Pentraxin-3-mediert komplementaktivering i en svinemodell av nyreiskemi/reperfusjonsskade

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divella et al

ABSTRAKT

Pentraxiner er en familie av evolusjonært konserverte mønstergjenkjenningsmolekyler med sentrale roller i medfødt immunitet og betennelse, slik som opsonisering av patogener under bakterielle og virusinfeksjoner. Spesielt har den lange Pentraxin 3 (PTX3) vist seg å regulere flere aspekter av vaskulær og vevsbetennelse under solid organtransplantasjon.

Vår studie undersøkte rollen til PTX3 som en mulig modulator av komplementaktivering i en svinemodell for nyreiskemi/reperfusjon (I/R) skade. Vi demonstrerte at I/R-skade-induserte tidlige PTX3-avsetninger ved peritubulære og glomerulære kapillære nivåer. Konfokal laserskanningsmikroskopi avslørte PTX3-avsetninger som samlokaliseres med CD31 pluss endotelceller. I tillegg var PTX3 assosiert med infiltrerende makrofager (CD163), dendrittiske celler (SWC3a) og myofibroblaster (FSP1). Spesielt demonstrerte vi signifikant PTX{10}}mediert aktivering av klassiske (C1q-mediert) og lektin- (MBL-mediert) komplementveier. Interessant nok er PTX3-avsetninger samlokalisert med aktivering av det terminale komplementkomplekset (C5b-9) på endotelceller, noe som indikerer at PTX3-mediert komplementaktivering hovedsakelig skjedde på renalt vaskulært nivå. Avslutningsvis indikerer disse dataene at PTX3 kan være et potensielt terapeutisk mål for å forhindre komplementindusert I/R-skade.

Korrespondanse til:Giuseppe Castellano

Nøkkelord:iskemi/reperfusjonsskade, komplementsystem, pentraxin 3,nyre, klassisk vei

Cistanche tubulosa forhindrer nyresykdom, klikk her for å få prøven

INTRODUKSJON

Iskemi-reperfusjon (I/R) skade representerer hovedårsaken til akuttnyreskadeetter transplantasjon og er preget av en betydelig aktivering av komplementsystemet [1, 2]. I dette scenariet spiller endotelceller (EC) en kritisk rolle i den maladaptive reparasjonen etter I/R, noe som fører til tidlig fibrose ved endotelial til mesenkymal overgang (EndMT) [3]. Under reperfusjonsfasen orkestrerer Complement immunologiske og inflammatoriske prosesser, og bidrar til ulike immun- og inflammatoriske sykdommer [2–5]. Andre essensielle komponenter i den humorale armen til det medfødte immunsystemet er representert av pentraxiner som antas å spille en sentral rolle i vaskulær biologi [6].

Pentraxiner er en familie av multimere løselige proteiner [6] som er klassifisert i korte og lange familier basert på deres struktur [7]. Disse evolusjonært konserverte proteinene er akuttfaseeffektorer, som fungerer som sensorer for betennelsesinitiering og raskt øker i plasma under infeksjon [8]. Den lange pentraxin 3 (PTX3) er et løselig mønstergjenkjenningsmolekyl som er avgjørende for medfødt immunbeskyttelse og kan aktivere komplementsystemet [9–11].

Spesielt induserte PTX3 klassisk og lektinveiaktivering ved å binde seg til C1q, MBL, Ficolin -2 og er i stand til å påvirke den alternative veien via CFH [10–12].

I motsetning til andre leverproduserte pentraksiner i blodet (dvs. CRP), kan PTX3 frigjøres av faste celler innenfor betennelsesstedet, for eksempel fra mononukleære fagocytter, dendrittiske celler, fibroblaster og EC [9] som virker på en parakrin måte [1. 3]. PTX3 lagres også i en ferdig form i nøytrofiler, lokalisert i spesifikke granuler og utskilles som respons på gjenkjennelsen av mikrobielle deler [14]. I EC induseres ekspresjonen av PTX3 lett av TNF- og IL-1, noe som gir en overgang fra en stillestående, antiinflammatorisk fenotype, til en prokoagulerende og proinflammatorisk tilstand, og regulerer derved den mikrovaskulære funksjonen sterkt [7, 8 ]. Av den grunn har PTX3-nivåer blitt beskrevet somkronisknyresykdomØkningen i proteinnivåer av PTX3 har vært korrelert med GFR-nedgang og kardiovaskulære komplikasjoner, men lite er fortsatt kjent om rollen til PTX3 i de tidlige settingene som I/R-indusert akuttnyreskade [15, 16].

Rollen til PTX3 i nyreinflammatoriske sykdommer er bivalent, fra en side kan proteinet aktivere klassiske og lektinveier som fremmer initial betennelse og skade [10–12]. På den andre siden svekket det N-terminale domenet til PTX3-modulert komplementaktivering leukocyttrekruttering og hemmet interstitiell fibrose ved akutt nyreskade som fremmer vevsreparasjon [17–20].

Komplement spiller en sentral rolle i patofysiologien til I/R-skadeindusert akuttnyreskade[21, 22]. I en svinemodell for nyre-I/R-skade demonstrerte vi den sentrale rollen til aktivering av komplementsystem for å indusere EndMT og tidlig fibrose, med involvering av både klassiske og lektinveier [23]. Dessuten demonstrerte vi at terapeutisk hemming av disse komplementveiene av rekombinant C1-INH (rhC1INH) ga en signifikant reduksjon i komplementavsetning, med redusert rekruttering av infiltrerende inflammatoriske celler og tubulointerstitiell skade [23]. Disse resultatene ble også bekreftet av Delpech PO et al [24]; en signifikant modulering i C1q, MASP og C4d glomerulær og tubulær avsetning ble vurdert etter 30 minutter etter reperfusjon, noe som indikerer en sentral rolle for C1-INH for å motvirke klassiske og lektinveier.

I denne studien undersøkte vi mulig involvering av PTX3 i mediering av tidlig komplementaktivering ved nyre-I/R-skade, som karakteriserte de forskjellige cellulære kildene til PTX3.

RESULTATER

PTX3 uttrykkes av endotelceller og immuninfiltrerende celler i en svinemodell av I/R-skade

Først undersøkte vi tilstedeværelsen av PTX3 i en svinemodell av varm I/R-indusert nyreskade. Vi observerte svært begrensede PTX3-avsetninger i normalt vev (figur 1A). I/R-skade forårsaket en diffus avsetning av PTX3 allerede 15 minutter etter reperfusjon (Figur 1B, 1C) i det tubulointerstitielle området (Figur 1E), ved peritubulære kapillærer (Figur 1D; pil) og ved glomerulære nivåer (Figur 1D). PTX3-avsetninger var fortsatt påviselige 1 time etter reperfusjon på nivået av peritubulære kapillærer (figur 1G). I vårt tidligere arbeid [23] demonstrerte vi at hovedtrekkene ved I/R-skade er tubulær epitelcelle-apoptose og rekruttering av infiltrerende inflammatoriske celler som monocytter, dendrittiske celler og lymfocytter. Likevel, ved rutinemessig histologisk evaluering (tilleggsfigur 1), demonstrerte vi at 30 minutter med varm iskemi etterfulgt av 15 minutter med reperfusjonsindusert tidlig tubulus interstitiell skade, karakterisert ved større kapillær kongestion og fokal cytoplasmatisk vakuolering av nyretubuli epitel, sammenlignet med basal. tilstand.

For ytterligere å karakterisere den cellulære lokaliseringen av PTX3-avsetninger og evaluere dens potensielle effekt i moduleringen av inflammatorisk respons og skade, utførte vi dobbeltimmunfarging og konfokal mikroskopianalyse. PTX3-proteinekspresjon ble påvist i det meste av EC ved peritubulære (figur 2A) og glomerulære (figur 2B) kapillære nivåer, 15 minutter etter reperfusjon.

Det er velkjent at I/R-skade er preget av økt aktivering av de medfødte og adaptive immunresponsene, inkludert inflammatorisk celletrafikk inn i det syke organet som ytterligere forverrer skaden via immunceller og komplementsystemet [25]. I vår svinemodell observerte vi også, allerede 15 minutter etter reperfusjon, et tett inflammatorisk infiltrat som hovedsakelig består av makrofager og dendrittiske celler i tubulus-interstitialområdet. Vi fant at begge disse antigenpresenterende cellene ble karakterisert av økt PTX3-ekspresjon sammenlignet med T0 siden vi observerte et økt antall CD163 pluss /PTX3 pluss (Figur 2E, 2F, 2K) og SWC3a pluss /PTX3 pluss (Figur 2G, 2H, 2L) celler ved tubulus interstitielle nivåer ved T15.

PTX3-uttrykk kan bidra til EndMT ved I/R-skade

I tidligere observasjoner demonstrerte vi at I/R-skade var ansvarlig for EndMT [26, 27], karakterisert ved ervervelse av en mesenkymal fenotype av EC med tap av spesifikke endotelmarkører og forsterkning av mesenkymale markører, for eksempel fibroblastspesifikke protein 1 (FSP-1), nevronalt cadherin (N-cadherin) og alfa-glattmuskelaktin (alfa-SMA). Dermed undersøkte vi om PTX3-uttrykk av EC kunne påvirke denne prosessen. Som forventet, da vi undersøkte alfa-SMA-uttrykk, som markører for aktivert myofibroblast, fant vi ingen samlokalisering mellom alfa-SMA og PTX3 (figur 2C, 2D). Tvert imot observerte vi en økning i tubulointerstitiell FSP1 pluss /PTX3 pluss myofibroblaster gjennom observasjonsperioden (figur 2K–2M).

PTX3-avsetninger er assosiert med aktivering av komplementsystemet

Til slutt undersøkte vi om PTX3-avsetninger var assosiert med komplementaktivering. Faktisk, som med andre komponenter i pentraxin-familien, kan PTX3 regulere aktiveringen av den klassiske komplementveien [7]. For å definere forholdet mellom PTX3 og komplementaktivering, utførte vi dobbeltmerket immunfluorescens for å evaluere uttrykket av PTX3 og den terminale Komplementkompleks, C5b-9, ved bruk av et antistoff rettet mot en C9-neoepitop. Vi observerte en betydelig samlokalisering av PTX3- og C5b{12}}-avsetninger (figur 3A, 3B). Komplementterminalkomplekset ble lokalisert på peritubulært nivå så vel som innenfor de peritubulære kapillærene sammen med endotelcellelaget, som vi tidligere har vist [23, 28]. Siden PTX3 kan aktivere komplementsystemet gjennom de klassiske og lektin-veiene, evaluerte vi avsetningen av C1q og MBL i nyreparenkym. Interessant nok ble C1q (Figur 3E, 3F) og MBL (Figur 3C, 3D) avsetninger hovedsakelig funnet på interstitielt og kapillært nivå (Figur 3C til 3F), som tidligere beskrevet [23] og kolokalisert med PTX3-avsetninger.

C1-hemmer forstyrrer PTX3-binding på endotelceller

I vårt tidligere arbeid [23] viste vi at administrering av C1-hemmer førte til en betydelig reduksjon i komplementavsetning, med redusert rekruttering av infiltrerende inflammatoriske celler og tubulointerstitiell skade. Derfor undersøkte vi nivået av PTX3-ekspresjon i rhC1-INH-behandlede dyr. Vi fant at infusjonen av C1--hemmer reduserte PTX3-avsetninger ved peritubulære kapillærer og interstitielt nivå etter 15 minutter etter reperfusjon (figur 4A).

Dessuten, for å støtte hypotesen om at reduksjonen av PTX3-avsetninger hos rhC1-INH-behandlede dyr var assosiert med hemming av endotelskade, utførte vi in ​​vitro-eksperimenter og evaluerte rhC1-INH- og PTX3-binding på dyrket EC under normale forhold eller i nærvær av cellulær stress (Figur 4B). FACS-analyse viste at EC under normale forhold ikke binder både rhC1-INH og PTX3. I samsvar med vår tidligere studie [26], observerte vi økt cellulær binding av rhC1-INH på H2O2-stimulert EC sammenlignet med basale forhold. Dessuten, i fravær av rhC1-INH, kan PTX3 binde aktivert EC. Interessant nok, når H2O2-aktivert EC ble inkubert med PTX3 og rhC1-INH, observerte vi at C1INH var i stand til å beskytte EC ved blokkering av PTX3-binding.

DISKUSJON

I denne studien demonstrerte vi PTX3-avsetning i den tidlige fasen av nyre-I/R-skade og dets mulige bidrag til utviklingen av EndMT. Interessant nok fant vi at PTX3-mediert komplementaktivering hovedsakelig skjer på vaskulært nivå, og samlokaliseres med C1q og MBL, gjenkjennelsesmolekylene til klassiske og lektinveier i komplementkaskaden.

I/R-skade utløser en markert inflammatorisk respons preget av komplementaktivering, oksygenfrie radikaler og proinflammatorisk cytokinproduksjon, noe som resulterer i aktivering av vaskulært endotel og perifere leukocytter [29, 30]. Under I/R-skade fører komplementaktivering til avsetning av komplementkomponenter på overflatemembranen av skadet og dysfunksjonell EC, med samtidig generering av anafylatoksiner og amplifisering av den inflammatoriske prosessen [31]. Under betennelse øker PTX3 raskt og kan spille en sentral rolle i å modulere endotelrespons. PTX3 har faktisk blitt indikert som en potensiell biomarkør for vaskulær endotel dysfunksjon ved flere sykdommer, inkludert kroniskenyresykdom, svangerskapsforgiftning og flere vaskulære sykdommer [7, 16, 17, 32]. Vi viste også at PTX3 er involvert i andre vaskulære komplikasjoner som svikt i arteriovenøs fistel hos hemodialysepasienter [33]. Disse observasjonene tyder på at PTX3 kan være en bro mellom inflammatorisk respons og endoteldysfunksjon [34]. I tråd med disse studiene observerte vi PTX3-avsetninger på endotelnivå allerede etter 15 minutter etter reperfusjon (figur 2A, 2B). Resultatene våre viste også at i den tidlige fasen av I/R-skade, kolokaliserte PTX3 med myofibroblastmarkør, FSP-1 (Figur 2I, 2J), men ikke med alfa-SMA, en markør uttrykt av aktivert myofibroblast (Figur 2C, 2D). Til sammen kan disse dataene tyde på at endoteldysfunksjon og EndMT-prosessen [35], observert i I/R-dyr [26], først skjedde i EC som uttrykker PTX3.

Forbindelsen mellom PTX3 og inflammatoriske celler er allment anerkjent. I denne artikkelen fokuserte vi spesifikt på de iboende effektene av PTX3 i interstitiell infiltrasjon av leukocytter som er en hovedkilde til PTX3 [36]. Spesielt fant vi makrofager og dendrittiske celler, etter 15 minutter etter reperfusjon, som uttrykte høyere nivåer av PTX3 (figur 2E til 2H). Disse dataene er i samsvar med den økende mengden av bevis som antyder en relevant rolle for medfødt immunitet i å formidle tidlig skade ved I/R-skade [23]. Tidlig aktivering av komplement i nyrevev etter I/R-skade fører til generering av flere inflammatoriske mediatorer som øker rekrutteringen av immunceller [21, 23, 37, 38]. Nyere studier har identifisert PTX3 som en av hovedkomponentene i nettverket som orkestrerer den inflammatoriske responsen utløst av I/R-skade [39]. I forskjellige eksperimentelle modeller av I/R-skade kan PTX3 utøve to motsatte roller på spesifikt vev [40, 41]. Tidlig produksjon av PTX3 er assosiert med nyreskade siden det induserer tidlig ekspresjon av endoteliale adhesjonsmolekyler og kjemokiner som akselererer den lokale maladaptive inflammatoriske responsen.

Tvert imot forhindrer den langvarige lokale produksjonen av PTX3 overdreven organbetennelse og dysfunksjon [41].

PTX3 er en komplement-kaskademodulator [9, 42]; dette er i samsvar med pleiotropiske egenskaper til PTX3, noe som indikerer en dobbel rolle til PTX3 som en modulator eller forsterker av den medfødte immunresponsen [39]. Til å begynne med aktiverer PTX3 komplement ved å binde C1q og MBL [43]; tidlig økt betennelse må imidlertid begrenses til målområdet. Derfor kan PTX3, ved å rekruttere faktor H eller hemme angiogenese, også redusere den inflammatoriske responsen og komplementaktivering som bevarer nyreparenkym fra inflammatorisk skade [43]. Selv om komplementaktivering i I/R hos gnagere hovedsakelig er lokalisert på tubulært nivå [44], under reperfusjonsfasen, er endotelet det primære målet for forskjellige pro-inflammatoriske midler, inkludert komplementmediatorer [2]. Vi har tidligere vist at i svinemodellen for I/R-skade så vel som hos DGF-pasienter, skjer aktiveringen av komplementsystemet i den tidlige fasen, på peritubulære kapillærer, i interstitium og på det glomerulære endotelet [23]. Dataene våre viste en tydelig samlokalisering av C5b-9-avsetninger på PTX3 pluss EC etter 15 minutter etter reperfusjon (Figur 3A, 3B). Derfor ser nyreendotelet ut til å være det utbredte stedet for PTX3-mediert komplementaktivering i den tidlige fasen av I/R-skade i både prekliniske og kliniske omgivelser.

Interaksjonen mellom pentraxiner og C1q og dens rolle i aktiveringen av den klassiske komplementveien er godt beskrevet [45–47]. I sammenheng med de medfødte immunresponsene kan PTX3 binde forskjellige komplementkomponenter og modulere komplementaktivering [43, 48]. PTX3 aktiverer komplement ved C1q-binding [49]. Resultatene våre i dyremodellen viste tydelig at PTX3 kan formidle klassisk baneaktivering ved å samhandle med C1q (figur 3E, 3F). Dessuten modulerer PTX3 også lektinveien til komplementet, som vist i figur 3C, 3D. MBL binder PTX3 via sitt kollagenlignende domene [45] og MBL/PTX3-komplekser rekrutterer C1q og fremkaller C3- og C4-avsetning på målcelleoverflater.

Til sammen antyder disse resultatene den sentrale rollen til PTX3 i formidlingnyreskade i I/R-skade, som kan ha viktige implikasjoner for komplement-rettet behandling ved nyre-I/R-skade.

I vår forrige studie [26] undersøkte vi involveringen av komplement i mediering av EC-aktivering ved å bruke en rekombinant form av C1-INH, en potent hemmer av proteaser av de klassiske og lektinkomplementveiene (C1r, C1 s, og MASP2). I den samme dyremodellen viste vi (Figur 4A) at terapeutisk hemming av begge veier av rhC1INH reduserte PTX3-avsetninger ved peritubulære kapillærer og interstitielt nivå etter 15 minutter etter reperfusjon. Disse dataene bekreftet med in vitro-resultater på EC (figur 4B), førte til at vi antok at rhC1INH kan beskytte skadet EC ved blokkering av PTX3-binding. I litteraturen er det bevis på bindingen av C1-INH til endoteliale adhesjonsmolekyler, uttrykt på aktivert endotel, kalt selektiner, spesielt P- og E-selektiner [50, 51]. Denne bindingen til EC kan forstyrre endotel-leukocytt-interaksjon under betennelse, og den representerer en annen viktig anti-inflammatorisk mekanisme [50, 51]. Derfor antok vi at rh-C1INH kan binde aktivert EC og medierer lokal regulering av komplementaktivering og inflammatorisk prosess. I våre tidligere studier har vi demonstrert involvering av komplement i I/R-skade og andre immunmedierte nyresykdommer [38, 52–54]. Mekanismene for komplementaktivering i denne dyremodellen kan ha viktige implikasjoner for tolkningen av data som forventes i menneskelig setting. For å lykkes med å utvikle terapeutiske intervensjoner rettet mot komplementaktivering [36, 54], er det viktig å fastslå gyldigheten av svinedata i forhold til det som skjer under kliniske omstendigheter. Siden denne forskningen er begrenset til observasjonsstudier, er ytterligere eksperimenter nødvendig for å avgrense de sammenkoblede mekanismene mellom PTX3 og komplement som kan fremheve nye terapeutiske strategier. Fra resultatene ovenfor støtter våre data hypotesen om at PTX3 kan regulere flere aspekter av komplementmediert I/R-skade og dermed representere et potensielt terapeutisk mål.

MATERIALER OG METODER

Renal I/R skade grismodell

Dyremodellen for nyre-I/R-skade ble utviklet som tidligere beskrevet [23]. Etter godkjenning av den etiske komiteen i Helsedepartementet gjennomgikk 4-måned gamle hunner, store hvite griser (n=8, n=4 for gruppe, 20 kg) eksperimentell åpen kirurgisk prosedyre under generell anestesi. Dyrene fastet i 24 timer før induksjon av anestesi. Elektrokardiogrammet, hjertefrekvensen, hemoglobinmetningen av oksygen, respirasjonsgasssammensetning, respirasjonsfrekvens, tidalvolum, luftveistrykk, systolisk arterielt blodtrykk og sentralvenetrykk ble kontinuerlig overvåket og registrert automatisk (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Finland) . Venstre nyrearterie og vene ble isolert og en karløkke ble plassert rundt nyrearterien med en rettvinklet klemme. En nyrebiopsi ble utført før iskemi (T0). Deretter ble den iskemiske fasen indusert (30 min) ved å trekke i karløkken. Flere biopsier ble deretter utført 15, 30 og 60 minutter etter reperfusjon; dyrene ble avlivet 24 timer etter den kirurgiske prosedyren. En del av hver biopsiprøve ble umiddelbart hurtigfryst i medium med optimal kuttetemperatur (Tissuetek, Pittsburgh, PA) og lagret i flytende nitrogen. En annen porsjon ble fiksert i bufret formalin (4 prosent) i 12 timer og innleiret i parafin ved bruk av standardprosedyrer.

Mikroskopistudie

Parafininnstøpte nyreprøver fra nyrebiopsier ble brukt til konvensjonell histologisk farging (H&E, periodic acid-Schiff). Bildene ble hentet av Aperio ScanScope CS2-enheten (Aperio Technologies, Vista, CA, USA). Tubulus-interstitielle og glomerulære lesjoner ble evaluert ved hjelp av en kvalitativ analyse av to observatører (CD, MR) som ikke var klar over opprinnelsen

Antistoffer

De primære antistoffene som ble brukt i denne studien gjenkjente følgende antigener: PTX3 (MNB4: direkte mot PTX3 N-terminalt domene, Exira Life Sciences In., Larsen, Sveits); CD163 (monocytter/makrofager, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (dendritiske celler, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (fibroblastspesifikt protein 1, Abcam, Cambridge, Storbritannia); alfa-glatt muskel-aktin (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, USA); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Storbritannia); MBL (3E7: direkte mot MBL karbohydratgjenkjenningsdomene, Hycult biotechnology, Uden, Nederland) og C9 neoantigen (aE11, Hycult bioteknologi). Kryssreaktiviteten ble validert ved å pre-inkubere de spesifikke antistoffene, før de ble brukt, med humane peptider som ble brukt til å øke dem. Pre-inkubasjonen opphevet spesifikk farging på svinevev.

Vevsimmunfluorescens og konfokal laserskanningsmikroskopi

Karakteriseringen og lokaliseringen av PTX3-signalet ble undersøkt på frosset vev inkludert i OCT-medium (Tissue-Tek). Objektglassene ble inkubert med 5 prosent kaninserum i 1 time ved 37 grader C. Objektglassene ble deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med spesifikke antistoffer. Etter tre vaskinger i PBS ble objektglass deretter inkubert med de passende sekundære antistoffene (Alexa Flour 488 og 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Alle seksjoner ble motfarget med TO-PRO-3 (Molecular Probes). Negative kontroller ble tilberedt med irrelevante antistoffer. Seksjonene ble analysert ved å bruke Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Tyskland) konfokalt laserskanningsmikroskop. Antallet infiltrerende celler ble målt i minst 10 høyeffekts (x630) felt/seksjon av to uavhengige observatører blindet for opprinnelsen til lysbildene. De endelige tellingene var gjennomsnittet av de to målene. I ingen tilfeller var interobservatørvariabiliteten høyere enn 20 prosent.

Cellekultur og flowcytometrianalyse

Humane navlevene-endotelceller (HUVEC, EC) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Italia). EC ble dyrket i deres anbefalte medium, EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland). EC ble belagt med en tetthet på 1{{10}},000celler/cm2 og ble stimulert med H2O2-behandling (3 prosent, 1 time). Deretter ble basal og stimulert EC vasket to ganger med PBS og ble fjernet med PBS-EDTA 2mM og trypsin 0.001×. Deretter ble cellene resuspendert i PBS og ble inkubert med henholdsvis PTX3 (rekombinant human PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Tyskland) (1 ug/ml) eller/og med rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5 ug) /ml) i 60 min. Etter vask tre ganger med PBS 1X, ble cellene resuspendert i flowcytometri (FACS) buffer (fosfatbufret saltvann, pH 7,2, 0,2 prosent bovint serumalbumin og 0,02 prosent natriumazid) og inkubert med FCR-blokkerende reagens (Miltenyi Biotec) for 10 min ved romtemperatur. Etter blokkering ble EC-er inkubert med kanin-anti-human C1-INH (levert av prof. M. Daha, University of Leiden, 1//100 fortynning) eller/og med rotte-anti-PTX3 (MNB4, Exira Life) Sciences In., 1/20 fortynning) ved romtemperatur i 30 minutter og vasket med FACS-buffer. Deretter ble cellene inkubert med geit anti-kanin IgG PE (Molecular Probes, 1/100 fortynning) eller/med anti-rotte IgG FITC (Molecular Probes, 1/100 fortynning) ved romtemperatur i 30 minutter og vasket tre ganger. Celler ble analysert med FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) og Kaluza-programvare. Området med positivitet ble bestemt ved å bruke en isotype-tilpasset mAb, og totalt ble det innhentet 104 hendelser for hver prøve. Tre uavhengige eksperimenter ble utført.

Statistisk analyse

Data presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) og sammenlignes ved bruk av variansanalyse eller paret Student t-test, etter behov. Forskjeller ble ansett som statistisk signifikante når p-verdier var mindre enn 0.05. Data ble analysert ved å bruke Statview-programvarepakken (5.0 versjon) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA). Grafer ble vist med GraphPad Prism Software 5.

Forkortelser

I/R: iskemi/reperfusjon; EC: endotelceller; PTX3: pentraxin 3; FSP-1: fibroblastspesifikt protein 1; N-cadherin: neuronalt cadherin; alfa-SMA: alfa-glatt muskel-aktin.

FORFATTERBIDRAG

CD koordinerte studien, deltok i immunmerking og konfokalmikroskopi av nyreseksjoner, og utarbeidet manuskriptet. AS og RF deltok i utformingen av studien, bidro til dataanalyse, utførte in vitro-eksperimenter og reviderte manuskriptet kritisk. MR og GSN utførte histopatologisk bildeanalyse. LL, FS, AMC utførte dyremodellen for iskemi-reperfusjonsskade og bidro til å revidere manuskriptet. GL, PD og MB utførte alle kirurgiske prosedyrer på grisemodellen og bidro til å revidere manuskriptet. MRD, P.vdP., C.vK. og FS reviderte manuskriptet.

PP, ER, GG, GS og LG reviderte manuskriptet kritisk. GC leverte nye analyseverktøy, designet og overvåket forskningen. CD, AS og RF bidro like mye til denne studien. Alle forfattere bidro til artikkelen og godkjente den innsendte versjonen.

TAKK

Vi takker Claudia Curci fra nyre-, dialyse- og transplantasjonsenheten, avdelingen for akutt- og organtransplantasjon,

Universitetet i Bari for utmerket teknisk assistanse.

INTERESSEKONFLIKTER

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

FINANSIERING

Denne studien ble støttet av University of Bari "Aldo Moro", det italienske helsedepartementet (GR 2016- 02362239 "A transcriptomics – based approach for the identification of prediktive faktorer og terapeutiske mål for forsinket graftfunksjon inyretransplanterte mottakere", Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD mottok et stipend på dette prosjektet) og Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 "Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori"- AIM-1810057-aktivitet 2 gitt til AS

REFERANSER

1. Bonventre JV, Yang L. Cellulær patofysiologi av iskemisk akuttnyreskade. J Clin Invest. 2011; 121:4210–21.

2. Jang HR, Rabb H. Den medfødte immunresponsen ved iskemisk akuttnyreskade. Clin Immunol. 2009; 130:41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Komplement: et nøkkelsystem for immunovervåking og homeostase. Nat Immunol. 2010; 11:785–97.

4. Thurman JM, Holers VM. Den sentrale rollen til den alternative komplementveien i menneskelig sykdom. J Immunol. 2006; 176:1305–10. PMID:16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Betennelses- og komplementsystem: En kobling mellom akuttNyreSkade og kronisk graftskade. Front Immunol.

2020; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraxins i medfødt immunitet: leksjoner fra PTX3. Cell Tissue Res. 2011; 343:237–49.PMID:20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Long pentraxin 3 (PTX3) i lys av dets struktur, virkningsmekanisme og kliniske implikasjoner. Autoimmunitet. 2012; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3(PTX 3): en endogen modulator av den inflammatoriske responsen. Mediatorer Inflamm. 2012; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraxins i krysningspunktet mellom medfødt immunitet, betennelse, matriseavsetning og kvinnelig fertilitet. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66.115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Den lange pentraxin PTX3 som en prototypisk humoral mønstergjenkjenningsreseptor: samspill med cellulær medfødt immunitet. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Synergi mellom ficolin-2 og pentraxin 3 øker medfødt immungjenkjenning og komplementavsetning. J Biol Chem. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 modulerer immunoflogosen i tumor mikromiljø og er en prognostisk faktor for pasienter med klarcellet nyrecellekarsinom. Aldring (Albany NY). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Den lange pentraxin PTX3 er avgjørende for vevsbetennelse etter

tarmiskemi og reperfusjon hos mus. Am J Pathol. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Den humorale mønstergjenkjenningsreseptoren PTX3 lagres i nøytrofile granuler og lokaliseres i ekstracellulære feller. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID:17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Plasma pentraxin 3 hos pasienter med kroniskenyresykdom: assosiasjoner til nyrefunksjon, protein-energi, sløsing, kardiovaskulær sykdom og dødelighet. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Forhøyede sirkulasjonsnivåer og vevsuttrykk av pentraxin 3 i uremi: en refleksjon av endotelial dysfunksjon. PLoS One. 2013; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Rollen til den løselige mønstergjenkjenningsreseptoren PTX3 i vaskulær biologi. J Cell Mol Med. 2007; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. Pentraxinene PTX3 og SAP i medfødt immunitet, regulering av betennelse og vevsremodellering. J Hepatol. 2016; 64:1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Pentraxin 3 hemmer akutt nyreskade-indusert interstitiell fibrose gjennom undertrykkelse av IL-6/Stat3-veien. Betennelse. 2014; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. The "sweet" side of a long pentraxin: how glycosylation affects PTX3 functions in innate immunity and inflammation. Front Immunol. 2013; 3:407. PMID:23316195