Positiv korrelasjon mellom renal tubular flattening og renal tubular skade/interstitiell fibrose i murine nyresykdomsmodeller
Mar 17, 2022
ABSTRAKT.Antall pasienter med kroniske nyresykdom(CKD) vokser kontinuerlig globalt. For å studere patogenese og mekanismer er det utviklet mange dyremodeller, inkludert spontane, genetiske og induserte modeller. Selv om hver type CKD viser sykdomsspesifikke vevsendringer i de tidlige stadiene, forekommer tubulær lidelse og interstitiell fibrose histologisk i løpet av progresjonen til sluttstadietnyresvikt. Derfor er kvantifiseringen av tubulær lidelse og interstitiell fibrose i CKD-forskning ved bruk av dyremodeller avgjørende for å måle graden av CKD alvorlighetsgrad og dermed effekten av terapeutiske midler. Flere strategier har blitt brukt for å kvantifisere interstitiell fibrose. Blant poengfaktorer,nyrerørformet flating kan kvantitativt vurderes enkelt og rimelig. Men den diagnostiske verdien avnyreEvaluering av tubulær flatting har ikke blitt undersøkt tidligere. Derfor har vi i denne studien undersøkt sammenhengen mellomnyretubulær flatting og interstitiell fibrose ellernyrerørformede skademarkører. Vi observerte en sterk sammenheng mellom graden av tubulær skade/interstitiell fibrose ognyrerørformet utflating i tre typer musnyresykdommodeller. Dette er fordelaktig fordi raskt fremmende teknologier som kunstig intelligens og bildebehandling lett kan brukes; derfor bør en mer presis, objektiv og kvantitativ diagnose være mulig i fremtiden.
Nøkkelord:interstitiell fibrose, nyresykdom, renal tubulær flating, renal tubulær skade; nyresvikt
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESYKDOM
Pasienter med kroniskenyresykdom(CKD) viser symptomer på proteinuri eller en langvarig (mer enn tre måneder) reduksjon i glomerulær filtrasjonshastighet [15]. Denne sykdommen er kategorisert i høyrisikogruppen av pasienter med sluttstadiumnyresvikt.Antallet pasienter med CKD vokser kontinuerlig globalt. Når CKD utvikler seg, fører det til sluttstadietnyresvikt, som krever dialytisk behandling som koster enorme beløp, noe som fører til en økning i medisinske utgifter [14]. Derfor er utviklingen av nye markører for å overvåke utbruddet og progresjonen av CKD og etablering av nye behandlingsmetoder sterkt nødvendig. Vanlige årsaker til CKD inkluderer diabetes, høyt blodtrykk, glomerulær sykdom og andre CKD risikofaktorer. Selv om hver type CKD viser sykdomsspesifikke vevsendringer i de tidlige stadiene, forekommer tubulær lidelse og interstitiell fibrose histologisk i løpet av progresjonen til sluttstadietnyresvikt. Nyrefibrose er vevsforandring som hovedsakelig er assosiert med CKD-relatert tubulær lidelse og interstitiell fibrose og regnes som et betydelig behandlingsmål for å forhindre progresjon til sluttstadietnyresvikt[25]. Derfor er kvantifiseringen av tubulær lidelse og interstitiell fibrose i CKD-forskning ved bruk av dyremodeller avgjørende for å måle graden av CKD alvorlighetsgrad og dermed effekten av terapeutiske midler. Flere strategier har blitt brukt for å kvantifisere interstitiell fibrose, inkludert Sirius rødfarging eller Massons trikromfarging for å kvantifisere fibrilleringsregioner, tubulær lidelse scoring for morfologisk analyse avnyretubuli, og ulike skademarkører, som -SMA, nøytrofil gelatinase-assosiert lipocalin (NGAL), L-FABP og Kim-1 [6, 7, 9, 10, 16, 23]. Den tubulære lidelsen inkluderer utflating, ekspansjon, degenerasjon, atrofi og tap av børstekanternyretubuli [27]. Blant disse poengfaktorene,nyretubulær flatting (reduksjon i høyde) kan kvantitativt vurderes enkelt og rimelig [1–3, 19, 20]. Imidlertid har den diagnostiske verdien av nyretubulær flattende evaluering ikke blitt undersøkt tidligere. Derfor analyserte vi korrelasjonen mellom graden av interstitiell fibrose ognyrerørformet utflating innnyresykdom.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKSJONEN
MATERIALER OG METODER
Etisk utsagnAlle dyreforsøk ble godkjent av presidenten for Kitasato University, etter vurdering av Institutional Animal Care and Use Committee ved Kitasato University (godkjennings-ID: nr. 19-153,19-154, 19-155). FVB/NJcl (FVB) og BALB/cAJcl (BALB/c) hannmus ble oppnådd fra CLEA (Tokyo, Japan). Alle mus ble holdt under spesifikke patogenfrie forhold. De fikk tilgang til steril mat og vann ad libitum før og under forsøk.DyrTns2nph modell: FVB-Tns2nph mutant mus (FVB-nph) ble brukt som CKD modell som beskrevet i [22]. Iskemi-reperfusjonsmodell (IR): IR-modellen er opprettet ble utført som beskrevet tidligere [18]. Åtte uker gamle mus (Male FVB) ble bedøvet ved inhalering av isofluran og de venstre nyrene ble fjernet, deretter ble muskellaget og ansiktet lukket ved bruk av absorberbar sutur. Etter ti dager med bedring ble mus bedøvet ved intraperitoneal injeksjon av kombinasjonen av anestesimedisiner som beskrevet tidligere [11], deresnyrearterier og vener ble holdt i en iskemisk tilstand med arterieklemmer (TKS-1-40, BEAR Medic, Ibaraki, Japan) i henholdsvis 30 og 60 minutter, deretter ble muskellaget og ansiktet lukket ved bruk av absorberbar sutur. I tillegg ble kontrollmus som gjennomgikk falsk kirurgi utsatt for åpen kirurgi uten klemmer. Etter det ble alle mus avlivet ved inhalering av en overdose isofluran (Escain, Pfizer Japan Inc., Tokyo, Japan) for å utføre prøvesamlingen. Denyrerble fjernet 24 timer etter replikering av iskemi. Adriamycin (ADR)-indusert nefropatimodell: nefropatimodell: BALB/c-mus i alderen åtte uker ble administrert enten ADR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Ltd., Osaka, Japan) (10 mg/kg) eller saltvannsoppløsning (bilgruppe) ) via halevenen for å evaluere deresnyrelidelsehistologisk 14 dager etter administrering.
HistologiMus Nyrene ble fiksert med 4 prosent paraformaldehyd (PFA) ved 4 grader over natten.Nyreblokker ble skåret i skiver ved 2 µm (for periodisk syre-Schiff (PAS)-farging) og 4 µm (for Picro-Sirius Red-farging). Tilnyrerørformet høydemåling, cortex-sidene avNyreseksjoner ble fotografert tilfeldig i fire forskjellige visninger (×100). To uavhengige forskere målte blindtnyrerørformet høyde i alle visninger for å beregne gjennomsnittshøyden til hvert emne. For forsøkspersonene med ujevn rørhøyde ble målinger av to til fem steder valgt per tubuli for å oppnå gjennomsnittsverdien (fig. 1A). Omtrent 700 rørformede høydemålinger ble oppnådd per forsøksperson ved å bruke den ovennevnte prosedyren for å beregne gjennomsnittsverdien for hvert individ. For Sirius Red-farging ble objektglass avparafinisert og farget 1 time med Siriusrød i mettet vandig pikrinsyre og vasket med 0,5 prosent eddiksyre. For å skåre fibrilleringsområder ved bruk av Sirius-rødfarging, ble målområdene fotografert tilfeldig i åtte visninger (×100), og de positive områdene ble kvantifisert ved å bruke ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) for å beregne beleggsgraden deres med hensyn til det totale arealet. Glomeruli farget med Sirius rødt og blodårer ble ekskludert fra beregningen.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREINFEKSJON
ImmunkjemifargingNyreseksjoner (5 µm) ble avparafinisert og utsatt for antigeninnhenting i sitratbuffer, ved 121 grader i 15 minutter. etter vask med Tris-bufret saltvann (TBS),Nyreseksjoner ble forseglet med 0,3 prosent hydrogenperoksid/metanol i 20 minutter, og deretter inkubert over natten ved 4 grader med anti-NGAL-antistoff (Abcam, Cambridge, Storbritannia). Snittene ble vasket med TBS og deretter inkubert med sekundært antistoff (Histofine SimpleStain MAX PO (kanin), Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japan) i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vasking med TBS ble seksjonene inkubert med 3,3'-diaminobenzidin (DAB) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) og hematoksylin ved romtemperatur. For å skåre tubulær lidelse via immunkjemifarging ved bruk av et anti-NGAL-antistoff, ble vevsprøver fotografert tilfeldig i åtte visninger (×100), og områdene med DAB-farging ble kvantifisert ved å bruke ImageJ for å beregne beleggsgraden med hensyn til det totale arealet.
StatistikkData ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Studentens t-test ble brukt for å teste for signifikante forskjeller mellom to grupper, og Bonferronis multigruppetest ble brukt for å teste for flere grupper. P-verdi<0.05 was="" statistically="" significant.="" bonferroni's="" multigroup="" test="" was="" carried="" out="" using="" graphpad="" prism="" 5="" software="" (mdf,="" tokyo,="">
RESULTATER Som nevnt ovenfor, bør kvantifiseringen av de interstitielle fibrotiske områdene ved bruk av Sirius rødfarging være standard evalueringsmetode for tubulære lidelser hos pasienter mednyresykdomeller innnyresykdommodeller. For kvantifisering av tubulær lidelse og interstitiell fibrose ved bruk av dyr CKD murin modell, brukte vi FVB-Tns2nph mutant mus (FVB-nph), som er en CKD dyremodell som viser mange symptomer på human CKD som utvikler seg gradvis over en lengre periode , inkludert genetisk utbrudd av glomerulosklerose fra fødselen, fibrillering av tubulointerstitium,nyreanemi, ognyresvikt[17, 21, 22]. FVB-nph-musen reproduserer de typiske symptomene observert i human CKD-progresjon. I denne studien introduserte vi nph-mutasjonen i FVB-linjer som er mottakelige for nefropati. FVB-nph-gruppen viste mer tubulær flating enn WT-gruppen, basert på forverring av fibrillering av interstitium inyretubuli (fig. 1B–D). Lineær regresjonsanalyse indikerte en signifikant motsatt korrelasjon mellom tubulær høyde og grad av interstitiell fibrose (R2=0.7086: P=0.0023) (Fig. 1E).
Fig. 1. (A) Måling av tubulær epitelcellehøyde. Røde søyler indikerer rørhøyde. (B) Representative bilder av periodisk syre-Schiff (PAS)-farging og Sirius-rødfargede bilder av 10-uke gamle FVB-Tns2WT (FVB-WT) (venstre panel) og FVB-Tns2nph mutant mus (FVB- nph) (høyre panel) nyreseksjoner. Øvre panel representerer PAS-fargede bilder, og nedre panel representerer Sirius Red-fargede bilder. Målestokk: 50 µm. (C) Graf som sammenligner de rørformede høydene til FVB-WT og FVB-nph. (D) Graf som sammenligner fibroseareal vs. totalt areal. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik; P-verdier ble beregnet ved Students t-test. (E) Spredningsplott med lineær regresjon viser korrelasjonsanalyse mellom høyden på tubuli-høyden og graden av fibrose-skåren. Den lineære regresjonslinjen viste en invers korrelasjon mellom tubulær høyde og fibroseområde. Korrelasjonskoeffisienter R- og P-verdier er vist. Svarte sirkler indikerer gruppen FVB-WT (n=5), og svarte firkanter indikerer gruppen FVB-nph (n=5). **P<0.01,><>
Nyretubulære skader og tubulære høyder ble målt ved bruk av akuttnyreskade(AKI)-modellen - det vil si IR-modellen [5, 12, 18]. Selv om interstitiell fibrose ikke bør observeres i de fleste AKI-tilfeller, inkludertnyreiskemisk lidelse, NGAL-ekspresjon økte i renale tubulære celler [7]. I tillegg er NGAL kjent for å være involvert i progresjonen av AKI til CKD og har blitt foreslått som en viktig faktor i begge. Derfor demonstrerte vi at NGAL-uttrykk korrelerte mednyrerørhøyde ved bruk av IR-modellen. Det er rapportert at iskemitiden ofte er satt til 20 til 60 minutter og at tubulær skade forverres med økende iskemitid [4, 5, 12, 18]. I denne studien ble mus utsatt for iskemi i 30 minutter som svak tubulær skade og 60 minutter som sterk tubulær skade. Økt NGAL-ekspresjon og tubulær flating ble observert i 30 og 60 min. Økningen i NGAL-ekspresjon og flating av tubuli var mer uttalt i 60 min-gruppen fordi den hadde fått mer skade (fig. 2A–C). En reduksjon i tubulær høyde og en økning i NGAL-ekspresjon ble demonstrert basert på en økning i den iskemiske tilstandsvarigheten (fig. 2A–C). Lineær regresjonsanalyse av resultatene indikerte også en negativ korrelasjon mellomnyrerørformet høyde og NGAL-uttrykk (R2=0.6266, P=0.011) (fig. 2D).
ADR nefropatimodellen brukes ofte inyresykdomforskning fordi det produserer glomerulære skader og mindre tubulære lidelser med et høyt nivå av reproduserbarhet ved bruk av en enkelt dose ADR [13]. ADR nefropati musemodellen ble brukt i denne studien for å evaluerenyrerørskader og høyder. Gnagermodellen for ADR-indusert nefropati brukes ofte til å forklare mekanismene til fokal glomerulosklerose (FSGS) og CKD. En enkelt dose ADR kan forårsake tap av podocytter, vedvarende proteinuri og FSGS. Blant forskjellige musestammer er BALB/c følsom for ADR, mens C57BL/6 (B6) er resistent. Derfor brukte vi BALB/c i dette ADR-eksperimentet. Ved ADR nefropati,nyreinterstitiell fibrose, som er et typisk funn av CKD, er
Fig. 2. (A) Representative bilder av periodic Acid-Schiff (PAS)-farging og immunkjemisk-fargede bilder med anti-nøytrofil gelatinase-assosiert lipocalin (NGAL) antistoff av sham (venstre panel), 30 min (midtpanel), og 60 min (høyre panel) nyreseksjoner. Det øvre panelet representerer det PAS-fargede bildet og det nedre panelet representerer det immunkjemisk fargede bildet med anti-NGAL-antistoff. Målestokk: 50 µm. (B) Graf som sammenligner de rørformede høydene til sham, 30 min og 60 min. (C) Graf som sammenligner det NGAL-positive området vs. totalt areal av sham, 30 min og 60 min. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik; P-verdier ble beregnet ved Bonferronis multigruppetest. (D) Spredningsplott med lineær regresjon viser korrelasjonsanalyse mellom høyden på tubulihøyden og NGAL-positivt område. Den lineære regresjonslinjen viser en invers korrelasjon mellom rørhøyde og NGAL-positive områder. Korrelasjonskoeffisienter R- og P-verdier er vist. Svarte sirkler indikerer falsk gruppe (n=3), svarte firkanter indikerer 30 min-gruppen (n=3), og svarte trekanter indikerer 60-min-gruppen (n=3). *P<0.05,><>
fremtredende ved 4 uker etter bivirkningsadministrasjon, mens en mellomtilstand mellom AKI og CKD er observert på mindre enn 4 uker [24]. I denne studien vurderte vi tubulær utflatning hos mus 2 uker etter ADR-behandling, en mellomliggende tilstand. Nivået pånyretubulær skade ble evaluert ved å måle uttrykket av NGAL, som øker i cellene til skadede nyretubuli [6]. Renale tubulære høyder ble målt, og immunkjemifarging ved bruk av et anti-NGAL-antistoff ble utført på nyrevevet til ADR- og bærergruppene. Det ble ikke påvist noe positivt bilde av Sirius-rødfarging (data ikke vist). Tubular flatting ble forsterket av ADR-administrasjon, og en tydelig økning i NGAL-ekspresjon ble demonstrert (fig. 3A-C). I tillegg viste lineær regresjonsanalyse av rørformede høyder og NGAL-uttrykksnivåer en motsatt korrelasjon (R2=0.522, P=0.043) (fig. 3D).
DISKUSJON
Sterke korrelasjoner mellom renal tubulær flatting og interstitiell fibrosing i alvorlig CKD-modeller og mellom tubulær flattening og tubulær lidelse i ADR- og IR-modeller, ble demonstrert i denne studien. Det er forskjellige mekanismer som glomerulære lesjoner sprer seg til interstitiell fibrose gjennom tubulære lidelser. En studie rapporterte detnyretubuliskade (utflatning) induserer interstitiell fibrosing, produksjon av ekstracellulær matrise (ECM) og inflammatorisk celleinfiltrasjon. Den sterke sammenhengen mellomnyretubulær flatting og nyretubulær interstitiell fibrillisering observert i denne studien tilsvarer sannsynligvis den tidligere rapporterte årsakssammenhengen; dvs,nyretubulære skader induserer fibrosing, ECM-produksjon og celleinfiltrasjon. En annen studie viste også en korrelasjon mellom forbedret NGAL-uttrykk og renal tubulær atrofi (en annen nyresykdomsskadepoengscore), med resultater som ligner på renal tubular flattening score oppnådd i denne studien [26]. I denne studien er det kun menn
Fig. 3. (A) Representative bilder av periodisk syre-Schiff (PAS)-farging og immunkjemisk-fargede bilder med anti-nøytrofil gelatinase-assosiert lipokalin (NGAL) antistoff av bærer (venstre panel) og adriamycin (ADR) (høyre panel) nyresnitt. Det øvre panelet representerer det PAS-fargede bildet og det nedre panelet representerer det immunkjemisk fargede bildet med anti-NGAL-antistoff. Målestokk: 50 µm. (B) Graf som sammenligner de rørformede høydene til kjøretøy og ADR. (C) Graf som sammenligner det NGAL-positive arealet vs. totalt areal. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik; P-verdier ble beregnet ved Bonferronis multigruppetest. (D) Spredningsplott med lineær regresjon viser korrelasjonsanalyse mellom høyden på tubuli og NGAL-positivt område. Den lineære regresjonslinjen viser en invers korrelasjon mellom rørhøyde og NGAL-positive områder. Korrelasjonskoeffisienter R- og P-verdier er vist. Svarte sirkler indikerer kjøretøygruppen (n=3), og svarte firkanter indikerer ADR-gruppen (n=5). *P<0.05,><>
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESMERTER
mus ble brukt, men utflating av tubuli ved nefropati kan observeres hos begge kjønn. Imidlertid har hunnmus blitt rapportert å være resistente mot IR og andre nefropatimodeller, så bruk av hann- eller hunnmus bør vurderes avhengig av nefropatimodellen som brukes [8]. Det var også vanskelig å vurdere tubulær utflatning i medulla, fordi tubuli i medulla ved ikke-skade har tynne tubulære celler, selv om høyden på tubuli i cortex ble vurdert. Derfor bør en enkel metode for å vurdere tubulær skade i medulla utvikles i fremtiden (data ikke vist). Eksperter som patologer eller klinikere utfører generelt en evaluering av nivået av atrofi, utvidelse eller mutasjon av nyretubuli for å score histologien til nyretubuli; Imidlertid kan måling av renale tubulære høyder for å score nivået av utflating utføres mye lettere sammenlignet med andre metoder. Dette er også fordelaktig fordi raskt fremmende teknologier som kunstig intelligens og bildebehandling lett kan brukes; derfor bør en mer presis, objektiv og kvantitativ diagnose være mulig i fremtiden. For å bekrefte om renal tubulær flating kan være et fenomen som er universelt observert som en CKD-malignitetsindeks på tvers av forskjellige arter, bør det utføres ytterligere undersøkelser med CKD-modeller av andre gnagere, selskapsdyr som hunder og katter, eller prøver samlet fra mennesker.