser fra Lindernia ruellioides in vitro. Cent South Pharm. 2017;15:1687–1690.
[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, et al. Rollen til Nrf2-ARE-veien i oksidativ stressskade og dens forhold til andre signalveier. Animal Husbandry Feed Sci. 2016;37:42–48.
[12] Zheng XK, Li J, Feng WS, et al. Fremskritt i studiet av Gesneriaceae. Chin J New Drug. 2003;12:261–263.
[13] Wen F, Li ZD. Forskningsfremskritt på Gesneriaceae-planten. Chin Wild Plant Resour. 2006;25:1–6.
[14] Yan WY, Chen L, Wang JM, et al. Forskningsfremgang av triterpenoider fra Gesneriaceae-planter. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698–701.
[15] Kinesisk urtemedisinselskap. Den kinesiske tradisjonelle medisinressurspostene. Kina: Science Press; 1994.
[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG, et al. Distribusjon av fenyletanoidglykosider i medisinske planter av Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267–4270.
[17] He ZD, Lau KM, Xu HX, et al. Antioksidantaktivitet av fenyletanoidglykosider fra Brandisia hancei. J Etnopharmacol. 2000;71:483–486.
[18] Li L, Shi DF, Gui YG, et al. Studie om antioksidantaktivitetene tilfenyletanoidglykosider fra Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835–15836.
[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, et al. Beskyttende effekter avglykosider av cistanchepå skaden av PC12-celler PARABOLA MARTINI BESKYTT PC12-CELLER FRA H2O2-INDUSERT SKADE 2211
