Forkondisjoneringsaktivert AKT kontrollerer nevronal toleranse for iskemi gjennom MDM2–p53-banenⅡ

3. Diskusjon

Resultatene våre viser at IPC-mediert aktivering av PI3K/AKT-signalveien utløser neuronal IT ved å kontrollere MDM2–p53-komplekset i primære kortikale nevroner. Vi bekreftet først effektiviteten av forkondisjoneringen når det gjelder nevrobeskyttelse [33,39–41] ved å bruke en validert IPC-eksperimentell modell.

Klikk for å cistanche tubulosa bivirkninger for Neuron

Vi fant at eksperimentell IPC indusert av en kort (20 minutter) oksygen- og glukosemangel (OGD) etterfulgt av 2 timers reoksygenering resulterte i nevrobeskyttelse, som vist ved forebygging av både neuronal apoptose og caspase-3-aktivering indusert av langvarig OGD (90 min) etterfulgt av 4 timers reoksygenering (OGD/R). Vi viser at IPC reduserer kaspase-3-aktivering i kortikale nevroner, som korrelerer med mindre apoptose etter en påfølgende og mer alvorlig iskemisk fornærmelse.

Balansen mellom pro- og antiapoptotiske signaler er grunnleggende for å sikre nevronal overlevelse etter iskemi [3,33,38,42–44]. Selv om relevansen av slike hendelser er vist i både hemoragiske og iskemiske in vivo-slagmodeller [43,45], er mekanismene som regulerer disse signalveiene ennå ikke fullt ut forstått i sammenheng med iskemisk toleranse. Rollen til antiapoptotisk AKT og dens relaterte veier har blitt grundig studert i kreftceller [46,47] og hjernevev [38,48]; Men så langt er rollen til AKT/MDM2-p53-signalveien i IPC-mediert nevronal toleranse mot iskemisk skade fortsatt unnvikende.

Her fant vi at aktiveringen av PI3K/AKT-signalveien forårsaket av IPC fremmer fosforylering av MDM2 ved Ser166, som utløser dens nukleære translokasjon og proteinstabilisering, og forhindrer p53-indusert apoptose via caspase-3-aktivering etter iskemi. Aktiveringen av AKT via fosforylering fremmer nevronal overlevelse [24,49] og kan bidra til induksjon av IT [25,50]. Resultatene våre viser at den relative overfloden av AKT-protein er uendret under iskemisk eller prekondisjonerende stimuli. Interessant nok fant vi at tidlig PI3K-mediert fosforylering av AKT ved Ser473 forhindrer iskemi-indusert p53-stabilisering i de forhåndsbetingede nevronene.

Effekten skyldtes ikke modifikasjoner i p53 mRNA-nivåer [33,34,44], men reduserte p53-proteinnivåer på grunn av IPC før OGD/R. Siden MDM2 er hovedregulatoren for p53-stabilisering og også er et direkte mål for AKT, påpeker resultatene våre rollen til AKT/MDM2–p53-signalveien i nevronal toleranse for iskemi. MDM2 mRNA øker raskt etter OGD [34], men MDM2 aktivitet er hovedsakelig kontrollert av post-translasjonelle modifikasjoner, spesielt fosforylering [51]. I god overensstemmelse med dette fant vi at en gang aktivert ved fosforylering etter IPC, fosforylerer AKT i sin tur MDM2 ved rest Ser166, som er lokalisert nær det nukleære lokaliseringssignalet [52], og denne effekten opprettholdes etter OGD/R-skade.

Resultatene våre viser at fosforylering av MDM2 ved Ser166 er tilstrekkelig til å utøve den IPC-medierte nevrobeskyttende effekten via p53-destabilisering. Dermed identifiserte vi her en tidsavhengig aktivering av AKT / MDM2–p53-vei etter iskemisk skade, og vi demonstrerer faktisk at IPC-aktivert AKT utløste kjernefysisk translokasjon av ektopisk MDM2, så vel som endogen proteinstabilisering.

Dessuten forblir AKT aktiv i kjernen, hvor PI3K også kan migrere som svar på oksidativt stress og deretter stå for AKT-fosforylering [53]. Hemming av PI3K-mediert fosforylering av AKT eller AKT knockdown fremmer retensjon av MDM2-protein i cytoplasmaet, og det forhindrer Ser166-fosforylering av MDM2, samt IPC-mediert nevrobeskyttelse mot iskemi-indusert neuronal apoptose. Tvert imot viste vi at aktiv AKT binder seg til nukleært MDM2-protein.

Som en konsekvens fremmer aktiv AKT både fosforyleringer av MDM2 og dens kjernefysiske stabilisering, som bidrar til IPC-mediert nevrobeskyttelse. Resultatene våre avslører at IPC-fremmede nevrobeskyttelse var avhengig av PI3K-mediert AKT-aktivering, som fosforylerte MDM2 ved Ser166, og fremmet MDM2-kjerneakkumulering etter en iskemisk fornærmelse.

Følgelig opphevet inhibering av PI3K/AKT av wortmannin eller AKT-utarming av siRNA IPC-fremmede nevrobeskyttelse, noe som førte til p53-stabilisering og den påfølgende neuronale apoptose etter iskemi. Derfor hjelper resultatene våre med å klargjøre den essensielle rollen til IPC-avhengig aktivering av AKT – MDM2-banen i nevronal overlevelse mot iskemisk skade.

P53-proteinet er involvert i kontrollen av nevronal død/overlevelse som bestemmer prognose hos slagpasienter [34,42,54], så vel som hos TIA-pasienter [3]. P53-stabilisering kompromitterer prekondisjoneringsmediert nevrobeskyttelse til iskemi/reperfusjonsskade [33]. MDM2-p53-interaksjonen vil derfor være kritisk for nevronal overlevelse i denne sammenhengen [34] og for IPC-mediert toleranse mot iskemisk skade [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G i MDM2-promotoren bestemmer uttrykket av MDM2 og modulerer i sin tur utvinningen av pasienter som lider av hjerneslag [34].

I tillegg observerte vi at et Tp53-gen SNP (rs1042522) modulerer mitokondriell p53-stabilisering og nevronal toleranse for iskemi mens det forutsier den funksjonelle utvinningen av pasienter som lider av en TIA før hjerneslag [3]. Derfor vil kontrollen av p53 apoptotiske veier være avgjørende for å sikre den nevrobeskyttende effekten av IPC.

Disse resultatene gir en translasjonstilnærming til studien som kan implementeres i fremtiden til fordel for pasienter, og de utgjør PI3K/AKT–MDM2–p53-signalveien som et essensielt mål for de prekondisjoneringsfremmende IT-strategiene ved iskemisk hjerneslag. Oppsummert viser vi at den IPC-forbedrede PI3K/AKT-signalveien fremmer fosforylering av MDM2 ved Ser166, noe som fører til MDM2 kjernefysisk translokasjon og dens stabilisering, som utløser nevronal IT ved å fremme p53-destabilisering og påfølgende inaktivering av apoptotisk død indusert etter iskemisk indusert.

Resultatene våre fremhever de potensielle fordelene med tidlig aktivering av AKT i IPC-mediert nevronal toleranse, som regulerer den apoptotiske MDM2-p53-banen under iskemisk skade. Disse funnene fremhever en mulighet til å forstå mekanismene som regulerer nevronale signalveien AKT – MDM2 – p53 for å utvikle nye nevrobeskyttende strategier for IT-relaterte lidelser.

4. Materialer og metoder

4.1. Primære kulturer av kortikale nevroner

Nevronale kulturer ble fremstilt fra C57Bl/6J eller p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory) museembryo (14.5E) cortices. Nevroner ble sådd ved 1,8 × 105 celler/cm2 i et nevrobasalt medium supplert med 2 prosent B27 og 2 mM glutamin (Invitrogen, Madrid, Spania) og inkubert ved 37 ◦C i en fuktet 5 prosent CO2-holdig atmosfære [ 55].

4.2. Oksygenglukosemangel og prekondisjoneringsmodeller

Etter 9–1{{10}} dager in vitro (DIV), ble nevroner eksponert for oksygen- og glukosemangel (OGD) ved å inkubere celler ved 37 ◦C i 90 minutter i en inkubator utstyrt med luftsluse og kontinuerlig gasset med 95 prosent N2/5 prosent CO2. Inkubasjonsmediet (bufret Hanks' løsning uten glukose: 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 132,4 mM NaCl, 4,09 mM NaHC03, 0,33 mM Na2HPO4, 2 mM CaCl2 og 20 mM N HEP4) var tidligere 9 % gass med 7 % HEPES. /5 prosent CO2 i 30 min. Under disse forholdene var oksygenkonsentrasjonen i inkubasjonsmediet 6,7 ± 0,5 µM målt med en oksygenelektrode av Clark-type [56,57].

Når det ble indikert, ble nevronene utsatt for iskemisk prekondisjonering (IPC; kort OGD i 20 minutter etterfulgt av 2 timers reoksygenering) før påfølgende forlenget iskemi (OGD, 90 min) og 4 timers reoksygenering (IPC pluss OGD/R) (Figur S1B) ). Parallelt ble nevroner inkubert i normoksi (Nx) ved 37 ◦C i en fuktet atmosfære med 95 prosent luft/5 prosent CO2 eller iskemisk prekondisjonering (IPC). Når indikert, ble nevroner inkubert 30 minutter før IPC i bufret Hanks-løsning (pH 7,4), i fravær eller nærvær av wortmannin (100 nmol/L), som beskrevet tidligere [19].

4.3. Celletransfeksjoner

Nevroner (8 DIV) eller HEK-293T-celler ble transfektert med en plasmidvektor som uttrykker YFP-merket Mdm2 fra MDM2 human promoter. MDM2p/Mdm2-YFP var en gave fra Uri Alon & Galit Lahav (Addgene plasmid # 53962, Watertown, MA, USA) [58]. Når det var nødvendig, ble en tom vektor (pYFP) brukt som en kontroll under de samme forholdene. Plasmidtransfeksjon ble utført ved bruk av Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble transfektert med 1,5 µg/µL av plasmidvektorene og brukt etter 24 timer.

AKT knockdown i 6 DIV-neuroner ble oppnådd ved transfeksjon med små interfererende dobbelttrådete ribonukleotider (siRNA). Målrettede sekvenser var som følger: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisense: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (mus, s62216, tilsvarende nukleotidene 1006–1025, GenBank tilgangsnummer NM{5{9}) Som negativ kontroll brukte vi Silencer™ Select Negative Control No. 1 siRNA (siControl). Alle siRNA-er ble kjøpt fra Ambion®, Invitrogen® og Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Tyskland). I henhold til graden av protein knockdown ble effektiviteten av transfeksjon av siRNA estimert til å være 70–80 prosent 3 dager etter transfeksjon. For å dempe eksperimenter ble nevroner transfektert med siRNA (10 nM) ved bruk av Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), etter produsentens instruksjoner. Nevroner ble videre inkubert i et nevrobasalt medium i 72 timer før bruk.

4.4. Flowcytometrisk deteksjon av apoptotisk celledød

Nevroner ble forsiktig løsnet fra platene ved bruk av 1 mM EDTA tetranatriumsalt i PBS (pH 7,4) og ble farget med annexin V/APC og 7-AAD, utført nøyaktig som tidligere beskrevet [55].

4.5. Caspase-3 aktivitetsanalyse

Caspase-3-aktivitet ble vurdert i cellelysater [33] og i henhold til produsentens instruksjoner ved bruk av Fluorimetric Assay-settet CASP3F fra SIGMA og lest ved emisjon ved en bølgelengde på 405 nm. Metoden er basert på frigjøring av den fluorescerende 7-amino4-metylkumarin (AMC)-delen. AMC-konsentrasjonen beregnes ved hjelp av en AMC-standard.

4.6. Immunoblots og co-immunutfellingsanalyse

Nevroner ble lysert i buffer som inneholdt 1 prosent SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12,5 mM Na2HPO4 og 1 prosent Triton X-100 (NP40: 1 prosent NP40, EDTA diK pluss 5 mM, Tris pH{{13 }} mM, NaCl 135 mM og 10 prosent glyserol) supplert med fosfatasehemmere (1 mM Na3VO4 og 50 mM NaF) og proteasehemmere (100 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 50 µg/ml anti-papain/50 µg/50 µg pepain, µg/ml amastatin, 50 µg/ml leupeptin, 50 µg/ml bestatin og 50 µg/ml soyabønnetrypsinhemmer), lagret på is i 30 minutter og kokt i 5 minutter. Alikvoter av lyserte ekstrakter ble utsatt for SDS polyakrylamidgel (MiniProtean®, Bio-Rad) og blottet med antistoffer over natten ved 4 ◦C. Antistoffer som ble brukt var anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-spaltet caspase-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; oppdager også YFP) (Abcam, Cambridge, Storbritannia), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland), og antiGAPDH (Ambion, Cambridge, Storbritannia) over natten ved 4 ◦C. Etter inkubering med pepperrotperoksidase-konjugert geit-anti-kanin-IgG (Pierce, Thermo Scientific) eller geit-anti-mus-IgG (Bio-Rad), ble membranene umiddelbart inkubert med forbedret kjemiluminescens SuperSignal West Dura (Pierce) i 5 minutter før eksponering for Kodak XAR-5-film i 1 til 5 minutter og autoradiogrammene ble skannet. Båndintensiteter ble kvantifisert ved bruk av ImageJ 1.48v programvare, som beskrevet tidligere [60].

For ko-immunutfellingsanalysen ble nevroner lysert i iskald buffer inneholdende 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 prosent NP-40) ​​supplert med fosfatasehemmere beskrevet ovenfor. Etter fjerning av rusk ved sentrifugering, ble nevronale lysater (100 mg) inkubert med 1 mg av antistoffet i 24 timer ved 4 ◦C etterfulgt av tilsetning av 10 mL protein A-agarose (GE Healthcare Life Sciences) i 2 timer ved 4 ◦C. Immunutfellinger ble grundig vasket med lyseringsbuffer og løst ved SDS-PAGE og immunoblottet med indikerte antistoffer [61]. De relative proteinmengdene er vist i figur S1. Full blotter og gelskanninger er inkludert i figur S3.

4.7. Immuncytokjemi og bildeanalyse

Nevroner ble dyrket på dekkglass og fiksert med 4 prosent (vekt/volum, i PBS) paraformaldehyd i 30 minutter og immunfarget med kanin anti-fosfoAKT (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, USA), mus anti-MDM2 (2A10, ab-16895), muse-anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [55], muse-anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, USA), og anti-GFP (1:1000; ab290; også validert for å oppdage YFP). Immunmerking ble påvist ved bruk av sekundære antistoffer anti-kanin IgG-Cy3 eller anti-muse IgG-Cy2 (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, Storbritannia).

Kjerner ble farget med 40,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Dekkglass ble vasket, montert i SlowFade lys antifade reagens (Invitrogen) på glassglass, og undersøkt med et mikroskop (Nikon Inverted microscope Eclipse Ti-E, (NY, USA) utstyrt med 40× objektiv, en forhåndssentrert fiberbelysning Nikon Intensilight C-HGFI, og et svart-hvitt ladningskoblet digitalkamera Hamamatsu ORCAER eller et skanningslaser-konfokalmikroskop ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokyo, Japan) med tre lasere 405, 491 og 561 nm, utstyrt med 40×, 63× og 100× PL Apo oljeneddykkingsobjektiv for høyoppløselig bildebehandling og enhetsdigitalkamera Evolve Photometrics.

Alle mikroskopinnstillinger ble satt til å samle fluorescerende bilder under metning og ble holdt konstant for alle bilder tatt i eksperimentet. Bildene ble analysert med ImageJ 1.48v-programvaren (National Institutes of Health). Prosentandelen av p(Ser473)AKT pluss og p53 pluss nevroner og kvantifiseringen av maksimal proteinfluorescensintensitet til p(Ser473)AKT og p53 er vist i figur S2A. I MDM2-GFP-transfekterte nevroner ble nukleocytoplasmatisk distribusjon av MDM2-GFP beregnet som forholdet mellom den nukleære gjennomsnittlige fluorescensen og den cytoplasmatiske gjennomsnittlige fluorescensen til endogen MDM2, målt i 24 nevroner (seks nevroner pr. tilstand i fire forskjellige nevronale kulturer) (Figur S2B) [62].

For å kvantifisere den maksimale nukleære fluorescensintensiteten til endogen MDM2-farging og pSer473AKT, ble 40 nevroner (10 nevroner per tilstand i fire forskjellige kulturer) målt (figur S2C), som beskrevet tidligere [44]. I de representative tverrsnittsintensitetsprofilene vist i figur 5B, ble prosentandelen av p(Ser473)AKT og MDM2 angitt under hver tilstand kvantifisert som nukleær gjennomsnittlig fluorescens. I alle tilfeller ble kjerner identifisert ved DAPI-farging. Den maksimale nukleære MDM2-fluorescensintensiteten i nevroner behandlet med wortmannin eller siAkt er vist i figur S2D.

4.8. Statistisk analyse

Eksperimentelle resultater ble evaluert ved enveis variansanalyse, etterfulgt av Bonferroni post hoc-testen, brukt til å sammenligne verdier mellom flere grupper. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Elevens t-test ble brukt for sammenligninger mellom to grupper av verdier. I alle tilfeller ble p < 0.05 ansett som signifikant (* p < 0,05 versus Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Hvordan beskytter Cistanche nevroner?

Det er noen bevis som tyder på at Cistanche kan beskytte nevroner ved å redusere apoptose (programmert celledød) og fremme nevronal overlevelse. Apoptose er en naturlig prosess som oppstår i kroppen for å fjerne skadede eller uønskede celler, men det kan være skadelig når det skjer overdrevent eller upassende. Cistanche har vist seg å hemme apoptose i laboratoriestudier, og denne effekten kan bidra til å beskytte nevroner mot skade.

I tillegg inneholder Cistanche flere bioaktive forbindelser som har vist seg å ha nevrobeskyttende effekter. For eksempel inneholder den echinacoside, som har vist seg å beskytte nevroner mot oksidativt stress og betennelse. Den inneholder også akteosid, som har blitt funnet å ha antiinflammatoriske og antioksidantegenskaper.

Referanser

1. Emberson, J.; Lees, KR; Lyden, P.; Blackwell, L.; Albers, G.; Bluhmki, E.; Brott, T.; Cohen, G.; Davis, S.; Donnan, G.; et al. Effekt av behandlingsforsinkelse, alder og alvorlighetsgrad av hjerneslag på effekten av intravenøs trombolyse med alteplase for akutt iskemisk slag: En metaanalyse av individuelle pasientdata fra randomiserte studier. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [CrossRef]

2. Wang, W.-W.; Chen, D.-Z.; Zhao, M.; Yang, X.-F.; Gong, D.-R. Tidligere forbigående iskemiske angrep kan ha en nevrobeskyttende effekt hos pasienter med iskemisk hjerneslag. Arch. Med. Sci. 2017, 5, 1057–1061. [CrossRef] [PubMed]

3. Ramos-Araque, ME; Rodriguez, C.; Vecino, R.; Garcia, EC; Alfonso, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, JF; Almeida, A.; et al. Den neuronale iskemiske toleransen er betinget av Tp53 Arg72Pro-polymorfismen. Overs. Slag Res. 2019, 10, 204–215. [CrossRef] [PubMed]

4. Iadecola, C.; Anrather, J. Stroke research at a crossroad: Asking the brain for directions. Nat. Neurosci. 2011, 14, 1363–1368. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhao, C.; Jiang, M.; Zhang, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Zhang, M.; Qi, J.; Su, A.; Lou, N.; Xian, X.; et al. Peroksisomproliferator-aktivert reseptor gamma deltar i ervervelsen av hjernens iskemisk toleranse indusert av iskemisk prekondisjonering via glial glutamattransportør 1 in vivo og in vitro. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [CrossRef]

6. Rodriguez, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Refocusing the Brain: New Approaches in Neuroprotection against Ischemic Injury. Neurochem. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzel-Poore, MP; Stevens, SL; Xiong, Z.; Lessov, NS; Harrington, AC; Mori, M.; Meller, R.; Rosenzweig, HL; Tobar, E.; Shaw, ET; et al. Effekt av iskemisk prekondisjonering på genomisk respons på cerebral iskemi: likhet med nevrobeskyttende strategier i dvalemodus og hypoksi-tolerante tilstander. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [CrossRef]

8. Gidday, JM Cerebral prekondisjonering og iskemisk toleranse. Nat. Rev. Neurosci. 2006, 7, 437–448. [CrossRef] [PubMed]

9. Stetler, RA; Lekkasje, R.; Gan, Y.; Li, P.; Zhang, F.; Hu, X.; Jing, Z.; Chen, J.; Zigmond, MJ; Gao, Y. Preconditioning gir nevrobeskyttelse i modeller for CNS-sykdom: Paradigmer og klinisk betydning. Prog. Neurobiol. 2014, 114, 58–83. [CrossRef] [PubMed]

10. Koch, S.; Della Morte, D.; Dave, KR; Sacco, RL; Perez-Pinzon, AM Biomarkører for iskemisk prekondisjonering: Finne svarene. Br. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [CrossRef]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Secondo, A.; Bagetta, G.; Amantea, D. Modulering av Cerebral Store-opererte Calcium Entry-Regulatory Factor (SARAF) og Perifer Orai1 Etter Focal Cerebral Ischemia og Preconditioning in Mus. Nevrovitenskap 2020, 441, 8–21. [CrossRef]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Novel Cellular Mechanisms for Neuroprotection in Ischemic Preconditioning: A View from Inside Organelles. Front. Neurol. 2015, 6, 115. [CrossRef]

13. Durukan, A.; Tatlisumak, T. Prekondisjonering-indusert iskemisk toleranse: Et vindu inn i endogen giring for cerebrobeskyttelse. Exp. Overs. Slag Med. 2010, 2, 2. [CrossRef]

14. Broughton, BR; Reutens, D.; Sobey, CG; Sims, K.; Politei, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Apoptotiske mekanismer etter cerebral iskemi. Slag 2009, 40, 788–794. [CrossRef]

15. Zhao, H.; Sapolsky, RM; Steinberg, GK Phosphoinositide-3-Kinase/Akt overlevelsessignalveier er implisert i nevronal overlevelse etter hjerneslag. Mol. Neurobiol. 2006, 34, 249–270. [CrossRef]

16. Uzdensky, AB Apoptoseregulering i penumbra etter iskemisk slag: Uttrykk av pro- og antiapoptotiske proteiner. Apoptose 2019, 24, 687–702. [CrossRef] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt er et molekylært mål for signaltransduksjonsterapi ved iskemisk fornærmelse i hjernen. J. Pharmacol. Sci. 2003, 92, 317–327. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. Rollen til Akt (proteinkinase B) og proteinkinase C i iskemi-reperfusjonsskade. Neurol. Res. 2016, 38, 301–308. [CrossRef] [PubMed]

19. Delgado-Esteban, M.; Martín-Zanca, D.; Andres-Martin, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP Hemming av PTEN av peroksynitritt aktiverer fosfoinositide-3-kinase/Akt nevrobeskyttende signalvei. J. Neurochem. 2007, 102, 194–205. [CrossRef]

20. Manning, BD; Toker, A. AKT/PKB Signalering: Navigering i nettverket. Cell 2017, 169, 381–405. [CrossRef] [PubMed]

21. Diez, H.; Garrido, JJ; Wandosell, F. Spesifikke roller til Akt iso-former i apoptose og aksonvekstregulering i nevroner. PLoS ONE 2012, 7, e32715. [CrossRef]

22. Santi, SA; Lee, H. Akt-isoformene er tilstede på distinkte subcellulære steder. Er. J. Physiol. Physiol. 2010, 298, C580–C591. [CrossRef]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharaj, S.; Velayutham, M.; Zweier, JL Tidlig iskemisk prekondisjonering krever Akt- og PKA-mediert aktivering av eNOS via serine1176-fosforylering. Cardiovasc. Res. 2012, 97, 33–43. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Comb, M.; Liu, C.-L.; Martone, ME; Siesjö, BK; Hu, B.-R. Overlevelses- og dødsfremmende hendelser etter forbigående cerebral iskemi: Fosforylering av Akt, frigjøring av cytokrom C og aktivering av kaspaselignende proteaser. Br. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126–1135. [CrossRef] [PubMed]

25. Li, S.; Hafeez, A.; Noorulla, F.; Geng, X.; Shao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Zhao, H.; Ding, Y.; Ji, X. Prekondisjonering i nevrobeskyttelse: Fra hypoksi til iskemi. Prog. Neurobiol. 2017, 157, 79–91. [CrossRef] [PubMed]

26. Mayo, LD; Donner, DB En fosfatidylinositol 3-kinase/Akt-vei fremmer translokasjon av Mdm2 fra cytoplasma til kjernen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 11598–11603. [CrossRef]

27. Ashcroft, M.; Ludwig, RL; Woods, DB; Copeland, TD; Weber, HO; Macrae, EJ; Vousden, KH Fosforylering av HDM2 av Akt. Oncogene 2002, 21, 1955–1962. [CrossRef]

28. Zhou, BP; Liao, J.; Xia, W. HER-2/neu induserer p53 ubiquitinering via Akt-mediert MDM2-fosforylering. Nat. Cell Biol. 2001, 3, 973–982. [CrossRef]

29. Grossman, SR; Perez, M.; Kung, AL; Joseph, M.; Mansur, C.; Xiao, Z.-X.; Kumar, S.; Howley, P.; Livingston, DM p300/MDM2-komplekser deltar i MDM2-mediert p53-degradering. Mol. Cell 1998, 2, 405–415. [CrossRef]

30. Toth, A.; Nickson, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Differensiell regulering av kardiomyocyttoverlevelse og hypertrofi av MDM2, en E3 Ubiquitin Ligase. J. Biol. Chem. 2006, 281, 3679–3689. [CrossRef]

31. Hausenloy, DJ; Tsang, A.; Mocanu, MM; Yellon, DM Iskemisk prekondisjonering beskytter ved å aktivere prosurvival kinaser ved reperfusjon. Er. J. Physiol. Circ. Physiol. 2005, 288, H971–H976. [CrossRef] [PubMed]

32. Mocanu, MM; Yellon, DM p53 nedregulering: En ny molekylær mekanisme involvert i iskemisk prekondisjonering. FEBS Lett. 2003, 555, 302–306. [CrossRef]

33. Vecino, R.; Burguete, MC; Jover-Menual, T.; Agulla, J.; Bobo-Jiménez, V.; Salom, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. MDM2-p53-banen er involvert i prekondisjoneringsindusert nevronal toleranse for iskemi. Sci. Rep. 2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G i MDM2-arrangøren bestemmer funksjonelt resultat etter hjerneslag. Hjerneslag 2018, 49, 2437–2444. [CrossRef]

35. Feng, J.; Park, J.; Cron, P.; Hess, D.; Hemmings, BA Identifikasjon av et PKB/Akt hydrofobisk motiv Ser-473-kinase som DNA-avhengig proteinkinase. J. Biol. Chem. 2004, 279, 41189–41196. [CrossRef]

36. Lai, TW; Zhang, S.; Wang, YT Eksitotoksisitet og hjerneslag: Identifisering av nye mål for nevrobeskyttelse. Prog. Neurobiol. 2014, 115, 157–188. [CrossRef] [PubMed]

37. Constantino, LC; bindemiddel, LB; Vandresen-Filho, S.; Viola, GG; Ludka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI Role of Phosphatidylinositol-3 Kinase Pathway in NMDA Preconditioning: Different Mechanisms for Seizure and Hippocampal Neuronal Degeneration Induced by Quinolinic Acid. Neurotox. Res. 2018, 34, 452–462. [CrossRef]

38. Xie, R.; Cheng, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapolsky, RM; Zhao, H. Akt Isoformer differensielt beskytter mot hjerneslag-indusert nevronal skade ved å regulere mTOR-aktiviteter. Br. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [CrossRef]

39. Soriano, FX; Papadia, S.; Hofmann, F.; Hardingham, NR; Bading, H.; Hardingham, GE Prekondisjoneringsdoser av NMDA fremmer nevrobeskyttelse ved å øke nevronal eksitabilitet. J. Neurosci. 2006, 26, 4509–4518. [CrossRef]

40. Grabb, MC; Choi, DW Iskemisk toleranse i murin kortikal cellekultur: kritisk rolle for NMDA-reseptorer. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [CrossRef]

41. Chen, M.; Lu, T.-J.; Chen, X.-J.; Zhou, Y.; Chen, Q.; Feng, X.-Y.; Xu, L.; Duan, W.-H.; Xiong, Z.-Q. Differensielle roller for NMDA-reseptorsubtyper i iskemisk nevronal celledød og iskemisk toleranse. Hjerneslag 2008, 39, 3042–3048. [CrossRef]

42. Gomez-Sanchez, JC; Esteban, MD; Rodriguez-Hernandez, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Reverte, S.; Bolaños, JP; GonzalezSarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. Den menneskelige Tp53 Arg72Pro polymorfismen forklarer forskjellige funksjonelle prognoser ved hjerneslag. J. Exp. Med. 2011, 208, 429–437. [CrossRef]

43. Xu, W.; Gao, L.; Li, T.; Zheng, J.; Shao, A.; Zhang, J. Mesencephalic Astrocyte-Derived Neurotrophic Factor (MANF) beskytter mot nevronal apoptose via aktivering av Akt/MDM2/p53 signalvei i en rottemodell av intracerebral blødning. Front. Mol. Neurosci. 2018, 11, 176. [CrossRef] [PubMed]

44. Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C.; Lapresa, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Nuclear WRAP53 fremmer nevronal overlevelse og funksjonell utvinning etter hjerneslag. Sci. Adv. 2020, 6, eabc5702. [CrossRef]

45. Burmistrova, O.; Olias-Arjona, A.; Lapresa, R.; Jimenez-Blasco, D.; Eremeeva, T.; Shishov, D.; Romanov, S.; Zakurdaeva, K.; Almeida, A.; Fedichev, PO; et al. Målretting mot PFKFB3 lindrer cerebral iskemi-reperfusjonsskade hos mus. Sci. Rep. 2019, 9, 1–13. [CrossRef]

46. ​​Tu, Y.; Kim, E.; Gao, Y.; Rankin, GO; Li, B.; Chen, YC Theaflavin-3, 30 -gallate induserer apoptose og G2-cellesyklusstans gjennom Akt/MDM2/p53-veien i cisplatin-resistente eggstokkreft A2780/CP70-celler. Int. J. Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [CrossRef] [PubMed]

47. Wan, W.; Hou, Y.; Wang, K.; Cheng, Y.; Pu, X.; Ye, X. LXR-623-indusert lang ikke-kodende RNA LINC01125 undertrykker spredningen av brystkreftceller via PTEN/AKT/p53-signalveien. Celledød Dis. 2019, 10, 248. [CrossRef] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duan, Y.; Zhang, N.; Wang, C.; Zhang, F. Puerarin demper lokomotoriske og kognitive mangler samt hippocampus nevronal skade gjennom PI3K/Akt1/GSK-3-signalveien i en in vivo-modell av cerebral iskemi. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [CrossRef] [PubMed]

49. Janelidze, S.; Hu, B.-R.; Siesjö, P.; Siesjö, BK Endringer av Akt1 (PKB) og p70S6K i forbigående fokal iskemi. Neurobiol. Dis. 2001, 8, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Esposito, E.; Sirabella, R.; Cuomo, O.; Vinciguerra, A.; Di Renzo, G.; Annunziato, L. NCX1, og NCX3: To nye effektorer av forsinket prekondisjonering i hjerneiskemi. Neurobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [CrossRef]

51. Li, J.; Kurokawa, M. Regulering av MDM2-stabilitet etter DNA-skade. J. Cell. Physiol. 2015, 230, 2318–2327. [CrossRef]

52. Olson, DC; Marechal, V.; Momand, J.; Chen, J.; Romocki, C.; Levine, AJ Identifikasjon og karakterisering av flere mdm-2-proteiner og mdm-2-p53-proteinkomplekser. Oncogene 1993, 8, 2353–2360. [PubMed]

53. Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA Forbedret fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt-signalering har pleiotropiske mål i hippocampale nevroner utsatt for jernindusert oksidativt stress. J. Biol. Chem. 2013, 288, 19773–19784. [CrossRef] [PubMed]

54. Almeida, A.; Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C. Mitokondriell-nukleær p53-handel kontrollerer nevronal mottakelighet ved hjerneslag. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [CrossRef] [PubMed]

55. Delgado-Esteban, M.; Garcia-Higuera, I.; Maestre, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC/C-Cdh1 koordinerer nevrogenese og kortikal størrelse under utvikling. Nat. Commun. 2013, 4, 2879. [CrossRef] [PubMed]

56. Constantino, LC Rollen til NMDA-reseptorer i utviklingen av hjerneresistens gjennom pre- og postkondisjonering. Aldring Dis. 2014, 5, 430–441. [CrossRef]

57. Almeida, A.; Esteban, MD; Bolaños, JP; Medina, JM Oksygen- og glukosemangel induserer mitokondriell dysfunksjon og oksidativt stress i nevroner, men ikke i astrocytter i primærkultur. J. Neurochem. 2002, 81, 207–217. [CrossRef]

58. Lahav, G.; Rosenfeld, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorsky, N.; Levine, AJ; Elowitz, MB; Alon, U. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop i individuelle celler. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [CrossRef]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huang, DC; Siegel, PM; Camirand, A.; Yang, XF; Muller, WJ; Kremer, R. PTHrP driver brysttumorinitiering, progresjon og metastasering hos mus og er et potensielt terapeutisk mål. J. Clin. Undersøk. 2011, 121, 4655–4669. [CrossRef]

60. Maestre, C.; Esteban, MD; Gomez-Sanchez, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 fosforylerer Cdh1 og modulerer cyclin B1 stabilitet i eksitotoksisitet. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [CrossRef]

61. De Tudela, MV-P.; Esteban, MD; Maestre, C.; Bobo-Jiménez, V.; Jiménez-Blasco, D.; Vecino, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. Regulering av Bcl-xL-ATP-syntaseinteraksjon av mitokondriell syklin B1-syklinavhengig kinase-1 bestemmer nevronal overlevelse. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [CrossRef] [PubMed]

62. Bobo-Jiménez, V.; Esteban, MD; Angibaud, J.; Sánchez-Morán, I.; de la Fuente, A.; Yajeya, J.; Nägerl, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-Rock2-bane kontrollerer dendritisk integritet og minne. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2017, 114, 4513–4518. [CrossRef] [PubMed]