Promitotisk virkning av Oenothera Biennis på eldre menneskelige hudfibroblaster del 1

Abstrakt: Opphopning av senescent dermale fibroblaster driver hudens aldring. Reaktivering av spredning er en strategi for å modulere cellealdring. Nylig rapporterte vi den nøyaktige kjemiske sammensetningen av det hydrofile ekstraktet av Oenothera biennis cellekulturer (ObHEx), og vi viste dets antialdringsegenskaper. Dette arbeidet tar sikte på å vurdere dens biologiske effekt spesifikt på cellesenescens. ObHEx-virkningen har blitt evaluert på normale humane dermale fibroblaster utsatt for stressindusert prematur senescens (SIPS) gjennom en ultra-dyp proteomisk analyse, som har ført til det mest globale senescensassosierte proteomet så langt. Massespektrometridata viser at behandlingen med ObHEx reetablerer nivåer av avgjørende mitotiske proteiner, sterkt nedregulert i senescerende celler. For å validere proteomikkfunnene våre beviste vi at ObHEx delvis kan gjenopprette aktiviteten til 'senescensassosiert-ß-galaktosidase', det vanligste kjennetegnet for senescerende celler. Videre, for å vurdere om oppreguleringen av mitotiske proteinnivåer oversettes til en cellesyklus-gjeninntreden, har FACS-eksperimenter blitt utført, som viser en liten, men betydelig reaktivering av senescent celleproliferasjon av ObHEx. Avslutningsvis gir den dype senescensassosierte globale proteomprofileringen publisert her et panel med hundrevis av proteiner deregulert av SIPS som kan brukes av samfunnet for å forstå senescens og effekten av nye potensielle modulatorer ytterligere. Dessuten pekte proteomikkanalyse på en spesifikk promitotisk effekt av ObHEx på senescentceller. Derfor foreslår vi ObHEx som en kraftig adjuvans mot senescens assosiert med aldring av huden.

Glykosid av cistanche kan også øke aktiviteten til SOD i hjerte- og levervev, og redusere innholdet av lipofuscin og MDA i hvert vev betydelig, effektivt rense ulike reaktive oksygenradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) og beskytte mot DNA-skader forårsaket av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en sterk renseevne for frie radikaler, en høyere reduserende evne enn vitamin C, forbedrer aktiviteten til SOD i sædsuspensjon, reduserer innholdet av MDA og har en viss beskyttende effekt på sædmembranfunksjonen. Cistanche-polysakkarider kan øke aktiviteten til SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevev hos eksperimentelt senescent mus forårsaket av D-galaktose, samt redusere innholdet av MDA og kollagen i lunge og plasma, og øke innholdet av elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlenger hypoksitiden hos eldre mus, forbedrer aktiviteten til SOD i serum og forsinker den fysiologiske degenerasjonen av lunge hos eksperimentelt eldre mus. Med cellulær morfologisk degenerasjon har eksperimenter vist at Cistanche har den gode antioksidantevnen og har potensial til å være et medikament for å forebygge og behandle aldringssykdommer. Samtidig har echinacoside i Cistanche en betydelig evne til å rense DPPH-frie radikaler og kan rense reaktive oksygenarter, forhindre frie radikal-indusert kollagennedbrytning, og har også en god reparasjonseffekt på anionskader av tymin frie radikaler.

Klikk på Cistanche Tubulosa Supplement

【For mer informasjon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Nøkkelord: Oenothera biennis hydrofilt ekstrakt; senescence; fibroblaster; proteomikk; massespektrometri; diaPASEF; mitose; aldring av huden

1. Introduksjon

Alderdom er hovedårsaken til aldring og aldersrelaterte sykdommer. Senescerende celler gjennomgår proliferasjonsstans som en respons på fysiologisk telomererosjon (replikativ senescens) eller på stressutløsere inkludert DNA-skade, oksidativt stress, organellbelastning og onkogenaktivering (stressindusert for tidlig senescens, SIPS) [1]. Til tross for DNA Damage Response (DDR) indusert vekststans, viser senescerende celler en høy metabolsk tilstand og lysosomal aktivitet, avgjørende for deres økte sekretoriske aktivitet, kjent som senescensassosiert sekretorisk fenotype (SASP) [2,3]. SASP-faktorer inkluderer flere familier av løselige (interleukiner, kjemokiner, vekstfaktorer, utskilte proteaser) og uløselige (utskilte uløselige proteiner og ekstracellulære matrisekomponenter) proteiner som negativt påvirker det omkringliggende vevet, og genererer en kronisk lavgradig inflammatorisk tilstand.

Akkumulering av senescent fibroblaster i derma driver hudens aldring, svekker integriteten til den ekstracellulære matrisen (ECM) og funksjonen til nabomikrovaskulære endotelceller, epidermale melanocytter og keratinocytter [4–6]. De tre hovedstrategiene for å motvirke senescens inkluderer (i) fjerning av senescerende celler ved induksjon av apoptose eller immunaktivering; (ii) modulering av SASP og (iii) reaktivering av celleproliferasjon. Faktisk, selv om senescens opprinnelig ble beskrevet som en irreversibel cellesyklusstans, tyder nåværende bevis på at spredning kan gjenopprettes [7–9].

I dette scenariet er ingredienser som er i stand til å forhindre og/eller modulere cellulær senescens av stor interesse i det kosmetiske feltet som verdifulle våpen for å motvirke aldring av huden. Spesielt ekstrakter avledet fra arten Oenothera biennis (O. biennis, nattlyr), som tilhører familien Onagraceae, brukes tradisjonelt til kosmetiske bruksområder på grunn av deres antiinflammatoriske og antioksidantaktivitet [10]. Metanoliske ekstrakter fremstilt fra luftdeler og vandige bladekstrakter inneholder hovedsakelig fenolsyrer og flavonoider, mens metanoliske ekstrakter hentet fra røtter for det meste inneholder steroler og triterpener [11]. Selv om de biologiske aktivitetene til alkoholholdige og hydroalkoholiske luftdelekstrakter er demonstrert [12–14], er de mest brukte ekstraktene av O. biennis oljene hentet fra frø, som er ekstremt rike på fettsyrer. Faktisk, siden deres høye innhold av linolsyre (LA) og -linolensyre (GLA), forbedrer O. biennis frøoljer hudens funksjon, og spesielt har de vist gunstige effekter hos pasienter med kronisk dermatitt [11, 15].

Mer nylig har ekstrakter hentet fra O. biennis-cellekulturer blitt foreslått å erstatte ekstrakter fra spontane planter fullt ut siden de er bio-bærekraftige, forurensningsfrie og standardiserte sekundære metabolitterblandinger [16]. Det er nettopp kombinasjonen av forbindelsene med deres synergistiske effekt som er ansvarlig for den totale aktiviteten til botaniske ekstrakter [17].

Her har vi fokusert på det hydrofile ekstraktet av O. biennis cellekulturer (ObHEx), rike på lignaner og triterpener, da det viste hudantialdringsegenskaper når det ble testet i in vitro og ex vivo modeller [18]. Massespektrometri-basert kjemisk karakterisering av dette ekstraktet viste at det inneholder flere klasser av interessante sekundære metabolitter. De tilhører lignaner (salvadoraside og liriodendron) og triterpener (muriatinsyre, arjunolsyre, asparaginsyre og hederagenin), hvorav noen tidligere har vært assosiert med pro-kollagen I-produksjon i humane fibroblaster [19,20]. Spesielt har vi tidligere bevist at ObHEx fremmer matrisekollagensammentrekning, aktinpolymerisering og produksjon av ECM-proteiner, og dermed forbedrer hudens fasthet og elastisitet, via en økning i Myosin light chain kinase (MYLK) genuttrykk.

Til dags dato har de molekylære mekanismene til ObHEx-effekter på hudaldring og cellulær senescens, spesielt, ikke blitt undersøkt. Dette arbeidet tar sikte på å utforske ObHEx-aktivitet på senescent humane dermale fibroblaster. Vi brukte en datauavhengig massespektrometri ultra-dyp proteomisk tilnærming for å få hint om virkningsmekanismen og bio-ortogonale metoder for å validere og undersøke den (figur 1).

2. Resultater

Stress-indusert prematur senescens (SIPS) ble utført i normale humane dermale fibroblaster (NHDF) ved behandling med hydrogenperoksid (H2O2). Oksidativt stress-induserte senescentceller er en utmerket in vitro-modell for aldringsforskning og H2O2 er mye brukt for å oppnå det [21,22].

For å forstå de biologiske veiene endret av ObHEx på senescent NHDF-celler, brukte vi en ultra-dyp proteomisk tilnærming. SIPS og kontrollceller ble behandlet eller ikke i 48 timer med ekstraktet ved 0.01 prosent (p/v), siden dette, fra MTT-analysen rapportert i [18], resulterer i den høyeste konsentrasjonen som ikke forårsaker eventuell celletoksisitet etter 48 timers inkubasjon.

Cellelysater ble deretter utsatt for tryptisk fordøyelse og nano-UPLC MS/MS-analyse. For å få den optimale dybden av proteomet ble massespektrometridata innhentet i Data Independent Acquisition (DIA) modus, som tillot robust kvantifisering av 9650 proteiner (tabell S1), med datafullstendighet på 98 prosent. Vår studie rapporterer den mest komplette proteomanalysen av senescentceller til dags dato.

2.1. Stress-indusert prematur senescence (SIPS) evaluering

Først av alt, verifiserte vi om senescensinduksjonen i NHDF var vellykket, analyserte det globale proteomet til H2O2-behandlet NHDF ved massespektrometri (MS) og undersøkte morfologien ved hjelp av flowcytometri.

2.1.1. SIPS-evaluering med massespektrometri (MS)

For å evaluere SIPS-induksjon sammenlignet vi det totale proteomet til H2O2-behandlede NHDF-celler med ubehandlede celler. Blant de 3256 proteinene som ble deregulert, ble flere biomarkører for senescens funnet å være betydelig endret (Figur 2A, B). For det første observerte vi oppreguleringen av den mest brukte biomarkøren av senescerende celler, 'senescensassosiert-ß-galactosidase' (SA- -gal, GLB1). De økte nivåene av de lysosomale enzymene GLB1 og Tissue alpha-L-fucosidase (FUCA1), som også er funnet oppregulert av MS, gjenspeiler den karakteristiske økningen i lysosominnholdet i senescent celler [23,24]. Lysosomer favoriserer faktisk katabolske prosesser, som gir energi og råvarer som kreves av senescensassosiert sekresjon [25].

For det andre ble proteinnivået til serin/treonin-proteinkinase ATR og serin-proteinkinase ATM, begge involvert i DDR-signalering, også funnet å være økt [26]. DDR aktiveres av kjernefysisk DNA-skade, vanligvis assosiert med etablering av cellulær senescens, og den konvergerer til aktivering av tumorsuppressor p53. I tillegg til dette er oppreguleringen av histon 2A-variantene MACROH2A1 og MACRO2A2 også observert. Disse proteinene deltar i den ATR-avhengige dannelsen av Senescence Associated Heterochromatin Foci (SAHFs), tette og undertrykkende kromatinstrukturer som er karakteristiske for senescerende celler [1,2,27].

Til slutt reflekterer de deregulerte nivåene av Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1A eller p21 (CDK1NA) og proliferasjonsmarkørprotein Ki-67 (MKI67) senescent cellesyklusstans ved G2-fasen [28,29]. Faktisk øker p21 nivåene, fremmet av en DNA-skadeindusert p53-vei, og hemmer CDK2-cyklin E-komplekset. Dette forårsaker defosforylering av retinoblastomprotein (RB), som i sin hypofosforylerte tilstand sekvestrerer E2F, en transkripsjonsfaktor som favoriserer progresjonen av cellesyklusen [2].

Utover disse allerede kjente markørene for senescens, peker en bredere anrikningsanalyse av de mest oppregulerte proteinene i H2O2-behandlede versus kontrollceller til p53/p21-veiaktivering indusert av DNA-skade (figur 2C, tabell S2). I stedet nedreguleres proteiner assosiert med spredning og mitose, noe som peker på den påfølgende spredningsstansen (figur 2D, tabell S3).

2.1.2. SIPS-evaluering ved flytcytometri

SIPS er også bekreftet ved flowcytometrianalyse. Vi observerte en økning i cytoplasmatisk granularitet til H2O2--behandlede celler (figur S1A, B), på grunn av økningen i antall og størrelse på lysosomene i senescerende celler. Dette er resultatet av balansen mellom gradvis akkumulering av dysfunksjonelle lysosomer og produksjon av nye [25]. Dessuten oppdaget vi også en intra-lysosomal akkumulering av lipofuscinaggressomer: denne veksten, assosiert med en økning av autofluorescens i 525/50 nm båndpasskanalen til flowcytometeret, er en annen markør for alderdom relatert til en lysosomal funksjonsfeil (Figur S1C, D) [30].

2.2. ObHEx delvis restaurerte mitotiske proteiner nedregulert i eldre NHDF-celler

ObHEx-behandling var i stand til delvis å gjenopprette nivåene av 71 proteiner som var deregulert i senescent tilstand (Toveis ANOVA test q-verdi < 0.05). Mer presist ble 46 proteiner nedregulert av ekstraktet og 25 ble oppregulert (Figur 3A, Tabell S4 og S5).

Reaktomanrikningsanalyse av de 46 proteinene hvis nivåer ble redusert av ObHEx antyder at ekstraktet kan redusere p53-veiaktivering og påvirke fosfatidylinositol-metabolismen og Hedgehog-signalering, hvis endringer ble funnet i aldring [31,32] (Figur 3B, Tabell S6).

Når det gjelder de 25 oppregulerte proteinene, peker anrikningsanalysen på reaktivering av mitotisk cellesyklusvei og spesielt til DNA-avvikling og replikering, kromosomkondensasjon og oppløsningen av søsterkromatider (figur 3C, tabell S7).

En dybdeanalyse viser at 18 av de 25 restaurerte proteinene klynger seg sterkt sammen (Figur 4A). I denne klyngen er det mulig å skjelne CDK1, alle underenhetene til kondensin I-komplekset (SMC2, SMC4, NCAPD2, NCAPH og NCAPG), tre kinetochore-relaterte proteiner (KNTC1, NUF2 og TRIP13), alle de seks underenhetene av det replikative minkromosomvedlikeholdskomplekset (MCM) (MCM2-7) sammen med IQGAP3, PBK og DHFR.

Evnen til ObHEx til delvis å gjenopprette nivåene av disse proteinene er vist godt i profilplottene i figur 4B: proteinekspresjonsnivåer var stort sett uendret i de prolifererende cellene behandlet eller ikke med ekstraktet, falt i de senescent cellene og økte delvis etter ObHEx behandling.

2.3. Biologiske analyser bekreftet ObHEx promitotiske virkningsmekanisme

Det vanligste kjennetegnet ved senescentceller er den økte SA{0}}galaktiviteten som kan evalueres med en fargingsanalyse. Resultatene våre viser at H2O2-behandling induserte en signifikant økning i antall SA- -gal-positive celler (blå), fra 4,7 prosent til 22,9 prosent (Figur 5A, B). ObHEx-inkubasjon reduserte SA- -gal aktivitet signifikant med en reduksjon på 38,4 prosent (p < 0,01).

Dessuten, for å vurdere om gjenopprettingen av mitotisk proteinuttrykk av ObHEx oversettes til reaktivering av cellesyklusen, ble kontroll- og senescentcellene behandlet eller ikke med ekstraktet i 72 timer og fluorescensaktivert cellesortering (FACS) eksperimenter ble utført. De senescent celleresultatene viste en blokkering i G2/M-fasene av cellesyklusen (36,8 prosent), mens bare en mye lavere brøkdel av kontrollcellene (7,2 prosent) var i disse fasene siden de nådde sammenløp, ifølge litteraturen [ 33] (Figur 5C, D). Behandlingen av senescentceller med ObHEx var i stand til å redusere G2/M-populasjonen med 4,3 prosent (p < 0.05). Når det er relatert til senescenscelledelen etter SIPS (22,9 prosent), kan G2/M-utslippet estimeres til å være 18,9 prosent. Den samme ObHEx-behandlingen i 48 timer er utført, men resultatene var ikke statistisk signifikante.

【For mer informasjon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】