Forutsi rollen til LncRNA i nyrealdring basert på RNA-sekvensering Ⅱ

Korrelasjon av lncRNA Gm43360 og dets potensielle mål-mRNA

LncRNA Gm43360 ble valgt for studie fordi det koblet sammen to lncRNA-mRNA samekspresjonsnettverk. Ekspresjonsnivået til Adra1a var positivt korrelert (rho=0.8650, p=0.026) med det for Gm43360, Csnk1a1 (kaseinkinase 1A1) var negativt korrelert (rho{{12 }}.8084, p=0.0084) (fig. 5a). For ytterligere å verifisere korrelasjonen av lncRNA Gm43360 og dets potensielle mål-mRNA-er Adra1a og Csnk1a1, ble et overekspresjonsplasmid av lncRNA Gm43360 designet i denne studien. Ekspresjonen av Csnk1a1 reduserte som forventet, og Adra1a-uttrykket reduserte også, men ikke signifikant. Deretter slo vi ned lncRNA Gm43360 av siRNA for å oppdage om uttrykket av dets mål-mRNA ble påvirket. Som forventet ble Csnk1a1 økt i lncRNA Gm43360 knockdown-celler i forhold til den negative siRNA-kontrollgruppen (fig. 5b). Ti, vi oppdaget rollen til lncRNA Gm43360 i cellesyklusen. Celletellesettet-8 (CCK-8)-resultater viste at lncRNA Gm43360 fremmet cellelevedyktighet (fig. 5c). Resultatene viste at lncRNA Gm43360 økte prosentandelen av S-faseceller og reduserte prosentandelen av G1-faseceller sammenlignet med den negative kontrollen (fig. 5d). Te p53- og p21-proteiner var involvert i reguleringen av cellesyklusen og var derfor tegn på cellealdring. Ekspresjonsnivåene til p53 og p21 ble signifikant redusert i overekspresjonsgruppen i forhold til kontrollgruppen. Ekspresjonsnivåene til p53 og p21 ble betydelig økt i siRNA-gruppen i forhold til siRNA-kontrollgruppen (fig. 5e). Overekspresjon av lncRNA Gm43360 reduserte antallet SA- -gal-positive celler, og -gal-positive celler økte i gruppen av transfekterte Gm43360 (fig. 5f). Til sammen indikerte disse resultatene at lncRNA Gm43360 inhiberte senescensen til renale tubulære epitelceller ved åhemmer uttrykket av Csnk1a1.

KLIKK HER FOR Å FÅ NATURLIG ORGANISK CISTANCHE EKSTRAKT MED 25 % ECHINACOSIDE OG 9 % ACTEOSIDE FOR NYREFUNKSJON

Diskusjon

I denne studien evaluerte vi mRNA-ekspresjonsdata fra unge og gamle musenyrer og utførte bioinformasjonsanalyser som avslørte funksjonene til de avvikende uttrykte mRNAene. Vi observerte 347 oppregulerte mRNA-er og 355 nedregulerte mRNA-er samt 130 oppregulerte lncRNA-er og 91 nedregulerte lncRNA-er igamle musenyrer sammenlignet med unge musenyrer. I tillegg ble disse mRNA-ene vist å være involvert i aldringsrelaterte veier, som f.eksoksidativ fosforylering, AMPK-signalveien, Wnt-signalveien, Rap1-signalveien og aldersrelatert sykdom, som demonstrerte funksjonene til differensielt uttrykte mRNA-er i patogenesen av nyrealdring.

Det lange ikke-kodende RNA NEAT1 er en beskyttende faktor i progresjonen av nyrefibrose i renale tubulære epitelceller [21]. Tilfeldigvis, i våre sekvenseringsresultater, ble lncRNA NEAT1 uttrykt ved lavere nivåer i nyrene til gamle mus enn hos unge mus, noe som stemmer overens med tidligere funn. LincRNA-Gm4419 akselererer betennelse og fibrose ved hjelp av NF-kB/NLRP3 inflammasom-medierte mekanismer ved diabetisk nefropati [22]. I våre sekvenseringsresultater fant vi også at uttrykket av Gm4419 var høyere i nyrene til gamle mus enn hos unge mus, men det var ingen signifikant forskjell. LncRNA Gm43360 er lokalisert på kromosom 5 (Chr5:122494022–122,494,908, 2887 bp). I følge UCSC Genome Browser er Gm43360 lokalisert i intronet til det proteinkodende genet Atp2a2. Det har imidlertid ikke vært rapporter om involvering av lncRNA Gm43360 i sykdommer til dags dato. I denne studien fremmet knockdown av lncRNA Gm43360 renal tubulær epitelcelle senescens. I tillegg identifiserte vi mange differensielt uttrykte lncRNA-er i sekvenseringsresultatene og undersøkte dem.

LncRNA-er ble klassifisert i cis-regulering eller trans-regulering basert på lncRNA-reguleringsmekanismer. Cis-virkende lncRNA-er kan påvirke uttrykket av nabogener ved å være avhengig av cis-virkende elementer, slik som promotorer, forsterkere og regulatoriske sekvenser, som er avstander mellom lncRNA og mRNA på mindre enn 100 kb. Transvirkende lncRNA refererer til lncRNA som forlater transfeksjonsstedet og opererer på fjerne steder (dvs. avstanden mellom lncRNA og mRNA er mer enn 100 kb) [23]. LncRNA MAAT øker ekspresjonen av nabogenet Mbnl1 gjennom en cis-regulatorisk modul [24]. LncRNA Pnky spiller en rolle som en transvirkende regulator i kortikal utvikling [25]. I denne studien var det et transregulatorisk forhold mellom lncRNA Gm43360 og Csnk1a1. Csnk1a1 er et tumorsuppressorgen [26] som koder for et protein som deltar i cellesyklusen og celledelingsprosessen [27]. Csnk1a1 nedregulering induserersenescens-assosiert inflammatoriskrespons med vekststans i kolorektale svulster [26]. Csnk1a1 ble nedregulert da Gm43360 ble oppregulert; dermed er det sannsynlig at lncRNA Gm43360 deltar ialdring av nyreneavregulerer Csnk1a1-uttrykk.

Konklusjoner

Vår undersøkelse av lncRNA-mRNA-koekspresjonsnettverket ialdring av nyreneavslørte et lncRNA, lncRNA Gm43360, kan spille en beskyttende rolle i aldring av nyrene og utvidet vår forståelse av mekanismene involvert ialdring av nyrene

Materialer og metoder

Prøver Unge (3-måned gamle) og gamle (24-måned gamle) C57BL/6J hannmus ble kjøpt fra Experimental Animal Center ved Xiamen University og ble oppdrettet i et standardmiljø. Alle mus hadde fri tilgang til mat og vann. Musene ble akklimatisert til det nye anlegget i en måned før de ble ofret. Musene ble bedøvet med uretan ved intraperitoneal injeksjon i en dose på 750 mg/kg før prøvetaking. Unge og gamle mus ble ofret samme dag.Resterende musenyrevev ble brukt for sekvensering i hver analyse. RNA-seq og histopatologi ble utført påseparate nyrerfra samme mus. Nyrevev ble samlet fra mus. En nyre ble umiddelbart nedsenket i 10 % nøytralt bufret formalin for påfølgende seksjonsinnstøping, og den andre nyren ble delt inn i flere vev og umiddelbart plassert i flytende nitrogen og deretter lagret ved -80 grad. Studien ble støttet av den etiske komiteen ved det første tilknyttede sykehuset ved Xi'an Jiaotong University (Shaanxi, Kina) (nr. 2018-G-164). Alle metoder ble utført av dyreetiske retningslinjer og forskrifter. Denne studien ble utført i samsvar med retningslinjene for ARRIVE.

Nyre histopatologi

Nyrevevsprøver av unge og gamle mus ble fiksert i 10% paraformaldehydløsning over natten. Ti av seksjonene ble dehydrert, parafininnstøpt og seksjonert med 4-µm tykkelse. PAS og Massons trikromatiske farging ble utført ved bruk av standardprotokoller. Bilder ble tatt av kameraet, og det fargingspositive området ble målt. Arealet for histopatologikamerabildene ble beregnet med Image-Pro Plus 6.0.

SA‑ ‑gal farging

SA{{0}}gal-aktiviteten ble analysert ved å bruke et SA- -gal-fargesett (Cell Signaling Technology #9860) i henhold til produsentens protokoll. Arealet med positiv farging ble målt, og SA- -gal-positive celler ble beregnet ved bruk av Image-Pro Plus 6.0.

Konstruksjon og sekvensering av RNA-ekstraksjonsbibliotek

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 ble brukt til å konstruere et sekvenseringsbibliotek. Etter ekstraksjon av totalt RNA ble mRNA renset fra totalt RNA (5 ug) ved bruk av Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, USA) med to rensingsrunder. Etter rensing ble mRNA delt i korte fragmenter ved bruk av toverdige kationer ved høye temperaturer (Magnesium RNA Fragmentation Module (NEB, kat. e6150, USA) under 94 grader 5-7 min). Deretter ble de spaltede RNA-fragmentene revers-transkribert for å oppnå cDNA ved SuperScript™ II Revers Transcriptase (Invitrogen, kat. 1 896 649, USA), som deretter ble brukt til å syntetisere U-merkede andretrådede DNA-er med E. coli DNA-polymerase I ( NEB, kat.m0209, USA), RNase H (NEB, kat.m0297, USA) og dUTP-løsning (Termo Fisher, kat.R0133, USA). En A-base ble deretter tilsatt til de butte endene av hver tråd, og forberedte dem for ligering til de indekserte adapterne. Hver adapter inneholdt et T-baseoverheng for å ligere adapteren til det A-halede fragmenterte DNA. Dual-index adaptere ble ligert til fragmentene, og størrelsesvalg ble utført med AMPureXP-kuler. Etter det varmelabile UDG-enzymet (NEB, kat.m0280, USA) behandling av de U-merkede andretrådede DNA-ene, ble de ligerte produktene amplifisert med PCR ved følgende betingelser: initial denaturering ved 95 grader i 3 minutter; 8 sykluser med denaturering ved 98 grader i 15 s, annealing ved 60 grader i 15 s, og forlengelse ved 72 grader i 30 s; og deretter siste utvidelse ved 72 grader i 5 min. Den gjennomsnittlige innskuddslengden for de endelige cDNA-bibliotekene var 300±50 bp. Til slutt utførte vi 2×150 bp paret-ende-sekvensering (PE150) på en Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, Kina) i henhold til produsentens protokoll [28].

Bioinformatikkanalyse Sekvens og filtrering av Clean Reads

Et cDNA-bibliotek konstruert av teknologi fra det sammenslåtte RNA franyreprøverav mus ble sekvensert og kjørt med Illumina NovaseqTM 6000-sekvensplattformen. Ved å bruke Illumina-paret RNA-seq-tilnærmingen, sekvenserte vi transkriptomet, og genererte totalt millioner 2 × 150 bp parede avlesninger. Avlesninger hentet fra sekvenseringsmaskinene inkluderer råavlesninger som inneholder adaptere eller baser av lav kvalitet som vil påvirke følgende montering og analyse. For å få rene avlesninger av høy kvalitet, ble lesingene filtrert ytterligere av Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9). Parametrene var som følger:

1) fjerning av lesninger som inneholder adaptere;

2) fjerning av lesninger som inneholder polyA og poly;

3) fjerning av lesninger som inneholder mer enn 5 % av ukjente nukleotider (N);

4) fjerning av lesninger av lav kvalitet som inneholder mer enn 20 % av lavkvalitets (Q-verdi mindre enn eller lik 20) ​​baser.

Ti sekvenskvalitet ble verifisert med FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9). inkludert Q20-, Q30- og GC-innholdet i de rene dataene. Deretter ble det produsert totalt G bp med rensede, parede avlesninger. De rå sekvensdataene er sendt til NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) datasett med tilgangsnummer GSE154223.

Referansegenomet/annotasjonen var Mus_musculus.GRCm38. Kilden og versjonen av genkommentaren som ble brukt for analyser var Ensembl_v88.

Avskrifter montering

For det første ble Cutadapt [29] brukt til å fjerne avlesningene som inneholdt adapterforurensning, lavkvalitetsbaser og ubestemte baser. Ti sekvenskvalitet ble svært matet med FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Vi brukte Bowtie2 [31] og Hisat2 [32] for å kartlegge lesninger til genomet til mus. De kartlagte avlesningene av hver prøve ble satt sammen ved hjelp av StringTie [33]. Ti, alle utskrifter franyreprøverble slått sammen for å rekonstruere et omfattende transkriptom ved bruk av Perl-skript. Etter at det endelige transkriptomet ble generert, ble StringTie [33] og edgeR [34] brukt til å estimere ekspresjonsnivåene til alle transkripsjoner.

LncRNA-identifikasjon

Først av alt ble transkripsjoner som overlappet med kjente mRNA og transkripsjoner kortere enn 200 bp forkastet. Deretter brukte vi CPC [35] og CNCI [36] for å forutsi transkripsjoner med kodepotensial. Alle transkripsjoner med CPC-poengsum<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Differensielt uttrykte analysegener (DGEs) analyse

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 ble ansett som differensielt uttrykte gener.

Målgenprediksjon og funksjonell analyse av lncRNA

For å utforske funksjonen til funksjonen til lncRNA-er, forutså vi cis-målgenene til lncRNA-er. LncRNA-er kan spille en cis-rolle i å virke på nabomålgener. I denne studien ble kodende gener i 100,000 oppstrøms og nedstrøms valgt av Perl-skript. Deretter viste vi en funksjonell analyse av målgenene for lncRNA ved å bruke skriptene BLAST2GO [39]. Den fullstendige kommandokoblingen til det offentlige domenet var Jie-Li/README.md på main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Genontologi (GO) kategorier og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyse

Bioinformatikkanalysen for RNA-sekvensering ble utført ved hjelp av OmicStudio-verktøy (http://www.omicsudio. cn/tool). Gene Ontology (GO) funksjonell berikelsesanalyse og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [37–39] berikelsesanalyse ble brukt til å analysere de biologiske funksjonene til de forutsagte målgenene. GO-analyse avklarer de viktigste biologiske prosessene gjennom tre aspekter: cellesammensetning, molekylære funksjoner og biologiske prosesser (http://www.geneontology.org/). Analysen legger først alle differensielt uttrykte gener og bakgrunnsgener i GO-databasen. Hvert element kartlegges, antall gener i hvert element beregnes, og den hypergeometriske fordelingen brukes til å utføre hypotesetesting for å oppnå P-verdien til anrikningsresultatet. Jo lavere P-verdien er, desto mer signifikant blir anrikningsresultatet. KEGG er en databaseressurs som analyserer de differensielt uttrykte mRNAene ved genetisk biologi for å utforske viktige veier relatert til målgener (https://www.genome.jp/kegg/). Resultatene er uttrykt ved p-verdier; jo lavere p-verdi, desto mer signifikant blir anrikningsresultatet.

QRT–PCR

GAPDH ble brukt som den endogene kontrollen. Deretter ble de relative ekspresjonsnivåene til ukjente gener beregnet. Alle primere ble designet og syntetisert spesifikt for dette eksperimentet. Primere for GAPDH er kommersialisert. Spesifisiteten til Adra1a og Csnk1a1 primere ble identifisert av den enkle toppen av smeltekurven.

Bygg mRNA-lncRNA samekspresjonsnettverk

Transregulering var basert på forskning, og deretter ble transenergien beregnet. Jo mindre transenergien var, jo større er muligheten for binding. Deretter ble korrelasjonskoeffisienten til mRNA-lncRNA også beregnet. mRNA-lncRNA-nettverket ble konstruert ved å velge en Spearman-korrelasjonskoeffisient som oversteg 0.9. mRNA-lncRNA-koekspresjonsnettverket ble konstruert ved bruk av Cytoscape-programvare (v3.7.1).

Cellekultur

Muse-nyreproksimale tubulære epitelceller (MRPT-EpiCs) ble dyrket i epitelcellemedium-dyr (EpiCM-a, Kat. #4131) som inneholdt 2 % føtalt bovint serum (FBS, Kat. #0010) og Epitelcelleveksttilskudd-dyr (EpiCGS-a, Kat. #4182) uten antibiotika i en fuktet inkubator ved 37 grader og 5 % CO2. Kulturmediet ble skiftet hver 2.–3. dag. Cellene i den logaritmiske vekstfasen ble sub-dyrket når veksten nådde 90 %. Cellesuspensjonen fordøyd av trypsin ble sådd i 6-brønnplater med 2*104 -5*104 celler i hver brønn. Cellene som ble brukt til transfeksjon var alle mellom generasjon 2 og 5.

Plasmidkonstruksjon og celletransfeksjon

lncRNA Gm43360 overekspresjonsplasmidet ble konstruert av GeneChem (Shanghai, Kina). Plasmidryggraden var GV658, og CMV-promotoren drev lncRNA-ekspresjon. Den klonede nukleotidsekvensen er tilveiebrakt i tilleggsmaterialet. For lncRNA Gm43360 knockdown MÅ tre lncRNA ENS00000197656-målrette siRNA (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'CUCA-CCCUGUCA UGAAGUUTT-3'; og lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGTT-3') ble designet og syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina). I henhold til produsentens protokoll ble celler transfektert med 2500 ng plasmid eller 100 pmol siRNA med 6 µl Lipofectamine™ 2000 Transfeksjonsreagens (Invitrogen, USA) per brønn. RNA- og proteinekspresjonsnivåer ble påvist 48 timer etter transfeksjon, og hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Kvantitativ PCR i sanntid ble brukt for å validere effektiviteten til lncRNA Gm43360 overekspresjon og knockdown.

Western blot-analyse

Dyrkede celler ble vasket med iskald PBS, 120 ul RIPA-buffer (Heart, Kina) ble tilsatt, og proteaseinhibitor og PMSF (Heart, Kina) ble tilsatt i 30 minutter på is. Etter innsamling av celler i forskjellige mikrosentrifugerør ble proteinkonsentrasjonen kvantifisert. Lastebuffer ble tilsatt til hver prøve og deretter kokt i 7 minutter. Tretti mikrogram av prøven ble separert med 12% SDS-PAGE (Beyotime, Kina) og elektrooverført til PVDF-membraner (Thermo Fisher, USA). Deretter ble membranene blokkert med 5% melk. Membranene ble inkubert med spesifikke primære antistoffer: anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) og anti-GAPDH (1:3000, Profintech , 60004-1-Ig) over natten ved 4 grader . Etter vasking med TBST ble membraner inkubert med et sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Proteinbånd ble observert ved bruk av et kjemiluminescenssett (Millipore, USA). Uttrykket av GAPDH ble brukt for å normalisere proteinnivåer.

Celleproliferasjonsanalyse

Kapasiteten til celleproliferasjon ble bestemt av celletellesett-8 (CCK-8)-analysen. 48 timer etter transfeksjon ble 90 µl nytt medium og 10 µl CCK-8-løsning tilsatt til hver brønn (Beyotime, C0042). Cellene ble inkubert i 1–4 timer ved 37 grader i 5 % CO2 og målt ved 450 nm av en universell mikroplateleser (Bio-Tek, USA).

Flowcytometrisk analyse

Celler ble sådd ut i 6-brønnplater dagen før transfeksjon. Førtiåtte timer etter transfeksjon ble cellene trypsinbehandlet og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter. Deretter ble cellene fiksert i 70% etanol ved 4 grader i minst 4 timer. Etter sentrifugering ble RNase A og propidiumjodid (PI) fargeløsning tilsatt til cellene, og cellene ble deretter inkubert i 30 minutter ved romtemperatur i mørket. Te-fargede celler ble analysert ved å bruke en ACEA NovoCyte (Biosciences, USA).

Statistisk analyse

Måledataene ved normalfordelingen presenteres som gjennomsnitt ± SD. Forskjellen mellom de to ulike gruppene ble bestemt ved å bruke to-halede uparrede Students t-tester, og en p-verdi < 0.05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Alle beregninger ble utført ved bruk av GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., USA).

Referanser

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA. Cellulær alderdom i nyrene. J Am Soc Nephrol. 2019;30(5):726–36.

2. Partridge L, Deelen J, Slagboom PE. Å møte de globale utfordringene med aldring. Natur. 2018;561(7721):45–56.

3. Pan JX. LncRNA H19 fremmer aterosklerose ved å regulere MAPK og NF-kB signalveier. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(2):322–8.

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. Langt ikke-kodende RNA HOTAIR driver EZH2-avhengig myofibroblastaktivering i systemisk sklerose gjennom miRNA 34a-avhengig aktivering av NOTCH. Ann Revmatisk Dis. 2020;79(4):507–17.

5. Luo J, Wang K, Yeh S, Sun Y, Liang L, Xiao Y, Xu W, Niu Y, Cheng L, Maity SN, et al. LncRNA-p21 endrer den antiandrogen enzalutamid-induserte nevroendokrine differensieringen av prostatakreft ved å modulere EZH2/STAT3-signaleringen. Nat Commun. 2019;10(1):2571.

6. Wang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang W, Xu Q, Huang D, et al. Et nytt lncRNA MCM3AP-AS1 fremmer veksten av hepatocellulært karsinom ved å målrette mot miR-194-5p/FOXA1-aksen. Mol Kreft. 2019;18(1):28.

7. Wu YY, Kuo HC. Funksjonelle roller og nettverk av ikke-kodende RNA-er i patogenesen av nevrodegenerative sykdommer. J Biomed Sci. 2020;27(1):49.

8. Li Z, Wang Z. Aldrende nyre og aldringsrelatert sykdom. Adv Experiment Med Biol. 2018;1086:169–87.

9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Regel AD. Alder, nyrefunksjon og risikofaktorer er forskjellig assosiert med kortikale og medullære volum i nyrene. Nyre Int. 2014;85(3):677–85.

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR retter seg mot miR-126-5p for å fremme progresjonen av Parkinsons sykdom gjennom RAB3IP. Biol Chem. 2019;400(9):1217–28.

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportøren i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Handle for flere spesifikasjoner:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop