Proteomanalyse og in vitro antiviral, anticancer- og antioksidantkapasitet til de vandige ekstraktene av Lentinula Edodes og Pleurotus Ostreatus spiselig sopp

For mer informasjon, vennligst kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: I denne studien undersøkte vi vandige ekstrakter av de spiselige soppene Pleurotus ostreatus (østerssopp) og Lentinula edodes (shiitake-sopp). Proteomanalyse ble utført ved bruk av LC-Triple TOF-MS og viste ekspresjonen av 753 proteiner av Pleurotus ostreatus og 432 proteiner av Lentinula edodes. Bioaktive peptider: Rab GDP-dissosiasjonshemmer, superoksiddismutase, tioredoksinreduktase, serinproteinase og lektin, ble identifisert i begge soppene. Ekstraktene inkluderte også lovende bioaktive forbindelser inkludert fenoler,flavonoider, vitaminer og aminosyrer. Utdragene viste lovendeantivirale aktiviteter, med en selektivitetsindeks (SI) på 4,5 for Pleurotus ostreatus mot adenovirus(Ad7), og en svak aktivitet for Lentinula edodes mot herpes simplex-II(HSV-2). Ekstraktene var ikke cytotoksiske for normale humane perifere mononukleære blodceller (PBMC). Tvert imot viste de moderat cytotoksisitet mot ulike kreftcellelinjer. I tillegg ble antioksidantaktivitet vurdert ved bruk av DPPHradikal rensing, ABTS radikalkationfanging og ORAC-analyser. De to ekstraktene viste potensialantioksidantaktiviteter, med maksimal aktivitet sett for Pleurotus ostreatus (IC50 ug/mL)=39.46 ± 1.27 for DPPH; 11.22±1.81 for ABTS; og 21.40±2.20 for ORAC-analyser. Denne studien oppmuntrer til bruk av disse soppene i medisin i lys av deres lave cytotoksisitet på normale PBMCs i forhold til deres antivirale, antitumor- og antioksidantegenskaper.

Nøkkelord: hvitråte sopp; Pleurotus ostreatus; Lentinula edodes; shiitake; antioksidant; antitumor; antiviralt

1. Introduksjon

Sopp har store muligheter innen medisin og næringsproduksjon. I tillegg til å ha gode organoleptiske egenskaper og høye næringsverdier, ble mange sopp rapportert å ha en myriade av farmakologiske aktiviteter [1-3]. Blant de mest dyrkede soppene er Lentinula edodes (shiitake-sopp) og Pleurotus ostreatus (østerssopp). Shiitake kommer på andreplass etter Agaricus bisporus som den mest konsumerte matsoppen på verdensbasis [4]. Denne soppen har lovende antibakterielle, soppdrepende, antivirale, hepatobeskyttende, antihyperglykemiske og immunmodulerende effekter [5-7]. Den er rik på bioaktive molekyler, hvorav den mest studerte er "lentinan", et polysakkarid med effekt mot bakterier, virus og svulster, i tillegg til "lentinan", som viste hjelp til å kontrollere dyslipidemi og hyperglykemi [8]. Pleurotus ostreatus, den vanligste arten av slekten Pleurotus [9], også kjent som østerssopp, er en trenedbryter og har et bredt spekter av biologiske aktiviteter [10]. Sammenlignet med andre terapeutiske sopp, blir østerssopp mer populær som helsefremmere [11]. Tilstedeværelsen av et stort antall næringsrike komponenter som lektiner, polysakkarider, vitaminer og mineraler i østerssopp gjør dem i stand til å ha potensiell antikreft,antioksidant, antidiabetiske, antimikrobielle og anti-hyperkolesterolemiske egenskaper [12,13]. Sammenlignet med andre spiselige sopp har østers og shiitakesopp en kort vekstperiode og kan høstes gjennom hele året 14. Som et resultat av deres enkle dyrking og testing, høye næringsverdier og lovende medisinske fordeler, har disse soppene et enormt potensiale. i mat- og farmasøytisk industri [4,15]. Faktisk kan høyere Basidiomycetes være lovende multifunksjonelle matkilder.

Mange bioaktive forbindelser, inkludert sukker, fysiologisk aktive proteiner, umettede fettsyrer, fenoler (fenolsyrer og polyfenoler), flavonoider, terpenoider, glykoproteiner, polyketider, steroider og alkaloider, ble funnet i disse to soppene [16,17]. Disse forbindelsene virker utelukkende eller synergistisk for å frembringe de brede farmakologiske virkningene til disse soppene. Shiitake og østerssopp er rapportert å ha antibakteriell, antiviral, antihypertensiv, immunmodulerende og antioksidantaktivitet [1,18,19]. Seo et al. [20] oppsummerte mekanismene for den antivirale aktiviteten til soppbiomolekyler, og indikerte at reduksjonen i virusinfeksjon hovedsakelig skyldes å forstyrre opptak av viruset i vertsceller, dets replikasjon og dets protein- og enzymsyntese, i tillegg til å stimulere verts immunrespons [21]. Antioksidanter er viktige molekyler i møte med reaktive oksygenarter som ligger bak mange helseproblemer. Siden mange røde flagg ble heist mot bruken av syntetiske antioksidanter, har studiet av naturlige antioksidanter blitt obligatorisk [22]. Antitumoreffekten til disse soppproduktene var relatert til biomolekyler inkludert glukaner, ergosterol, proteoglykaner og aminosyrer (arginin og glutamin) [23]. Den postulerte mekanismen som ligger til grunn for denne effekten kan inkludere stimulering av T-lymfocytter, undertrykkelse av neovaskularisering og induksjon av kreftcelledød, i tillegg til å utløse immunresponsen mot kreftceller [24,25].

Proteomics har vist seg som et av de verdifulle verktøyene innen bioforskning, spesielt landbruksforskning [26]. Lindequist et al. [27] var den første gruppen som kastet lys over viktigheten av å bruke proteomikk i forskning på spiselig sopp. De understreket behovet for å bruke "omics" for studiet av soppbioaktive molekyler. Proteomikk har i liten grad blitt brukt i forskning på matsopp vis à vis patogene sopp [28]. Følgelig var målene med denne studien å analysere proteomet til de to spiselige soppene, Pleurotus ostreatus og Lentinula edodes, og å undersøke deres potensiale.antiviralt, antitumor- og antioksidantaktiviteter.

2. Resultater

2.1.Proteom1e-analyse

Proteomanalyse ble utført ved bruk av LC-Triple TOF-MS-analyse med en falsk oppdagelsesrate (FDR) på<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. Totalt bioaktive forbindelser Totalt innhold

I vurderingen av det totale innholdet inkluderte dette vurderingen av det totale antallet karbohydrater, proteiner, fenoler og flavonoider. P. ostreatus-ekstraktet inneholdt nesten tredoblet antall karbohydrater og dobbelt antall proteiner tilstede i L.edodes-ekstraktet; Ikke desto mindre ble det påvist flere flavonoider i L.edodes-ekstraktet enn P. ostreatus-ekstraktet (tabell 1).

2.3. Fenoliske og flavonoide molekyler

Begge soppekstraktene inneholdt katekin (påvist ved en retensjonstid på 26,48 minutter). P.ostreatus inkluderte i tillegg kaempferol og apigenin (påvist ved retensjonstider på henholdsvis 59,13 min og 59,56 min), mens L.edodes også inneholdt quercetin (retensjonstid=56.86 min; tabell 2; figur S1).

2.4.Vitaminer

Vannløselige så vel som fettløselige vitamininnhold ble bestemt via HPLC (tabell 3 og figurer S2 og S3). Begge soppene er rike på vitamin C, med påvisbare mengder vitamin B3, B6 og D. Det var ingen signifikant forskjell mellom begge soppene i mengden vitaminer de besitter. På den annen side var vitamin B1, B2, B9, A og E uoppdaget i begge soppene.

2.5. Aminosyreanalyse

En Sykam Amino Acid Analyzer ble brukt for aminosyreanalysen. Totalt aminosyreinnhold var 5,14 og 4,35 i henholdsvis P.ostreatus og L.edodes, som vist i tabell 4, og de to soppene er rike på glutaminsyre. Mens prolin ble påvist i en betydelig konsentrasjon (0,57 g/100 g protein) i P. ostreatus-ekstraktet, ble det ikke påvist i L.edodes-ekstraktet. Histidin og asparaginsyre ble påvist i ingen av de to soppene.

2.6. Biologiske aktiviteter

2.6.1.Antiviral aktivitet

Antiviral aktivitet ble evaluert mot to virus: adenovirus og herpes simplex-II. Som vist i tabell 5, viste P.ostreatus-ekstraktet en effektiv antiviral aktivitet mot adenovirus, med en selektivitetsindeks så høy som 4,5. Lovende antivirale effekter ble også registrert for P. ostreatus-ekstraktet mot herpes simplex-II og for L.edodes-ekstraktet mot begge virusene. Figurene S4 og S5 representerer dose-responskurvene.

2.6.2. Cytotoksisk aktivitet mot normale menneskelige PBMCer

Minimal cytotoksisitet (IC50 ug/mL; 66,41±3,7 og 82,81± 2,72, for henholdsvis P.ostreatus og L. edodes) ble registrert mot normale humane PBMCer.

Mot kreftcellelinjer

Varierte kreftcellelinjer ble brukt i denne testen, inkludert prostatakreft (DU-145 og PC3); hepatocellulært karsinom (HepG2); kolorektalt karsinom (Colo-205); cecum karsinom (LS-513); livmorhalskreft (HeLa); og brystadenokarsinom (MDA-MB-231 og MCF-7). Doxorubicin ble brukt som en positiv kontroll (forårsaket en reduksjon i levedyktighet til 53 prosent i HepG2; 44 prosent i MDA-MB-231; 39 prosent i PC3; 35 prosent i DU-145; 29 prosent i MCF -7:25 prosent i LS-513;23 prosent i HeLa; og 19 prosent i Colo-205-celler). Resultatene i figur 2 viser at Ledodes- og P. ostreatus-ekstraktet reduserte levedyktigheten til de testede kreftcellelinjene til LS-513, HepG2, DU-145 og PC-3 med omtrent 20 prosent .

Mot leukemi og lymfomcellelinjer

Soppekstrakter av P.ostreatus og L.edodes ble testet for cytotoksisitet mot leukemi (CCR-CEM, NB-4, THP-1) og lymfomceller (U937). Doxorubicin var den positive standarden, noe som forårsaket en reduksjon i cellelevedyktighet til henholdsvis 29 prosent, 25,5 prosent, 20,3 prosent og 19,1 prosent i U937-, NB4-, CCRF-CEM- og THIP1-celler. L.edodes-ekstraktet reduserte levedyktigheten til THP1-celler til 66,02 prosent, mens P.ostreatus-ekstraktet reduserte levedyktigheten til CCRF-CEM-celler til 70,64 prosent (figur 3).

2.6.3. Antioksidant aktivitet

Resultatene av antioksidanteffekten ble studert ved de tre vurderingsmetodene, nemlig DPPHradikal rensing, ABTS radikalkationfanging og ORAC-analyser, sammenlignet med antioksidantstandarden, Trolox, er vist i tabell 6 og figur S6a,b. Resultatene viser at P. ostreatus-ekstraktet hadde en kraftigere antioksidantkapasitet enn L.edodes-ekstraktet, som indikert av de tre antioksidantanalysene som ble brukt. Figur 4 viser fluoresceinsignalnedgangen indusert av ekstraktene i ORAC-analysen.

3. Diskusjon

Hvitråtesopp har vekket interessen til det vitenskapelige samfunnet på grunn av deres medisinske egenskaper, som inkluderer immunsystemmodulering, hypoglykemisk og antitrombotisk aktivitet, og antihypertensive, antiinflammatoriske, antimikrobielle og antitumoregenskaper, samt evnen til å senke kolesterolnivået i blodet [ 24,36-38]. De to hvitråtesoppene P. ostreatus og L.edodes er to av de mest konsumerte matsoppene i mange land [39]. En mengde bioaktive proteiner produseres av disse to soppene, og proteomanalyse er for tiden det mest effektive verktøyet for proteinprofilering [40]. I den nåværende studien viste proteomanalyse uttrykket av bioaktive proteiner inkludert Rab GDP-dissosiasjonshemmeren, tioredoksinreduktase, serinproteinase, superoksiddismutase og lektin i de to testsoppene. Rab GDP-dissosiasjonshemmeren (Rab GDI) regulerer funksjonen til Rab GTPaser som spiller en sentral rolle i membranhandel i tumorceller. Følgelig er bruk av Rab GDI en lovende antikreftstrategi [29].

Serinproteinase bidrar tilantiviraltaktivitet av spiselig sopp [30,31]. Dessuten har Yap et al. (2018) rapporterte sterk selektiv cytotoksisitet av serinproteinase i møte med en human brystadenokarsinomcellelinje (MCF7) og antydet at mekanismen involverer samarbeidseffekten av både ytre og indre celledødsmekanismer, i tillegg til stimulering av caspase{{ 4}} og-9 og hemming av Bcl-2 [41].

Inntaket avantioksidanterer en gunstig profylaktisk strategi mot reaktive oksygenarter (ROS)-mediert patofysiologi [22]. Resultatene våre viser uttrykket av enzymer fra antioksidantforsvarssystemet ved Pleurotus ostreatus og Lentinula edodes. Disse enzymene inkluderer superoksiddismutase, katalase og glutationperoksidase, som motvirker produksjonen av ROS [32]. Superoksiddismutase starter med å omdanne superoksid til hydrogenperoksid, som igjen omdannes av katalase og glutationperoksidase til vann [33].

Ekspresjonen av lektin ble også påvist i de to soppene. Mange forskere rapporterte om de bemerkelsesverdig mangfoldige biologiske profilene til lektin med et stort spekter av aktiviteter som omfatter antiinflammatoriske, antidepressive, antikonseptive og vasodilaterende aktiviteter [34,35,42]. Lektiner er karbohydratbindende proteiner med en rekke cellulære funksjoner inkludert in vitro og in vivo undertrykkelse av tumorvekst via selektiv binding til tumorcellemembraner eller deres reseptorer, noe som resulterer i aktivering av proteinkinaser, eller modulering av immunresponser gjennom interleukinproduksjon [43]. I tillegg har sopplektiner også en rolle i å utløse forskjellige celledødsveier, inkludert apoptose, nekrose og/eller autofagi [42].

Våre data viser uttrykket av både osteolyse og pleurotolysin i Pleurotus ostreatus. Dette er poredannende proteiner med svært selektive antikreftaktiviteter [44,45]. Ostreolysin er et 15 kDa cytolytisk protein med evne til å permeabilisere erytrocytter og andre celler ved sub-mikromolare konsentrasjoner. Den virker via en kolloid osmotisk mekanisme og induserer dannelsen av brede membranporer |46,47I. Nimri et al. produserte rekombinant pleurotolysin med potent antitumoraktivitet mot humane og muse kolontumorceller [48].

I L.edodes ble valosinholdig protein og låsepinne uttrykt. Valosinholdig protein ble tidligere rapportert å haantioksidantegenskaper som kan hjelpe ved nevronale syndromer som Alzheimers sykdom, lateral sklerose og demens [49-51]. Latcripin er et potensielt kreftmiddel [50]. Riaz Ud Din et al.(2020) undersøkte antikreftmekanismen til låsepinnen mot brystkreftcellelinjer. De rapporterte dens evne til å indusere celledød så vel som autofagi, i tillegg til dens hemmende effekt på migrasjon og invasjon [52].

En rekke bioaktive forbindelser ble kvantifisert i P.ostreatus- og L.edodes-ekstrakter. TPN-verdier på 19,37 ± 0.39 og 24.14 ± 1.01 mg/g ekstrakt for henholdsvis P.ostreatus og L.edodes ble påvist i den nåværende studien. Disse verdiene er høyere enn de registrert av Rahimah et al., som brukte ammonium- og Shinoda-testene for å kvantifisere det totale flavonoidinnholdet til P. ostreatus som 6,67 mg/g av ekstraktet [53]. I tillegg er resultatene våre høyere enn de funnet av Montibus et al., som analyserte TPC i L edodes-ekstrakter ved å bruke Folin-Ciocalteu-metoden og fant 0.8-1.5 prosent tørrvekt (DW) i caps og 0.8-1,1 prosent dw i stipes [54].

Katekin ble påvist i både P. ostreatus- og L.edodes-ekstrakter. Catechin er en plantesekundær fenolisk metabolitt, med kraftige frie radikalfjernende egenskaper [55]. L.edodes-ekstraktet ble funnet å inneholde flavonoidet quercetin. Antioksidanteffekten til quercetin medieres via regulering av glutationnivåer og en økning i produksjonen av antioksidantenzymer inkludert glutationtransferase og Aldo-keto reduktase [56]. I tillegg er quercetin rapportert å ha antitumoraktivitet gjennom å avbryte cellesyklusen og fremme apoptose [57,58]. Lee et al. rapporterte at quercetin forårsaker cellestans i PC3-, Du145- og U937-kreftcellelinjene [59]. Resultatene våre viser også at kaempferol og apigenin ble funnet i P.ostreatus. Kaempferol og apigenin har vist seg å ha antioksidant- og antiproliferativ aktivitet [60-62]. Glutaminsyre ble funnet å være den mest tallrike aminosyren i begge soppekstraktene. På samme måte analyserte Chirinang et al. aminosyreinnholdet i P. ostreatus og P. major-caju og fant at glutaminsyreinnholdet var høyest, etterfulgt av asparaginsyre og deretter arginin [63].

P.ostreatus og L. edodes viste lovende antivirale aktiviteter mot adenovirus og herpes simplex virus-II, med SI som nådde 4,5 for P. ostreatus-ekstraktet mot adenovirus. SI ble brukt til å evaluere effektiviteten og sikkerheten til ekstraktene, da den estimerer vinduet mellom de cytotoksiske og antivirale aktivitetene. Jo høyere SI, desto sikrere og mer effektiv er forbindelsen [64,65]. Relaterte data ble nylig vist av Urbancikova et al., der pleuran (uløselig -1,3/1,6-D-glukan isolert fra P. ostreatus)-baserte kosttilskudd betydelig forkortet varigheten av herpes simplex-viruset. -I-symptomer, med lavere alvorlighetsgrad av luftveissymptomer, hos herpes simplex virus-I-positive pasienter enn placebogruppen, uten signifikante bivirkninger, noe som foreslår pleura for mulig fremtidig bruk i behandling av akutt herpes simplex-virus-I [66].

Den antivirale effekten av sopp skyldes hovedsakelig forstyrrelse av viralt opptak, replikasjon, enzymaktivitet og fungerende peptider, samt potensering av vertens immunsystem [67]. Seo og Choi (2021) foreslo at -glukanet i polysakkaridfraksjonen av P.ostreatus og L.edodes kan være ansvarlig for dens antiherpetiske effekt gjennom pre- og post-behandlingseffekter [20]. Anti-HIV-effekten av de vandige ekstraktene av P. ostreatus og L.edodes kan være forårsaket av hemming av revers transkriptase-enzymet av henholdsvis ubiquitin-lignende protein og leptin [68,69].

De vandige ekstraktene av soppen vår ble vist å hemme levedyktigheten til de testede kreftcellelinjene med omtrent 20 prosent. Vi så også lignende effekter mot leukemi- og lymfomcellelinjer, med en reduksjon i levedyktighet til 66 prosent med L.edodes-ekstraktet mot THP1leukemiceller, og til 70,6 prosent med P.ostreatus-ekstraktet mot CCRF-CEM-leukemiceller. Vandige mycel- og fruktkroppsekstrakter av L.edodes ble tidligere rapportert å ha anti-proliferative og apoptotiske virkninger på MCF-7 brystkreftceller[70]. Etylacetatfraksjonen og -glukan av L.edodes var hovedsakelig ansvarlig for disse handlingene [71,72]. I samme sammenheng var P. ostreatus-ekstraktet i stand til å vise anti-proliferativ aktivitet mot MCF-7 og MDA-MB-231 brystadenokarsinomceller [73], og de 6-koblede glukanene av ekstraktet potenserte den naturlige morderens cytotoksisitet mot bryst- og lungekreftceller [74]. Nylig har Jakopovic et al. fant at medisinske sopppreparater bestående av 6 og 10 sopp inkludert L.edodes og P. ostreatus viste signifikante anti-proliferative og pro-apoptotiske effekter på kolorektale (HCT-116, SW620) tumorcellelinjer [75]. Tvert imot la forfatterne merke til at effekten på en human fibroblastcellelinje (WI-38) var proliferativ, noe som viser spesifisiteten til disse sopppreparatene mot tumorcellelinjer. På samme måte oppdaget vi minimal cytotoksisitet utskilt av soppene våre mot normale menneskelige PBMC-er. Dette funnet antyder også sikker bruk av soppene våre.

Cytotoksisiteten til sopp har blitt tilskrevet et bredt spekter av molekyler inkludert x- og -glukaner, proteiner, glykoproteiner, fettsyrer, nukleosidantagonister, terpenoider og fenoliske forbindelser [76]. Abdalla et al. (2012) foreslo at soppekstrakter undertrykte brystkreftcelleproliferasjon ved å hemme aromataseaktivitet [77]. Imam et al. (2021) isolerte en indol-3-melkesyre fra Ledodes som hemmet delingen av lungeadenokarsinomceller [78]. Yukawa et al. (2012) antydet at den direkte apoptotiske effekten av L edodes mycelia på HepG2-celler er gjennom aktivering av caspase-{10}}- og -8-dødsreseptorveier [79]. Wu et al. (2011) studerte den cytotoksiske effekten av proteinekstraktet av P. ostreatus på humane kolorektale adenokarsinom (SW480)-celler og en human monocytisk leukemi, THP-1(celler), og rapporterte generering av ROS, utmattelse av glutation, endring av mitokondriell membranpotensial og desintegrasjon av oligonukleosomalt DNA, noe som resulterer i apoptose av SW480-celler [80].

Siden antioksidanter ikke virker gjennom en enkelt mekanisme, blir evaluering av antioksidantkapasitet vanligvis utført gjennom mer enn én metode [81]. I denne studien ble tre vurderingsmetoder brukt, nemlig DPPH-, ABTS- og ORAC-analyser. SET (single electron transfer) antioksidantmekanismen ble evaluert gjennom DPPH-analysen, mens ABTS- og ORAC-analysene ble brukt for HAT (hydrogenatom transfer)-reaksjoner [81]. ORAC-analysen gir mer presise nøyaktige estimater ettersom den kombinerer inhiberingstiden og graden av hemming i en enkelt term [82]. Mens fosfomolybdatanalysen vanligvis brukes til å uttrykke den totale antioksidantkapasiteten (TAC), brukes alle tre metodene

i dette manuskriptet er det rapportert for å evaluere TAC. Munteanu og Apetrei (2021), i sin gjennomgang av metodene som ble brukt for å bestemme antioksidantaktivitet, beskrev ABTS-radical scavenging assay som en "enkel og praktisk metode brukt for å måle den totale antioksidantkapasiteten (TAC)"[83]. I deres komparative studie, Csepregi et al. (2016) sammenlignet fire metoder brukt for evaluering av TAC, som var Trolox-ekvivalent antioksidantkapasitet (TEAC), det jernreduserende antioksidantpotensialet (FRAP), 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) radikal scavenging assay, og Folin-Ciocalteu reagensreaktivitet (FCR)[84]. I 2013 introduserte Ou et al. ORAC som en ny metode for evaluering av TAC[85]. På samme måte, Rubio et al.(2016) )klassifiserte ORAC-analysen som blant de direkte metodene for å bestemme TAC, sammen med TEAC [86]. Resultatene av ABTS- og ORAC-analysene viser at P. ostreatus- og L.edode-ekstraktene har antioksidantkapasiteter som er høyere enn standardantioksidanten Trolox.

Antioksidanteffekten til de to soppene kan tilskrives tilstedeværelsen av mange bioaktive komponenter, inkludertflavonoider, fenoler, bioaktive peptider og vitamin C[87]. Gaber et al. sammenlignet ABTS-, DPPH-, jernreduserende antioksidantkraft (FRAP) og ORAC-analysene for å vurdere antioksidantkapasiteten til guavaekstrakter og rapporterte en positiv korrelasjon mellom antioksidantkrefter, bestemt av de fire metodene, og vitamin C-innholdet og TPN. På den annen side registrerte de en negativ korrelasjon med karotenoidinnholdet [88]. DPPH(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl) er et stabilt fritt radikal som har et uparet valenselektron ved ett atom av nitrogenbroen; dermed er fjerning av DPPH-radikalet grunnlaget for den populære DPPH-antioksidantanalysen[89]. 2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonat) radikalkation (ABTS) mister sin blå farge når den reduseres med en antioksidant, og fargeendringen kan kvantifiseres spektrofotometrisk [90]. ORAC-analysen måler den oksidative nedbrytningen av fluorescenssonden av frie radikaler som blir avbrutt av antioksidantstoffet. Følgelig, jo sterkere antioksidantkapasitet, desto kortere tid er det nødvendig for å slukke fluorescensen [91]. I tillegg, siden de testede ekstraktene viste lovende antioksidanteffekter når de ble testet gjennom de ovennevnte metodene, kan det konkluderes med at de virker gjennomfjerning av frie radikaler. Imidlertid inneholdt de testede soppene et betydelig totalt flavonoidinnhold, og ettersom flavonoider har blitt knyttet til aktiveringen av transkripsjonsfaktoren Nrf2 (2017), kan dette legges til som en antatt mekanisme [92].

4. Materialer og metoder

4.1.Forberedelse av sopparter og underkultur

Tidligere identifiserte P. ostreatus og L.edodes sopp ble hentet, som gyter og/eller fruktlegemer, fra kultursamlingen til Agriculture Research Center, Kairo, Egypt [93,94]. Kirurgiske kniver ble brukt til å kutte frukten aseptisk for sub-dyrking fra soppfruktlegemer. Indre mycel ble høstet ved bruk av sterile nåler og sub-dyrket i sterile Potato Dextrose Agar (PDA) plater (Merck, Darmstadt, Tyskland)95]. For å subkultivere soppgyter ble sterile pinsett brukt til å plukke frøene og aseptisk overføre dem til sterile PDA-plater, som deretter ble inkubert ved 28 grader i 7 dager, og fruktlegemene til hver stamme ble vasket separat. Hvert isolat (500 g) ble stående i 48 timer ved romtemperatur for å lufttørke, malt manuelt i en kjøkkenkvern og lagret ved romtemperatur i et godt gjennomluftet område for fremtidig bruk.

4.2. Vannekstraksjon av Pleurotus Ostreatus og Lentinus Edodes

Hvert isolats tørkede frukt ble malt til et 500 g pulver ved hjelp av en husholdningsmikser, deretter maserert tre ganger i 7Lof destillert vann ved romtemperatur i tre dager, ultralydbehandlet (ultralydrens, England, Storbritannia), og deretter filtrert. Prosessen med maserasjon og filtrering ble gjentatt til væsken var oppbrukt. Etanol ble brukt til å lagre utbyttet. Etter etanolfordampning ved 45 grader ble totalt 500 ml av hvert isolat frysetørket for å gi omtrent 20 g tørr rest av hvert ekstrakt [96].

4.3. Proteomisk analyse

Proteomisk analyse ble utført i proteomikk- og metabolomikkenheten ved Children's Cancer Hospital Egypt 57,357(CCHE), Kairo, Egypt. Omtrent 600 uL av 8 M urea i 500 mM Tris (pH8.5) og 60 uL komplette ultraproteaser (Roche) , Mannheim, Tyskland) ble lagt til hver prøve, og deretter ble prøvene ristet kraftig og sentrifugert ved 10,{10}} RPM i 30 minutter. Supernatanter ble samlet, og fraksjoner (1 ug/10 μL) ble injisert ved bruk av NanoLC-systemet. Massespektrometri trippel TOF-systemet (Sciex TripleTOF 5600 plus , AB SCIEX, Concord) ble koblet med væskekromatografi (LC) (3 um, ChromXP C18 CL, 120 A, 150 × 0,3 mm), bestående av en Eksigent nanoLC400 autosampler en Ekspert nanoLC425-pumpe, med en strømningshastighet på 10 μL/min i 55 minutter, for hver prøve [97]. Dataanalyse ble utført av ProteinPilot (versjon 5.0.1.0,4895) og Paragon Algorithm (versjon 5.0.1.0,4874). Proteinsekvenser ble justert mot sekvenser i Swiss-Prot og TrEMBL-databasen (Pleurotus sp. som inneholder 14.792 oppføringer for P. ostreatus, og Lentinula sp. som inneholder 12603 oppføringer for L.edodes)[98]. Vanlig identifiserte proteiner mellom soppartene ble illustrert ved bruk av Venny2.1.0.BioinfoGP-programvare [99] (Kingston upon Hull, England, Storbritannia).

4.4. Karakterisering av bioaktive forbindelser

Som tidligere rapportert ble det totale innholdet av løselig karbohydrat bestemt ved bruk av fenolsvovelsyreteknikken [100]. Data presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), og eksperimenter ble utført i tre eksemplarer.

Totalt fenolinnhold (TPC) og totalt flavonoidinnhold (TFC) ble bestemt som rapportert av Ryan et al. [101]. Prøver ble fremstilt ved en konsentrasjon på 20 mg/ml i vann. Gallussyre (1 mg/ml stamløsning) ble fremstilt i metanol. Rutin (1 mg/ml stamløsning) ble fremstilt i metanol. Gallussyrestandarder og prøver ble pipettert i brønnene på platen i seks replikater og målt ved 630 nm. Hver av de 10 rutinstandardene og prøvene i seks replikater ble målt ved 420 nm.

HPLC-analyse av totale fenoler og flavonoider ble utført i henhold til metoden til Singh et al. [102]. Hver av prøvene og 10 forskjellige standardløsninger ble oppløst i metanol og filtrert ved bruk av 0,22 um sprøytefiltre, og deretter ble 100 μL av hver prøve og 10 ul av hver standard injisert ved hjelp av en HPLC-kolonne, Waters 2690 Alliance HPLC system utstyrt med en Waters 996 fotodiode array detektor. Kolonne C18 Inertsil ODS3:4,6×250 mm,5 um; mobil fase: buffer (0,1 prosent fosforsyre i vann); metanol-elueringsmetoden var gradient med en strømningshastighet på 1 ml/min ved en bølgelengde på 280 nm.

For vannløselig vitaminanalyse, de testede soppekstraktene (50 mg/ml), referansestandarder (10 mg i 10 ml 0,05 M natriumhydroksid) av hver av de syv vannløselige vitaminene (tiamin HCl, askorbinsyre, riboflavin, nikotinsyre, nikotinamid, pyridoksin HCl og folsyre)[103] og av de fettløselige vitaminene, løsninger (50 mg/ml) av de tre soppekstraktene og en standardløsning i metanol av tre fettvitaminer: E, D3 og A, med henholdsvis 806,2, 114 og 400 IE/ml, ble fremstilt. Løsningene ble deretter fortynnet til 100 ug/mL, filtrert ved bruk av et 0,22 um sprøytefilter, og 100 μL ble injisert på en HPLC-kolonne, Waters 2690 Alliance HPLC-system (Milford, CT, USA) utstyrt med en Waters 996 fotodiode array-detektor. Kolonne Inertsil ODS 3∶4,6×250 mm,5 μm; mobil fase: buffer (0,85 g heksansulfonsyrenatriumsalt i 1000 ml vann og pH ble justert til 3 med ortofosforsyre); metanoleluering var gradient ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved en bølgelengde på 210 nm [104].

4.5. Protein- og aminosyreanalyse

Sammensetningen av aminosyrer i soppekstraktene ble vurdert ved bruk av en Sykam Amino Acid Analyzer (Sykam GmbH, Tyskland) utstyrt med et løsningsmiddeltilførselssystem, S 2100 (kvartærpumpe med strømningsområde {{ 24}}.01 til 10,00 mL/min og maksimalt trykk opptil 400 bar), en autosampler, S5200, en aminosyrereaksjonsmodul, S4300 (med innebygd dobbeltfilter fotometer ved 570 nm), og en nedkjølt reagensorganisator, S4130. Ett gram av hvert soppekstrakt ble blandet med 5 ml heksan og fikk maserere i 24 timer, og deretter ble blandingen filtrert ved bruk av Whatman nr. 1 filterpapir. Resten ble plassert i et reagensrør inneholdende 10mL6N HCl og inkubert i en ovn ved 110 grader i 24 timer. Etter inkubasjonen ble filtrering utført ved bruk av Whatman nr. 1 filterpapir, etterfulgt av inndamping i en rotasjonsfordamper. Resten ble fullstendig oppløst i 2 ml fortynningsbuffer (tri-natriumcitratdehydrat 0,06 M, sitronsyre 0,03 M, fenol 0,02 M, tiodiglykol 1,4 prosent, HCL 32 prosent), fortynnet 1000- ganger i samme buffer og deretter lastet på en ammoniakkfilterkolonne (LCA, K04/Na, 4,6×100 mm, Sykam GmbH, Erasing, Tyskland) utstyrt med en automatisk aminosyreanalysator (Sykam) [105].

4.6. Cellekulturer

Livmorhalskreft (HeLa), akutt monocytisk leukemi (Thpl), kolorektal karsinom (Colo-205) og blindtarmskreft (LS-513) celler ble opprettholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (Lonza, Köln, Tyskland) supplert med 100 mg/ml streptomycin, 100 enheter/ml penicillin og 10 prosent varmeinaktivert føtalt bovint serum. Andre cellelinjer: human leukemi (CCRF-CEM); akutt promyelocytisk leukemi (NB-4); humant lymfom (U937); prostatakreft (DU-145 og PC3); hepatocellulært karsinom (HepG2); brystadenokarsinom (MCF-7 og MDA-MB-231); Vero; og Hep-2-celler, ble sub-dyrket på Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM; Invitrogen, California, USA), og inkubasjonen ble utført ved 37 grader i en fuktet atmosfære med 5 prosent CO2. Cellelinjene ble hentet fra Nawah Scientific Inc. (Mokatam, Kairo, Egypt), mens primære perifere mononukleære blodceller (PBMC) og normale mennesker (ATCC PCS-800-011TM)celler ble kjøpt fra Viscera, Kairo, Egypt. Dette arbeidet ble godkjent av den etiske forskningskomiteen ved Det farmasøytiske fakultet, Ain Shams University (godkjenning nr. 294).

4.7. Antiiral aktivitet

Antiviral aktivitetble testet mot adenovirus type 7(Ad7) og herpes simplex virus type II (HSV-2)(Nawah Scientific, Mokattam, Egypt). Antiviral aktivitet ble vurdert som tidligere beskrevet [106]. Vero- og Hep-2-celler ble sådd inn i en 96-brønnkulturplate med en tetthet på 2×10* celler/brønn én dag før infeksjon. Cellekulturmediet (avsnitt 4.6) ble fjernet neste dag, og fosfatbufret saltvann (PBS) ble brukt til å vaske cellene. Smittsomheten til humant adenovirus og herpes simplex-virus type II ble bestemt ved bruk av sulforhodamine B(SRB)-metoden, som overvåket cytopatiske effekter (CPE) og beregnet prosentandelen av cellelevedyktighet [107]. Den antivirale aktiviteten ble beregnet basert på soppekstraktenes evne til å hemme de virale CPE-ene, hvor 50 prosent cytotoksisk konsentrasjon (CC5o) og 50 prosent hemmende konsentrasjon (IC50) ble bestemt ved bruk av GraphPad PRISM-programvare (Graph-Pad Software, San Diego , CA, USA). Selektivitetsindeksen (SD) ble beregnet som angitt av Dogan et al. [108] i henhold til ligning (1)Selektivitetsindeks (SI)=CC50/IC50

4.8. Cytotoksisitet mot PBMC ved bruk av MTT-analyse

Cytotoksisitet ble vurdert ved å bruke MTT-analysen【109】. Alikvoter (100 μL) av cellesuspensjoner (celletetthet 1.2-1.8×10* celler/brønn) ble sådd ut i 96-brønnplater, komplett medium ble tilsatt og cellene ble inkubert i 24 timer. Deretter ble cellene behandlet med seriefortynninger av soppekstrakter i 48 timer. MTT-løsning (5 mg/ml) i PBS ble tilsatt til brønner og inkubert i 4 timer, og absorbans ved 570 nm ble avlest ved bruk av en mikroplateleser. Ubehandlede celler ble brukt som negative kontroller, og celler behandlet med doksorubicin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) tjente som en positiv kontroll.

4.9.Evaluering av cytotoksisk aktivitet ved bruk av SRB mot kreftcellelinjer

Cytotoksisitet mot prostatakreft (DU{{0}} og PC3); hepatocellulært karsinom (HepG2); kolorektalt karsinom(Colo-205); cecum karsinom(LS-513); livmorhalskreft (HeLa); og brystadenokarsinom (MDA-MB-231 og MCF-7) cellelinjer ble evaluert ved bruk av sulforhodamin B (SRB) kolorimetrisk analyse [110]. Cellesuspensjoner i komplette medier (4.6) ble inkubert i 96-brønnplater i 24 timer. Deretter ble forskjellige konsentrasjoner (0 til 100 ug/ml i komplette medier) av soppekstrakter tilsatt og inkubert i 72 timer. Ubehandlede celler ble brukt som negative kontroller, og celler behandlet med doksorubicin fungerte som en positiv kontroll.

4.10. Levedyktigheten til leukemi- og lymfomcellelinjer ved bruk av WST-1-analyse

Cytotoksisitet mot human leukemi (CCRF-CEM), akutt promyelocytisk leukemi (NB4), akutt monocytisk leukemi (THP1) og humant lymfom (U937) ble bestemt ved hjelp av vannløselig tetrazoliumsalt (WST-1)-analyse ved bruk av Abcamkit ( ab155902 WST-1 celleproliferasjonsreagens, Storbritannia). Cellesuspensjoner ble inkubert i 24 timer og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0 til 100 ug/ml i komplette medier) av soppekstrakter i 48 timer. Cellene ble deretter behandlet med 10 μL WST-1-reagens i 1 time, og A450 ble lest ved hjelp av en mikroplateleser [111]. Ubehandlede celler ble brukt som negative kontroller og celler behandlet med doksorubicin (Sigma-Aldrich, Tyskland) tjente som en positiv kontroll.

4.11.Antioksidantaktivitet

4.11.1.DPPH Radical Scavenging Activity

DPPH-radikalfangende assay ble utført i henhold til metoden til Lu et al. [112]. Den resulterende reduksjonen i DPPH-farge ble målt ved 540 nm.Antioksidant aktivitetble uttrykt som inhiberingsprosenten med referanse til kalibreringskurven (R2=0.9903). Data er representert som gjennomsnitt ± SD i henhold til ligning (2):(Antioksidantaktivitetsprosent=[(abs-blank-abs-sample)/abs-blank]×100)

(2)hvor abs-blindprøve og abs-prøve refererer til absorbansen til henholdsvis blindprøven og prøven. Prøvekonsentrasjonen som kreves for å hemme halvparten av de frie radikalene (IC50) ble estimert.

4.11.2.ABTS (2,2'-Azinobis-(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre))Radikalkationfjernende aktivitet

Analysen ble utført som tidligere beskrevet 【113】. Soppekstrakter (10 μL av 0 til 100 ug/mL løsninger) ble blandet med 190μL nylaget ABTS (Sigma-Aldrich Germany) i 96-brønnplater og inkubert i mørket ved romtemperatur i 2 t. Hver prøve ble testet i fire replikater, og absorbansen ble målt ved 734 nm. Antioksidantaktivitet ble uttrykt som en prosentandel av inhibering (ligning (1)) med referanse til kalibreringskurven (R2=0.9948).

4.11.3. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)-analyse

Analysen ble utført som tidligere bestemt [62], med mindre modifikasjoner. Kort fortalt ble 12,5 μL av soppekstraktene, i tre eksemplarer, inkubert med 75 μL fluorescein (10 nm) i 30 minutter ved 37 grader. Fluorescensmåling (485 EX, 520 EM, nm） ble utført i tre sykluser (syklustid=90 s). Etterpå, 12,5 μL nylaget 240 mm løsning av 2,2'-Azobis 2- amidinopropandihydroklorid(AAPH)(Ab-cam, Cambridge, Storbritannia) ble tilsatt til hver brønn umiddelbart og fluorescensmåling ble fortsatt i 2,5 timer (85 sykluser, hver 90 s.) Analysen måler tapet av fluoresceinfluorescens over tid som et resultat av peroksylradikaldannelse ved nedbrytning av AAPH. Trolox(6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylkroman-2-karboksylsyre), et vannløselig vitamin E analog, tjente som en positiv kontroll som hemmer fluorescein-nedbrytning på en doseavhengig måte Antioksidantaktivitet ble uttrykt som en prosentandel av inhibering (ligning(1) med referanse til kalibreringskurven (R2= 0.9957).

4.12.Statistisk analyse

Tredobbelt kjemiske analyser ble utført, og resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Statistiske analyser ble utført ved enveis ANOVA.

Betydningen av forskjeller mellom gjennomsnitt ble evaluert med Tukey-Kramer multiple sammenligningstesten. En p-verdi på Mindre enn eller lik 0.05 ble ansett som statistisk signifikant. Den statistiske evalueringen ble bestemt ved å bruke GraphPad PRISM programvare (Graph-Pad Software, San Diego, CA, USA).

5. Konklusjoner

Soppene P. ostreatus og L.edodes inneholder et bredt spekter av bioaktive forbindelser. Proteomanalyse viste uttrykk for flere bioaktive molekyler med mange biologiske aktiviteter. Vandige ekstrakter av sopp har lovendeantiviraltaktiviteter mot adenovirus type7 og herpes simplex virus type II.CPE ble påvist mot kreftcellelinjer, men ikke mot normale humane PBMC. Denne studien oppmuntrer til bruk av disse soppene til farmakologiske formål i lys av deres lave cytotoksisitet på normale PBMCer, i tillegg til deres antivirale, antitumor- og antioksidantegenskaper.

Referanser

1. Bertéli, MBD; Oliveira Filho, OBQ; Freitas, JDS; Bertolucci, WC; Silva, GR; Gazim, ZC; Lívero, FAR; Lovato, ECW; Valle, JS; Linde, GA; et al. Lentinus crinitus basidiocarp stipe og pileus: Kjemisk sammensetning, cytotoksisitet og antioksidantaktivitet. Eur. Mat Res. Teknol. 2021, 247, 1355–1366. [CrossRef]

2. Ragupathi, V.; Stephen, A.; Arivoli, D.; Kumaresan, S. Antibakteriell aktivitet, in vitro antioksidantpotensial og GC-MS-karakterisering av metanolisk ekstrakt av Gymnopilus Junius, en villsopp fra det sørlige vestlige Ghats, India. Eur. J. Biomed. 2018, 5, 650–657.

3. Atila, F.; Owaid, MN; Shariati, MA De ernæringsmessige og medisinske fordelene ved Agaricus bisporus: En gjennomgang. J. Microbiol. Bioteknologi. Food Sci. 2017, 7, 281–286. [CrossRef]

4. Gaitán-Hernández, R.; Cortés, GMN Forbedring av utbyttet av den spiselige og medisinske soppen Lentinula edodes på hvetehalm ved bruk av tilsatt gyte. Braz. J. Microbiol. 2014, 45, 467–474. [CrossRef] [PubMed]

5. Smânia, A.; Delle Monache, F.; Smânia, E.; Gil, M.; Benchetrit, L.; Cruz, F. Antibakteriell aktivitet av et stoff produsert av soppen Pycnoporus sanguineus (Fr.) Murr. J. Ethnopharmacol. 1995, 45, 177–181. [CrossRef]

6. Ishikawa, NK; Kasuya, MCM; Vanetti, MCD Antibakteriell aktivitet av Lentinula edodes dyrket i flytende medium. Braz. J. Microbiol. 2001, 32, 206–210. [CrossRef]

7. Hwang, H.-J.; Kim, SW; Lim, J.-M.; Joo, J.-H.; Kim, H.-O.; Kim, H.-M.; Yun, J.-W. Hypoglykemisk effekt av rå exopolysakkarider produsert av en medisinsk sopp Phellinus baumii i streptozotocin-induserte diabetiske rotter. Life Sci. 2005, 76, 3069–3080. [CrossRef] [PubMed]

8. Hearst, R.; Nelson, D.; McCollum, G.; Millar, BC; Maeda, Y.; Goldsmith, CE; Rooney, PJ; Loughrey, A.; Rao, J.; Moore, JE En undersøkelse av antibakterielle og antifungale egenskaper til bestanddeler av Shiitake (Lentinula edodes) og østers (Pleurotus ostreatus) sopp. Komplement. Ther. Clin. Prak. 2009, 15, 5–7. [CrossRef]

9. Zervakis, G.; Philippoussis, A.; Ioannidou, S.; Diamantopoulou, P. Myceliumvekstkinetikk og optimale temperaturforhold for dyrking av spiselige sopparter på lignocelluloseholdige substrater. Folia Microbiol. 2001, 46, 231–234. [CrossRef]

10. Sánchez, C. Dyrking av Pleurotus ostreatus og andre spiselige sopp. Appl. Microbiol. Bioteknologi. 2009, 85, 1321–1337. [CrossRef]