Del 2: Interaksjoner mellom askorbinsyre, 5-kaffeoylkinsyre og quercetin-3-rutinosid i nærvær og fravær av jern under termisk behandling og påvirkning på antioksidantaktivitet

For mer info. ta kontakt med:tina.xiang@wecistanche.com

Klikk på lenken for å lære del 1 detaljer:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Diskusjon

3.1. Struktur-aktivitetsforhold mellom askorbinsyre,5-kaffeoylkinsyre og quercetin-3-rutinosid

En første indikator for AOA, målt for forskjellige stoffer avhengig av struktur-aktivitetsforholdet, kom fra antall funksjonelle grupper. Ved å sammenligne alle de tre analyserte stoffene, hadde askorbinsyre den laveste AOA, etterfulgt av 5-kaffeoylkinsyre, mensquercetin-3-rutinosidnådde høyeste AOA. Csepregi et al. [14] fant samme rekkefølge når man sammenlignet AOA for disse tre forbindelsene. Denne rangeringen kan forklares med den totale mengden hydroksygrupper: quercetin-3-rutinosid har ti, 5-kaffeoylkinsyre har fem, ogaskorbinsyrehar fire. Tilflavonoider, ble den totale mengden hydroksygrupper og deres innvirkning på mekanismene til AOA tidligere vist av Burda og Oleszek [15]. Hydroksygrupper er spesielt verdifulle i endiolstrukturer, da de lett kan oksidere til diketoner [8]. I de analyserte stoffene er endiolstrukturen også viktig for evnen til å danne komplekser med metallioner [16-18]. Endiolstrukturen forekommer i quercetin-3-rutinosid- og 5-kaffeoylkinsyremolekyler i fenylringen, som også kan påvirke den sterkere AOA til disse forbindelsene. Ytterligere studier fant at AOA også kan være påvirket av andre molekylstrukturer. Fenolsyrer påvirkes muligens av karboksylsyregruppene, f.eks. er hydroksyfenyleddiksyre (R-CH=CH-COOH) en svakere elektrontiltrekkende gruppe, sammenlignet med hydroksykanelsyre (R-CH,-COOH) som f.eks. som koffeinsyre i 5-kaffeoylkinsyre [19]. I flavonoider hadde aglykoner høyere AOA enn de tilsvarende glykosidene [20,21], i tilfelle av quercetin-3-rutinosid, et glykosid, AOA for aglykonetquercetiner følgelig høyere [14]. Det er mange forskjellige funksjonelle grupper som kan påvirke AOA, og følgelig er det viktig å bruke forskjellige testanalyser med forskjellige mekanismer, slik som enkeltelektronoverføring (SET), hydrogenatomoverføring (HAT) og sekvensielt protontap-elektron overføring (SPLET) for deteksjon. Hver mekanisme og til og med den brukte assayreagensen kan oppdage forskjellige strukturer av bioaktive forbindelser [22].

3.2. Påvirkning av termisk prosessering og interaksjon av strukturelt forskjellige antioksidanter på antioksidantaktiviteten i fravær av mineraljernet

Stabil AOA over en lengre tid på 40 minutter med termisk prosessering indikerer at termisk nedbrytning er av mindre betydning enn opprinnelig hypotese. Videre viste HPLC-data at ren 5-kaffeoylkinsyre og quercetin-3-rutinosid var stabile, med en maksimal nedbrytning på 20 prosent, under termisk prosessering. Tidligere studier påviste stabiliteten til 5-kaffeoylkinsyre opp til det normale kokepunktet for vann [23], mens Dawidowicz og Typek[24] fant ni derivatforbindelser etter oppvarming av 5-kaffeoylkinsyre i 5 timer under refluks. For askorbinsyrekonsentrasjon ble det funnet en nedbrytning etter 40 minutters koking. Påvirkningsfaktorer, som resulterer i askorbinsyrenedbrytning uten jern i en vandig løsning, kan være pH-verdier, lyseksponering, oksidasjon, temperatur og ulike konsentrasjoner [25,26]. I denne studien spilte mest sannsynlig faktorene temperatur og konsentrasjon hovedrollen, da oksidative prosesser ble redusert til et minimum på grunn av minimalt med gassplass i mikrorørene. Det er mulig at den gjenværende gassfasen fortsatt er nok for nedbrytning under aerobe forhold. De forskjellige forholdene resulterer i forskjellige produkter [27,28], så i denne studien, etter 40 min med matlaging, kunne man finne produkter av begge forholdene. Yuan og Chen [28] rapporterte at furfural, 2-furoic acid, 3-hydroksy-2-pyrron og et ukjent stoff er store nedbrytningsprodukter av askorbinsyre i en vandig løsning avhengig av pH-verdien . Shinoda et al. [29,30] fant i appelsinjuice nedbrytningsproduktene furfural, 2-furoic acid, 5-hydroksymaltol, 3-hydroksy-2-pyrron og 5-(hydroksymetyl )furfural. Hsu et al. [31] analyserte askorbinsyre i etanoliske løsninger og oppdaget 2-furoic acid og 3-hydroksy-2-pyrron. Avhengig av aerobe eller anaerobe forhold, kan de påviste askorbinsyrederivatene (topp 3 og 4) være furfural, 2-furoic acid eller 3-hydroksy-2-pyrron eller mellomprodukter. Askorbinsyren avtok i en dose-respons-relasjon, og høyere konsentrasjoner av askorbinsyre viste lavere nedbrytningsforhold under koking. Askorbinsyre ser ut til å stabilisere seg i høyere konsentrasjoner, antagelig på grunn av hydrogenbindinger og van de Waals-energi [32].

I binære og ternære blandinger ble det hovedsakelig funnet tilleggseffekter på AOA. I binære blandinger, hvis stoffet med høyere AOA økte i sin konsentrasjon, økte AOA av kombinasjonen deres også. Andre studier fant også additive effekter mellom (pluss)-katechin (200 um) med askorbinsyre (50-200 mg/L)[33], og mellom binære blandinger av forskjellige monoterpener[34]. Bare i DPPH-analysen ble antagonistiske effekter funnet i 5-kaffeoylkinsyre kombinert med quercetin-3-rutinosid og i ternære blandinger med doblet quercetin-3-rutinosidkonsentrasjon. Dette kan være forårsaket av orienteringen av molekylene i rommet, spesielt quercetin-3-rutinosid, som et ganske stort molekyl, og den steriske tilgjengeligheten til DPPH-radikalmolekylet [35]. I TPC-analysen resulterte kombinasjonen av askorbinsyre og 5-kaffeoylkinsyre i sterke antagonistiske effekter i et 1:2-forhold, mens reverserte blandinger med et 2:1-forhold resulterte i sterke synergistiske effekter som oversteg summen av respektive AOA-er. Dobbel konsentrasjon av askorbinsyre kan under disse forholdene gi et ekstra løft til AOA, på grunn av selvstabilisering etterfulgt av stabilisering av andre molekyler, demonstrert av 5-kaffeoylkinsyre i dette eksperimentet. I granateple-nektarinjuice, mellom de naturlige fenolene og askorbinsyre, ble den samme interaksjonen funnet, mens det i druejuice ble observert økende antagonistiske effekter ved å øke askorbinsyrekonsentrasjonen [36]. Disse resultatene tyder på at blandinger av askorbinsyre, 5-kaffeoylkinsyre og quercetin-3-rutinosid oppnår det høyeste AOA-potensialet når det er mest potentantioksidanterer rikelig tilgjengelig.

Klikk for å lære mer om produktene

3.3. Påvirkning av mineraljern

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>askorbinsyre. Imidlertid hadde tilsetning av jern til blandingene en innflytelse på TEAC- og DPPH-analyseresultater, mens TPC-analyser var stort sett upåvirket. Av denne grunn er det viktig å bruke forskjellige testanalyser med forskjellige arbeidsmekanismer når du arbeider med jernrike prøver.

Bare i DPPH-analysen hadde AOA for rent quercetin-3-rutinosid, og i kombinasjon med askorbinsyre, ekvimolar eller ikke-ekvimolar med doble quercetin-3-rutinosidkonsentrasjoner, lavere verdier i nærvær av jern. Boligon et al. [351 forklarte at DPPH-analysen oppdager mindre antioksidanter bedre, på grunn av den steriske tilgjengeligheten til disse radikalene. Antagelig kan quercetin-3-rutinosid med de to bindingssidene bygge ganske store komplekser med jern, og dermed være utilgjengelig for analysen. Som nevnt av Kejic et al. [8], dette kan forklares ved dannelsen av supramolekylære komplekser via koordinering av metallioner. I kombinasjon med askorbinsyre, som er i stand til å bygge blandede valenskomplekser i forholdet 1:2 [12], kan disse større blandede kompleksene antagelig ikke interagere med DPPH-radikalet. I motsetning til resultatene i denne studien fant andre studier [18,37,38] ved å bruke DPPH-analysen at quercetin-3-rutinosidkomplekser er mer effektive antioksidanter enn rent quercetin-3-rutinosid. Det er kjent at chelatkomplekser av flavonoider og metallioner kan oppheve den radikale aktiviteten til kompleksbundne metallioner [39]. Den eneste forskjellen var at i denne studien ble ammoniumjern(II)sulfat brukt, i stedet for jern(ⅡI)klorid eller sulfat, brukt i arbeidet til Symonowics og Kolandek [39].

Synergistiske effekter mellom askorbinsyre og 5-kaffeoylkinsyre i nærvær av jern i forholdet 2:1, og antagonistiske effekter i forholdet 1:2, ble funnet. Kombinasjonen av 5-kaffeoylkinsyre med jern ble ikke anbefalt in vivo [6]. Denne studien viste imidlertid at in vitro kan den doble mengden askorbinsyre sammenlignet med 5-kaffeoylkinsyre til og med ha synergistiske effekter på AOA. Ytterligere undersøkelser av forhold kan vise om positive effekter også kan oppnås in vivo.

I følge HPLC-dataene vil tilsetning av jern til prøven ha en minimal effekt på dens katalytiske aktivitet, ettersom bare askorbinsyrekonsentrasjonen i 0 min kokte prøver ble redusert. I de kokte askorbinsyreprøvene, i motsetning til prøver uten jern, førte høyere askorbinsyrekonsentrasjoner til et høyere nedbrytningsforhold.5-Kaffeovlkinsyre og quercetin-3-rutinosid trenger tilleggsfaktorene temperatur og tid, samt interaksjoner i blandinger, for at den katalytiske aktiviteten til jern skal fungere. Quercetin-3-rutinosid, i nærvær av jern, reduserte bare i binære blandinger med askorbinsyre etter termisk behandling. Dette kan skyldes det faktum at flavonoidet fungerer som en primær antioksidant, og deretter reagerer den resulterende forbindelsesradikalen med askorbinsyre, og regenererer den opprinnelige forbindelsen [18]. 5-Kaffeoylkinsyre ser ut til å være spesiell, fordi den beskytter quercetin-3-rutinosid, mens askorbinsyre ikke er i stand til å beskytte quercetin-3-rutinosid. Derfor kan 5-kaffeoylkinsyre være nøkkelmolekylet for å stabilisere systemet i kombinasjon med jern og termisk prosessering. Denne hypotesen om 5-kaffeoylkinsyre som et stabiliserende molekyl ble ytterligere bekreftet i de ternære blandingene. Her ble quercetin-3-rutinosid alltid stabilisert av 5-kaffeoylkinsyre, slik at selv i nærvær av askorbinsyre ble det ikke observert noen reduksjon i quercetin-3-rutinosidkonsentrasjon. I en annen studie viste 5-kaffeoylkinsyre beskyttende egenskaper mot nedbrytning av antocyaniner gjennom en co-pigmenteringsmekanisme [40]. Nye nedbrytningsprodukter, med mulig høyere AOA, dukket opp fra alle tre stoffene i nærvær av jern. Koffeinsyre (topp 6) ble identifisert som et 5-kaffeoylkinsyre-nedbrytningsprodukt (data ikke vist). Dette førte til antakelsen om at det andre stoffet kan være kininsyre eller en av de ni mulige derivatene beskrevet av Dawidowicz og Typek [24]: kininsyre;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-dihydroksyfenyl)-2-hydroksypropanoyl]-1,4,5-trihydroksycykloheksankarboksylsyre;(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-dihydroksyfenyl)-3-hydroksypropanoyl]-1,4,5 trihydroksycykloheks-ankarboksylsyre; trans 3-O-kaffeoylkinsyre; trans 5-O-kaffeoylkinsyre; trans 4-O-kaffeoylkinsyre; koffeinsyre; cis-5-O-kaffeoylkinsyre;4,5-dikaffeoylkinsyre. For quercetin-3-rutinosid vises et nedbrytningsprodukt i kromatogrammet, som ikke kunne identifiseres.

3.4. Evne til å danne chelater med jern (Fe3 pluss) og jernholdig jern (Fe2 pluss)

I alle prøver som inneholdt askorbinsyre ble jern(III)jern redusert til jernholdig jern. I denne prosessen,askorbinsyretar et elektron fra det jernholdige jernet og reduserer det til jernholdig jern, og blir selv en radikal. Det ustabile radikalet omdannes raskt til dehydroaskorbinsyre og ytterligere nedbrytningsprodukter [12]. På grunn av manglende hydroksyperoksid er det ikke mulig å reagere tilbake til jernholdig jern via Fenton-syklusen. I 0 min kokte binære blandinger var mer enn 20 prosent av jern bundet i nærvær av askorbinsyre. Det er kjent at askorbinsyre danner komplekser med jernarter og andre metallioner ved chelering via 3-O- og 2-O-kjernene etter hydrogenforskyvning fra 3-OH og 2- OH-grupper [16,17,41. Det kan også danne jern-askorbatkomplekser med blandet valens [42]. Imidlertid er askorbinsyre et svakt chelateringsmiddel, og etter koking ble det kun påvist spor av bundet jern i rene og blandede prøver når askorbinsyre var tilstede. Videre, på grunn av kokeprosessen, brytes askorbinsyre ned til nedbrytningsprodukter, som ser ut til å være ute av stand til å chelatere med jern.

5-Kaffeoylkinsyre er et relativt dårlig reduksjonsmiddel. Jernjern ble redusert med 5-kaffeoylkinsyre, og med langvarig koking økte reduksjonen.5-Kaffeoylkinsyre chelaterer med jern(III)jern i en ligand til metall ladningsoverføring [17].5-Kaffeoylkinsyre bærer en mulig bindingsside ved 3,4-endiolstrukturen til koffeinsyren. Dette kan være en indikator på hvorfor koffeinsyre er den bioaktive delen av 5-kaffeoylkinsyre, mens kininsyre nesten ikke har AOA [43]. Endioler hemmet OH-dannelse på grunn av dannelsen av et jernkompleks [41] i et en-til-en-forhold [44,45]. Lamy et al.[46]konkluderer med at 5-kaffeoylkinsyre danner monomere komplekser, mens Kiss et al. [47] fant oligomere arter. I motsetning til tidligere studier [17,48], ble bare spor av bundet jern funnet i nærvær av 5-kaffeoylkinsyre før og etter termisk prosessering. Dette kan forklares med de nøytrale pH-forholdene i denne studien, mens andre studier fungerte i et surt medium, basert på en pH-verdi fra 1-2.5 i menneskets mage [48]. Et svart bunnfall ble funnet i lagrede prøver etter flere timer, som er en indikator på 5-kaffeoylkinsyre-jernjernkomplekser. Nylig blandede prøver ble brukt til analysen, så dannelsen av disse kompleksene ved en nøytral pH krever lengre tid. Jernkomplekser med koffeinsyre viste liten rensende aktivitet [49]. Videre er det ingen spektrofotometrisk bevis for en reaksjon mellom kininsyre og jernjern [48]. I motsetning til 5-kaffeoylkinsyre, ble det funnet bundet jern i quercetin-3-rutinosidprøven, selv etter termisk behandling.

Quercetin-3-rutinoside reduserte jernholdig jern til jernholdig jern med en minimal økning med forlenget koketid. Denne moderate reduserende aktiviteten til quercetin-3-rutinoside ble tidligere beskrevet av Mira et al. [50]. Den ferri-reduserende aktiviteten til quercetin-3-rutinosid ble påvist i 3-rutinosid, 5,7,3',4'-OH [50]. Den moderate interaksjonen med ferrijern kan forklares med et lavere antall -OH-grupper, noe som resulterte i lavere negativ ladningstetthet på keleringssiden [50]. Flavonoider kan chelatere med metallioner på tre potensielle koordinasjonssider: (i) mellom 5-hydroksy- og 4-karbonylgrupper, (ii) mellom 3-hydroksy- og 4-karbonylgrupper, og (ii) mellom 3', A'-hydroksygrupper i Bring [39]. Quercetin-3-rutinosid bruker bindingssidene (i) og (i)[9], og ved 3-hydroksygruppen er rutinosidet festet. Spektraldata viste til og med at metallioner bare er bundet til 3', A'-hydroksygruppen [18]. Chelater er mer effektive med jern i sin bivalente form [50]. I binære blandinger er quercetin-3-rutinosid ikke i stand til å danne komplekser når askorbinsyre er tilstede, i motsetning til i ternære blandinger. Hvis 5-kaffeoylkinsyre er tilstede, blir det funnet små mengder bundet jern. Dette indikerer at 5-caffeoylquinic beskytter quercetin-3-rutinosidmolekyler i nærvær av askorbinsyre, så quercetin-3-rutinosid kan danne komplekser med jern.

4. Materialer og metoder

4.1.Kjemikalier

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 prosent), ferriammoniumsulfatdodekahydrat og ferroammoniumsulfatheksahydrat ble kjøpt fra Carl Roth (Karlsruhe, Tyskland).

4.2.Eksempler

Vandige løsninger og blandinger av autentiske standarder av askorbinsyre, {{0}}kaffeoylkinsyre og quercetin-3-rutinosid ble fremstilt som rene løsninger og blandinger i forskjellige forhold. Alle mulige binære blandinger ble laget i ekvimolare forhold, og ikke-ekvimolare forhold med én forbindelse ble doblet. Ternære blandinger ble også fremstilt i ekvimolare forhold, samt i ikke-ekvimolare forhold med henholdsvis en eller to forbindelser doblet. Antioksidantenes endelige konsentrasjoner var 0,3 mM for hver testløsning. I tillegg ble alle eksperimenter gjentatt etter tilsetning av 0,3 mM jern({{10}},15 mM jernholdig jern og 0,15 mM jernholdig jern) totalt per blanding. De valgte mengdene av antioksidanter og jern er ikke basert på fysiologiske eller matnivåer, de er basert på molare masser for å studere effekten av molekylær interaksjon. Følgelig ble det etablert et ekvimolart forhold mellom totale antioksidanter og jern. Alle blandinger ble kokt i 0, 10, 20 og 40 minutter i kokende vann, og deretter avkjølt på is for å stoppe oppvarmingsprosessen. Dette ble gjort for tre uavhengige replikater.

4.3.Fotometriske mål

Antioksidanter(rent eller blandet) i fravær og nærvær av jern ble målt for deres totale reduserende aktivitet og antioksidantaktivitet i tre uavhengige tekniske replikater ved bruk av en høygjennomstrømningsmetode i 96-brønnplater (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Ulike testanalyser ble brukt på grunn av de forskjellige reaksjonsmekanismene: enkeltelektronoverføring (SET) og hydrogenatomoverføring (HAT). Mens TEAC- og TPC-analysen er basert på SET [17,18], for DPPH-testanalysen, er litteraturen ikke helt klar om den er basert på SET, HAT eller til og med en kombinasjon av disse to mekanismene [{{6} }]. En fersk studie av Foti[51] oppdaget at fenoler kan reagere med DPPH via sekvensiell proton-tap elektronoverføring (SPLET), en kombinasjon av de to mekanismene. Faktorer, som middels polaritet og ioniseringspotensial, påvirker den dominerende mekanismen.

4.3.1. Totalt fenolinnhold (TPC)

Totalt fenolinnhold (TPC) ble bestemt ved å bruke Folin-Ciocalteu-metoden i en 96-brønnplate, som tidligere er beskrevet av Bobo-Garcia et al. [52] med noen modifikasjoner.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Det vanlige navnet på denne testen er misvisende fordi Folin-Ciocalteu-reagenset også reagerer på ikke-fenoliske stoffer, som vitaminer og mineraler [22]. Den beskriver bedre den "totale reduserende aktiviteten" til bioaktive forbindelser.

4.3.2. Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)

Antioksidantaktiviteten ble bestemt ved å bruke TEAC-analysen i en 96-brønnplate med noen modifikasjoner. En stamløsning med 9,6 mg ABTS og 1,66 mg kaliumpersulfat fylt opp med H2O til 25 ml ble fremstilt og inkubert i mørket ved romtemperatur i 12-16 timer. Fra denne stamløsningen ble en TEAC arbeidsløsning, inneholdende en 5 ml stamløsning fylt opp til 25 ml med 100 prosent MeOH, fremstilt.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Radical Scavenging

Deantioksidantactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Synergisme og antagonisme

For analyse av synergistiske og antagonistiske effekter av antioksidantaktiviteten, ble det gjort en sammenligning av resultatene oppnådd eksperimentelt med de teoretiske verdiene beregnet ved summen av effektene av individuelle komponenter ved tilsvarende konsentrasjon [53]. Synergisme beskriver en interaksjon av to eller flere stoffer slik at den kombinerte virkningen er større enn summen av hver som virker separat. I motsetning til dette er antagonisme et fenomen der interaksjonen av to eller flere stoffer i kombinasjon har en samlet effekt som er mindre enn summen av deres individuelle effekter.

4.5. Bestemmelse av ionisk jern

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Forskjellen mellom totalt jern og ionisk jern, summen av jernholdig og jernholdig jern, er bundet jern.

4.6.HPLC-DAD

For å kvantifisere antioksidantene askorbinsyre, 5-kaffeoylkinsyre og quercetin-3-rutinosid og nedbrytningsprodukter derav i de samme ekstraktene som brukes til fotometrien

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） ble forberedt. Avledede forbindelser ble foreløpig identifisert ved å analysere de rene standardene i nærvær og fravær av jern pre- og posttermisk prosessering. Derfor må den nye toppen stamme fra innsatsstandarden. Videre ble utvalgte blandinger målt via HPLC-MS for å verifisere den foreslåtte strukturen.

4.7. Statistisk analyse

Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, USA) og R Statistics (versjon 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) ble brukt til biostatistikktester og presentasjon og tegning av dataresultater. Inferensiell statistikk for å vurdere og koble behandlinger ble utført ved å bruke en treveis variansanalyse (ANOVA), en post hoc Tukeys HSD-test og Pearson-korrelasjon. R-pakkene som ble brukt var ggplot2 [55], betyr [56] og multcomp [57].

5. Konklusjoner

Basert på de ovenfor beskrevne funnene ble AOA for askorbinsyre, 5-kaffeoylkinsyre og quercetin-3-rutinosid påvirket av deres molekylstruktur, konsentrasjon, forhold og interaksjoner med andre antioksidanter og jern. Interaksjon ser spesielt ut til å spille en rolle i AOA når man kombinerer askorbinsyre og 5-kaffeoylkinsyre. Her ble synergistiske og antagonistiske effekter påvist. Temperaturen hadde minimal innflytelse på AOA, samtidig som temperaturen påvirket stabiliteten til alle antioksidanter i visse blandinger, spesielt i nærvær av jern. Bare askorbinsyrekonsentrasjonen sank i fravær av jern med forlenget koketid og 5-kaffeoylkinsyrekonsentrasjonen sank bare i nærvær av jern, mens quercetin-3-rutinosidkonsentrasjonen bare sank i kombinasjon med askorbinsyre i tilstedeværelse av jern. I kombinasjon med jern var 5-kaffeoylkinsyre i stand til å beskytte andre molekyler fra å bli redusert i konsentrasjon ved termisk prosessering.

I planter er kombinasjoner av askorbinsyre, 5-kaffeoylkinsyre og quercetin-3-rutinosid ikke bare mulige, men også vanlige. Derfor gir disse resultatene grunnleggende kunnskap om prosessene som skjer under koking av grønnsaker. Matmatriser er mer komplekse og inneholder utallige bioaktive forbindelser, inkludert enzymer, andre mineraler eller syrer, som endrer reaksjonsbetingelser eller er reaktanter i seg selv. Disse komplekse interaksjonene er langt utenfor rammen av denne studien og fordelaktige konsentrasjoner og interaksjoner avantioksidanteri kokte grønnsaker må tas opp i fremtiden.

Referanser

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Effekt av kakao i diabetes: Potensialet til bukspyttkjertelen og leveren som sentrale målorganer, mer enn en antioksidanteffekt? Int. J. Food Sci. Teknol. 2016, 51, 829–841. [CrossRef]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Fenoler, polyfenoler og tanniner: en oversikt. In-plant sekundære metabolitter: forekomst, struktur og rolle i menneskelig kosthold; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., red.; Blackwell Publishing: Hoboken, NJ, USA, 2006; s. 1–24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Overgangsmetaller som katalysatorer for "autoksidasjonsreaksjoner". Free Radic. Biol. Med. 1990, 8, 95–108. [CrossRef]

4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn, S.; Kroh, LW Effekt av termisk prosessering på flavonolene Rutin og Quercetin. Rapid Commun. Massespektrum. 2006, 20, 3229–3235. [CrossRef]

5. Layrisse, M.; García-Casal, MN; Solano, L.; Barón, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramírez, J.; Leets, I.; Tropper, E. Jernbiotilgjengelighet hos mennesker fra frokoster beriket med jernbis-glysinchelat, fytater og polyfenoler. J. Nutr. 2000, 130, 2195–2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, M.; Cook, JD Inhibering av ikke-haem jernabsorpsjon hos mennesker av polyfenolholdige drikker. Br. J. Nutr. 1999, 81, 289–295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostyuk, VA; Potapovich, AI Antiradikale og chelaterende effekter i flavonoidbeskyttelse mot silika-indusert celleskade. Arch. Biochem. Biofys. 1998, 355, 43–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Kejík, Z.; Kaplánek, R.; Masaˇrík, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipenský, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; Sykora, D.; Martásek, P.; et al. Jernkomplekser av flavonoider-antioksidantkapasitet og utover. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Struktur-aktivitetsrelasjoner Analyse av monomere og polymere polyfenoler (quercetin, rutin og katekin) oppnådd ved forskjellige polymeriseringsmetoder. Chem. Biologiske dykkere. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullón, B.; Lú-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: En gjennomgang av ekstraksjons-, identifiserings- og rensemetoder, biologiske aktiviteter og tilnærminger for å forbedre dens biotilgjengelighet. Trender matvitenskap. Teknol. 2017, 67, 220–235. [CrossRef]