Kvantitativ vurdering av inflammatoriske infiltrater i nyretransplantasjonsbiopsier ved bruk av multipleks tyramidsignalforsterkning og dyp læring

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Abstrakt

Forsinket graftfunksjon (DGF) er en sterk risikofaktor for utvikling av interstitiell fibrose og tubulær atrofi (IFTA) ved nyretransplantasjoner. Kvantitativ vurdering av inflammatoriske infiltrater i nyrebiopsier av DGF-pasienter kan avsløre prediktive markører for IFTA-utvikling. I denne studien kombinerte vi multipleks tyramidsignalforsterkning (mTSA) og konvolusjonelle nevrale nettverk (CNN) for å vurdere det inflammatoriske mikromiljøet i nyrebiopsier av DGF-pasienter (n=22) tatt 6 uker etter transplantasjon. Pasientene ble stratifisert for IFTA-utvikling (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola forebygger nyresykdom, klikk her for å få prøven

Introduksjon

Forsinket graftfunksjon (DGF) etter nyretransplantasjon er multifaktoriell og hovedsakelig relatert til donorkarakteristikker og iskemitid. DGF er generelt beskrevet som behov for dialyse innen 7 dager etter transplantasjon og er en sterk risikofaktor for kronisk nyretransplantasjonsskade [1–3]. En klassisk komponent ved kronisk nyreskade er tilstedeværelsen av interstitiell fibrose og tubulær atrofi (IFTA). Imidlertid går ikke alle DGF-pasienter videre til utviklingen av IFTA, og det komplekse forholdet mellom DGF og IFTA er fortsatt dårlig forstått. Dette skyldes først og fremst forsinkelsen mellom potensielt kausative hendelser og funksjonsnedgang, og for det andre på grunn av de variable og komplekse effektene av potensielle induktorer som avvisning og bivirkninger av medisiner [1, 4]. Den generelle tilstedeværelsen av betennelse og spesifikke makrofager har blitt beskrevet i en rekke studier som en prediktor for transplantattap [5–8]. Imidlertid er de underliggende patologiske prosessene ikke fullt ut forstått, og høye nivåer av betennelse fører ikke alltid til langsiktig transplantattap. Som et resultat av miljøstimuli får makrofager spesialiserte funksjoner og polariseres til forskjellige fenotyper. Tallrike studier tyder på at spesifikke makrofagundertyper (alternativt aktiverte makrofager) er involvert i vevsremodellering ved å indusere vevsreparasjon eller fibrose. Polarisasjonen mot en vevsremodellerende (noen ganger pro-fibrotisk) fenotype er kjent for å være avhengig av et bredt spekter av miljøstimuli, blant annet gitt av T-hjelper lymfocyttsubtyper [9–11]. Vurdering av T-hjelpercellepopulasjoner i transplantatet på tidspunktet for DGF avslørte en utbredt T-hjelper 1-subtype, men korrelasjoner til transplantatutfall eller progresjon til IFTA ble ikke undersøkt så langt [12]. En omfattende vurdering av det inflammatoriske mikromiljøet spesifikt fokusert på makrofager og T-hjelpercelleundergrupper i nøye utvalgte pasientkohorter kan gi innsikt i hvorfor noen, men ikke alle DGF-pasienter går videre til utviklingen av IFTA.

Imidlertid er en omfattende undersøkelse av inflammatoriske infiltrater hemmet av flere (tekniske) begrensninger. Tradisjonell immunhistokjemi (IHC) og immunfluorescensteknikker støtter visualisering av bare et begrenset antall cellemarkører i en vevsseksjon. Seriell seksjonering av små, verdifulle vevsfragmenter som nyrebiopsier er ikke ønsket, og tolkningen av forhold mellom celler i forskjellige seksjoner er vanskelig. I tillegg kommer kvantitativ vurdering av de inflammatoriske infiltratene ved visuell estimering med et signifikant nivå av interobservatørvariabilitet [13]. Tradisjonelle bildebehandlingsteknikker som pikselterskel, vannskille og morfologibasert segmentering er avhengig av forkunnskaper om alle morfologiske cellerepresentasjoner og vevsfargeintensitet gjennom et datasett [14–16]. Derfor mangler disse metodene ofte robusthet for biologiske og tekniske bildevariasjoner og oversetter dårlig til nye eller eksterne datasett. Fremveksten av digital patologi har akselerert utviklingen av alternative metoder for vurdering av hellysbilder (WSI) [17, 18]. Dyplæringsmodeller, spesifikt konvolusjonelle nevrale nettverk (CNN) har vist seg å være i stand til å segmentere og oppdage relevante biologiske strukturer i histopatologiske lysbilder [19–23]. Disse teknikkene har potensial til å gå fra subjektiv visuell estimering og tradisjonell bildebehandling til nøyaktig, objektiv og reproduserbar celledeteksjon.

Målet med denne studien er å utvikle en metode for objektiv, kvantitativ vurdering av flere inflammatoriske cellemarkører, og omgå behovet for omfattende seriell lysbildeseksjonering. For å gjøre det, kombinerer vi multipleks IHC, multispektral bildebehandling og dyplæringsmodeller. For å demonstrere anvendeligheten til disse teknikkene, studerer vi korrelasjonene til det inflammatoriske mikromiljøet, kvantifisert ved hjelp av dyplæringsmodeller, med utviklingen av IFTA i overvåkingstransplantatbiopsier av DGF-pasienter.

cistanche-ekstrakt som behandler nyresykdommer

Materialer og metoder

For å vurdere det inflammatoriske mikromiljøet i nyrebiopsier av DGF-pasienter, utførte vi multipleks IHC på overvåkingsbiopsier tatt 6 uker etter transplantasjon. Pasientene ble stratifisert for IFTA-utvikling (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Vevsprøver

Vi brukte overvåkingsbiopsier fra nyretransplanterte ved Hannover Medical School (Hannover, Tyskland), anskaffet i sammenheng med et prospektivt overvåkingsbiopsiprogram. Inkluderingskriterier var: DGF-forekomst (definert som<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

IFTA vurdering

Omfanget av interstitiell fibrose (ci) og tubulær atrofi (ct) (IFTA) etter 6 uker og 6 måneder, uttrykt ved bruk av Banff lesjonsgraderingssystem [24] ble hentet fra patologirapporten. For å vurdere forholdet mellom tidlige inflammatoriske infiltrater og IFTA-utvikling mer detaljert, ble alle PAS-fargede lysbilder digitalisert for ny undersøkelse ved bruk av en Pannoramic 250 Flash II digital lysbildeskanner (3DHistech, Ungarn) med en 20 × objektiv med en oppløsning på 0,24 μm/piksel. PAS WSI for begge tidspunktene (6 uker og 6 måneder) ble skåret for omfanget av IFTA (prosent av overflateareal, med 10 prosent intervaller) av tre nyrepatologer. De gjennomsnittlige IFTA-skårene til patologene ble brukt som en endelig poengsum for å beregne endringen i IFTA mellom 6 uker og 6 måneder etter transplantasjon. Pasientene ble stratifisert etter absolutt økning i IFTA-score på 10 prosent eller mer (n=13) og ingen eller<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

I tillegg ble Banff-lesjonsskårene sammenlignet mellom tidspunkter ved bruk av Wilcoxon signed ranks test. Dette avslørte signifikante forskjeller mellom 6 uker og 6 måneders biopsier for Banff-kategoriene ti (p=0.017), ci (p=0.004) og ct (p=0.011) .

Multiplex TSA-farging

Vi utførte multipleks IHC ved å bruke mTSA for å visualisere flere cellemarkører i 6 ukers biopsier. Etter inkubasjon med et primært og sekundært antistoff ble vevet behandlet med fluorescerende merket tyramid. Pepperrotperoksidasen fra det sekundære antistoffet katalyserer dannelsen av aktive tyramidradikaler. Tyramidradikalene binder seg kovalent til tyrosinrestene på antigenet. Denne permanente bindingen muliggjorde varmeindusert fjerning av det primær-sekundære antistoffkomplekset samtidig som det fluorescerende tyramidavsetningen ble bevart [25]. Dette muliggjorde den påfølgende suksessive inkubasjonen med ytterligere antistoffer fra samme art mot målantigenene.

mTSA ble utført på to påfølgende lysbilder fra 6 ukers overvåkingsbiopsier. Vi utviklet to mTSA-paneler for å vurdere den inflammatoriske infiltraten og den peritubulære kapillærutstrekningen i våre pasientgrupper. Panel I besto av anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 og CD34 antistoffer. Panel II ble brukt til å undersøke T-hjelpercelle og makrofagpolarisering ved å bruke anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 og CD163 antistoffer. Antistoffspesifikasjoner, fortynninger og fargingsrekkefølger er oppført i tilleggstabell 1. Alle objektglass ble deparafinisert i xylen, dehydrert i 95 prosent etanol, vasket i vann fra springen og kokt for epitopinnhenting i 10x fortynnet trisborat-EDTA (TBEx) , 0658, VWR Life Sciences, USA) buffer. Etter avkjøling ble objektglassene vasket i 3 prosent hydrogenperoksidaseløsning for endogen peroksidaseblokkering og vasket med en tris-bufret saltvannsbuffer med 0,05 prosent Tween 20 (822184, Merck KGaA, Tyskland) (TBS-T). Proteinblokkering ble utført ved bruk av TBS-T med 1 prosent bovint serumalbumin (BSA) (mTSA trinn 1). Primære antistoffer ble inkubert i 1 time ved romtemperatur, eller over natten ved fire grader Celsius (mTSA trinn 2). Etter vasking i TBS-T ble objektglassene inkubert med et HRP-konjugert sekundært antistoff (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Nederland) i 30 minutter ved romtemperatur (mTSA trinn 3). Deretter ble TSA utført ved å bruke Opal TSA-fluoroforene fra et Opal 7-fargemanual IHC-sett (NEL811001KT, Akoya Biosciences, USA) (mTSA trinn 4) (fluoroforer og deres tilsvarende antistoffer er oppført i tilleggstabell 1). Antistoff-TSA-komplekset ble fjernet med en kokesyklus i TBE-buffer (mTSA trinn 5). mTSA-trinn 1–5 ble gjentatt til lysbildene ble farget med alle antistoffer fra det aktuelle panelet. Objektglassene ble dekket med fluoromount-G med DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, USA).

herba cistanche

Multipleks TSA-validering

Gjentatte kokesykluser kan påvirke målepitopaffiniteten. Noen antistoffer viser et svakere fargemønster etter at vevet er kokt flere ganger, andre antistoffer trenger flere kokesykluser for å oppnå optimal fargeintensitet, og andre påvirkes ikke i det hele tatt. Vi vurderte denne effekten for alle antistoffer ved bruk av kromogen IHC på FFPE-kontrollmandelvev. For hvert testet antistoff (n=9) ble seks seksjoner kuttet (4 μm tykke). Alle objektglass ble deparafinisert i xylen, dehydrert i 95 prosent etanol, vasket i vann fra springen og kokt for epitophenting i 10x fortynnet TBE (kokesyklus én). Etter avkjøling ble ett objektglass per testet antistoff lagret i fosfatbufret saltvann (PBS). De resterende objektglassene ble kokt igjen. Denne syklusen ble gjentatt fem ganger. Alle objektglass ble deretter vasket i 3 prosent hydrogenperoksidaseløsning og etterfulgt av skylling i PBS. Primære antistoffer (tilleggstabell 1) ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubering ble objektglassene vasket i PBS. Objektglass farget med anti-CD68-, Tibet- og GATA3-antistoffer krevde en ekstra inkubasjon med post-antistoffblokkering (PAB) i 15 minutter (VWRKDPVB-blokkering, Immunologic, Nederland). Etter inkubering ble objektglassene vasket i PBS og inkubert med et HRP-konjugert sekundært antistoff (etter PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Nederland, for andre, se tilleggstabell 1 for sekundært antistoff). Visualisering ble utført ved bruk av 3,3′-diaminobenzidin (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Nederland). Resultatene er visualisert i tilleggsfigur 1. Basert på disse resultatene bestemte vi den optimale antistoffrekkefølgen for mTSA-eksperimentene, som oppført i tilleggstabell 1.

Hvis epitoper av interesse er samlokalisert, kan tyramidavsetningene forstyrre hverandre. For å teste for denne steriske hemmingen brukte vi mandelkontrollvevsglass og farget disse med mTSA-panelene våre. Antistoffuttrykket i mTSA ble sammenlignet med det i enkeltfargede objektglass, som gikk gjennom samme antall kokesykluser. Vi observerte ikke forskjeller i fargingsmønstre mellom enkelt- og multipleksfargede objektglass (eksempler inkludert fra panel I, tilleggsfigurer 2 og 3). Alle primære antistoffer i mTSA ble brukt i samme fortynning som ble brukt for kromogen IHC. Intensiteten til det fluorescerende signalet ble optimalisert ved å justere TSA-løsningens fortynninger.

Multipleks TSA-avbildning

Multispektral avbildning ble utført ved hjelp av et Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, USA) med et 20x objektiv, med en oppløsning på 0,49 μm per piksel, og ved bruk av DAPI, FITC, CY3, Texas Red og Cy5 spektralterninger. Vectra-systemet tillater manuelt valg av regioner for multispektral innsamling, som deretter deles av systemet i fliser (fig. 1.1). Spektrene for autofluorescens og alle Opal TSA-fluoroforer ble forhåndsinnspilt i et spektralt "bibliotek" ved bruk av Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, USA). Spektralbiblioteket gjorde det mulig å dekomponere multipleksflisen til flere enkeltfliser som representerte bidraget til hver fluorofor ("unmixing"). Dette resulterte i monokrom, flerkanals fliser, hver kanal tilsvarte en enkelt fluorofor og dermed antistoff (fig. 1.2).

Konvertering til kunstig lysfelt IHC

Basert på lagrede koordinater ble flisene sydd for å lage en flerkanals WSI ved hjelp av et tilpasset python-skript (fig. 1.3). Kanalene som representerer DAPI-signalet (IDAPI) og kanalene som representerer ett av antistoffene (IIHC) ble omdannet til henholdsvis kunstig hematoksylin- og DAB-farging (fig. 1.4 og 1.5). Basert på kjent kromatisk hematoksylin og DAB Cx, Cy-koordinater etter nyanse-metning-densitet (HSD) transformasjon, ble fargevektorer ervervet i tidligere studier [26, 27]. Disse fargevektorene ble brukt til å beregne rød-grønn-blå-verdiene for det kunstige lysfeltet IHC (fig. 1.5), som:

med CR, st lysabsorpsjonen av fargest i den røde delen av spekteret. Verdier for B og G ble beregnet på lignende måte.

Bildeanalyse

Regioner av interesse (ROI)

Regioner av interesse (ROIs) ble kommentert for hvert tilfelle i kohorten ved å bruke den automatiserte lysbildeanalyseplattformprogramvaren (ASAP; versjon 1.9, tilgjengelig som åpen kildekode-programvare på GitHub). Disse ROI-ene består av kortikalt tubulointerstitium, og ekskluderer dermed kapselen, glomeruli og arteriene. Siden betennelse i renale subkapsulære regioner anses som ikke-spesifikk i transplantasjonspatologi, ble biopsiene i denne studien primært analysert unntatt den subkapsulære regionen (definert som 400 µm under kapselen). Sekundært gjentok vi analysene inkludert den subkapsulære regionen. Visuelle eksempler på ROI-er er inkludert i tilleggsfigur 4.

Lymfocyttdeteksjon CNN I

De kunstige lysfelt IHC-bildene som representerer CD3-, CD4-, CD8- og CD20-farging ble analysert ved å bruke en eksisterende CNN med en U-Net-arkitektur [22, 28]. Dette nettverket ble spesifikt designet for påvisning av cytoplasmatiske lymfocyttmarkører i IHC. CNN-ytelse kan uttrykkes i presisjon, tilbakekalling og en F1--poengsum, der:

CNN oppnådde en presisjon på {{0}}.76, en tilbakekalling på 0.79 og en F1-score på 0.78 på testsettet som ble brukt i det originale papiret, bestående av tradisjonell IHC WSI. Deteksjon av individuelle positive celler krever terskel for CNN-utdata, etterfulgt av etterbehandling. Fordi CD3-fargingen i mTSA-panelet var sterkere sammenlignet med CD4, CD8 og CD20, ble en lavere objektdeteksjonsterskel brukt for de tre sistnevnte (0,4) og den opprinnelige objektdeteksjonsterskelen for CD3 (0,7). For å vurdere CNN-ytelsen på de kunstige lysfelt IHC WSI-ene i denne studien, ble fire kunstige lysfelt IHC WSI (CD8 og CD20 fra to pasienter) brukt som et testsett i denne studien. Punktmerknader (n=1115) ble generert ved hjelp av ASAP-programvare. Etter bruk av nettverket ble presisjon, tilbakekalling og F1--poengsum beregnet for å vurdere CNN-ytelsen. Deteksjoner ble ansett som sanne positive hvis de ble funnet innenfor 4 µm (gjennomsnittlig lymfocyttdiameter) fra en grunnsannhetsannotering. Når to deteksjoner ble funnet innenfor et område på 4 µm, ble bare deteksjonen som var nærmest merknaden ansett som sann positiv. Deretter ble lymfocyttdeteksjon CNN I brukt til analyse av alle kunstige lysfelt IHC WSI som representerer cytoplasmatiske lymfocyttmarkører (CD3, CD4, CD8 og CD20).

Lymfocyttdeteksjon CNN II

Analysen av kunstig lysfelt IHC WSI med kjernefysiske fargingsmønstre (som presentert av T-bet og GATA3) kanaler som representerer DAPI og CD4 ble valgt for å bli kombinert i en WSI (4). Flekkvektorer anskaffet i tidligere studier ble brukt til å kunstig farge DAPI-signalet blått (hematoxylin) og CD4-signalet brunt (DAB), noe som resulterte i et kunstig lysfelt IHC WSI (5).

nødvendig opplæring, validering og testing av et nytt CNN. For dette formålet ble ni objektglass kuttet fra nyre-, mandel- og appendiks FFPE-kontrollvev. Disse lysbildene ble IHC-farget med anti-Tibet (klon 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, USA) og anti-GATA3 (klon L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Nederland) antistoffer. Lysbildene ble digitalisert ved hjelp av en Pannoramic 250 Flash II digital lysbildeskanner med en oppløsning på 0,12 μm/piksel. To observatører produserte 5726 punktmerknader på tvers av forskjellige regioner ved å bruke ASAP-programvare. Merknader fra fem lysbilder ble brukt til å trene en U-Net-arkitektur CNN ved bruk av patcher på 256 × 256 piksler med en pikselstørrelse på 0,49 μm/piksel. To WSI ble brukt for validering av CNN og for å bestemme objektdeteksjonsterskelen (0,4). CNN-ytelsen på tradisjonell IHC WSI ble vurdert på et tilbakeholdt testsett med to IHC WSI. CNN ytelse på kunstig lysfelt IHC WSI ble vurdert på et sekundært testsett bestående av fire kunstige lysfelt IHC WSI (Tibet og GATA3 fra to pasienter) med 1082 punktmerknader. Presisjon, tilbakekalling og F1-poeng ble beregnet for å vurdere ytelsen på begge testsettene. Deteksjoner ble ansett som sann positive hvis de ble funnet innenfor 4 µm fra en grunnsannhetsannotering. Når to deteksjoner ble funnet innenfor et område på 4 µm, ble bare deteksjonen som var nærmest merknaden ansett som sann positiv. Deretter ble lymfocyttdeteksjon CNN II brukt til analyse av alle kunstige lysfelt IHC WSI-er som representerer kjernefysiske (lymfocytt) markører (Tibet og GATA3).

Makrofageteksjon CNN

I motsetning til lymfocyttdeteksjon er identifiseringen av individuelle makrofager ikke entydig. Spesielt i grupperte scener kan det forventes et betydelig nivå av observatørvariabilitet. Derfor ble et mye større antall tilfeller og menneskelige merknader brukt til å trene en dedikert, tredje CNN for påvisning av CD68 pluss og CD163 pluss makrofager. IHC-fargede objektglass (n=111) fra naturlig og transplantert nyrevev ble samlet. IHC-farging ble utført ved bruk av anti-CD68 (klon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Danmark eller klon KP1, M0876, Dako, Danmark) eller anti-CD163 (klon MRQ -26 eller 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) antistoff. IHC-lysbildene ble digitalisert ved hjelp av en panoramisk 250 Flash II digital lysbildeskanner eller en Aperio AT2 lysbildeskanner (Leica Biosystems, Wetzlar, Tyskland) med en oppløsning på 0.24 eller 0 .25 μm/piksel, henholdsvis. Fire observatører produserte 37 709 punktmerknader på tvers av flere ROI-er i WSI-ene, ved å bruke en protokoll for makrofagannotering, som ble avtalt etter innledende piloteksperimenter. Merknadene fra 101 lysbilder ble brukt til å trene en YoloV2-arkitektur CNN [29]. Yolo er spesielt egnet for oppgaver rettet mot deteksjonsoppgaver. Nettverket, bestående av syv konvolusjonslag, ble trent på patcher på 256 × 256 piksler ekstrahert med en oppløsning på 0,98 μm/piksel med avgrensende bokser på 21 μm (basert på gjennomsnittlig makrofagstørrelse). Ti WSI ble brukt for validering av CNN og for å bestemme objektdeteksjonsterskelen (0,45) og ikke-maksimal undertrykkelsesparametere (0,05). CNN-ytelsen på tradisjonell IHC WSI ble vurdert på et tilbakeholdt testsett på ti IHC WSI. CNN ytelse på kunstig lysfelt IHC WSI ble vurdert på et sekundært testsett bestående av fire kunstige lysfelt IHC WSI (CD68 og CD163 fra to pasienter) med 1033 punktmerknader. Presisjons-, tilbakekallings- og F1-poengsum ble beregnet for å vurdere ytelsen på begge testsettene. Deteksjoner ble ansett som sanne positive hvis de ble funnet innenfor 21 µm (gjennomsnittlig makrofagdiameter) fra en grunnsannhetsannotering. Når flere deteksjoner ble funnet innenfor et område på 21 µm, ble bare deteksjonen som var nærmest merknaden ansett som sann positiv. Deretter ble makrofagdeteksjonen CNN brukt til analyse av alle kunstige lysfelt IHC WSI som representerer makrofagmarkører (CD68 og CD163).

cistanche tubolosa testosteron

Dobbel positivitet

Cellenes positivitet for to markører (dobbel positivitet) ble vurdert ved å bestemme antall piksler mellom celledeteksjoner i de forskjellige kanalene. Hvis avstanden mellom to lymfocyttdeteksjoner var<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Celletall ble beregnet inne i ROI-ene, og celletettheter ble basert på celletall og arealet til den kommenterte ROI-en.

Romlige forhold

Automatisert celledeteksjon i WSI tillater undersøkelse av romlige forhold mellom celler. Den gjennomsnittlige korteste avstanden ble bestemt (i regioner unntatt den subkapsulære regionen) for CD68 pluss-celler og CD3 plus-, CD3-pluss-CD8-plus- og CD20-plus-celler i WSI-en til panel I for begge pasientgruppene, og mellom CD163-pluss-celler og CD4 pluss , CD4 pluss Tbet pluss og CD4 pluss GATA3 pluss i WSI for begge pasientgruppene.

Peritubulær kapillær utstrekning

For å vurdere den peritubulære kapillærutstrekningen, ble ublandede WSI-er som representerer CD34-kanalen analysert i Fiji (ImageJ versjon 2.0.0, USA, makroer og plugins: "Open and Duplicate", "ASAP ROI Reader") [30]. Positive piksler ble bestemt via automatisk terskelverdi og deretter uttrykt som prosentandelen av det totale antallet piksler inne i ROI.

Statistisk analyse

Tetthetene til følgende cellepopulasjoner ble beregnet i de 6 ukene biopsiene: T-lymfocytter (CD3 pluss ), cytotoksiske T-lymfocytter (CD3 pluss CD8 pluss ), B-lymfocytter (CD20 pluss ), makrofager (CD68 pluss , panel I og II), polariserte makrofager (CD68 pluss CD163 pluss , CD163 pluss ), T-hjelper 1-lymfocytter (CD4 pluss Tbet pluss ) og T-hjelper 2-lymfocytter (CD4 pluss GATA3 pluss ). Spearmans korrelasjonskoefisienter ble beregnet for å vurdere om det var en korrelasjon mellom T-hjelper 1 og T-hjelper 2 lymfocytttetthet (CD4 pluss Tbet pluss, CD4 pluss GATA3 pluss) og polarisert makrofagtetthet (enten CD68 pluss CD163 pluss eller CD163 pluss). Vi observerte CD68-signal (fluorofor 540 nm) i de kunstige CD4 (fluorofor 520 nm) IHC-ene til et panel I. Derfor rapporterer vi i tillegg celletetthetene for CD3 pluss CD8−-celler. For å vurdere forskjeller mellom pasientgrupper med forskjellige IFTA-utfall, rapporterer vi median, minimum og maksimum celletetthetsverdier per gruppe. Signifikante forskjeller i celletetthet og peritubulær kapillærutstrekning (definert som CD34-positiv pikselprosent) mellom grupper ble vurdert ved å bruke Mann–Whitneys U-test for uavhengige prøver. Hvorvidt pasienter med forskjellige IFTA-utfall viser signifikant forskjellige CD3 pluss CD8−/CD3 pluss CD8 pluss celleforhold, ble vurdert ved hjelp av en t-test for uavhengige prøver. Forskjeller mellom pasientgrupper i romlige forhold mellom CD68 pluss og CD163 pluss celler med andre immunceller ble vurdert for signifikans ved å bruke Mann–Whitneys U-test for uavhengige prøver.

Resultater

CNN-basert påvisning av IHC-positive celler

For å bruke eksisterende CNN-er, som opprinnelig ble utviklet for lysfeltmikroskopi, ble mTSA-fluorescensbilder transformert til kunstige lysfeltbilder. Eksempler på mTSA-fargede områder med deres tilsvarende kunstige lysfelt IHC-bilder er inkludert i fig. 2. Et eksempel på en kunstig lysfelt IHC WSI er demonstrert i tilleggsfigur 4. Multioppløsnings WSI-ene kan åpnes og ses i digital lysbildevisning programvare som ASAP og Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Som visualisert i fig. 2, var det kunstige lysfeltet IHC WSI egnet for automatisert analyse av CNN-er som opprinnelig ble utviklet for tradisjonell IHC WSI.

Tre CNN-er ble brukt for kvantitativ vurdering av inflammatoriske celler i de 6 ukene mTSA-fargede transplantasjonsbiopsiene: for lymfocyttdeteksjon med cytoplasmatisk (CNN I) og nukleær (CNN II) IHC-farging og for makrofagdeteksjon. Tabell 2 viser CNN-ytelse (presisjon, tilbakekalling og F1-score) for hold-out-sett av både DAB-fargede IHC WSI-er og kunstige lysfelt-IHC WSI-er. CNN-ytelsen var vanligvis like god som eller bedre enn grunnlinjen CNN beskrevet tidligere (med en F1--score på 0.78), som ble vist å ha ytelse sammenlignbar med erfarne manuelle observatører [22] . Mens lymfocyttdeteksjonen CNN II viste noe redusert ytelse på virtuelle lysfeltbilder sammenlignet med de virkelige DAB-bildene (som CNN ble trent på), ble det motsatte observert for CNN for makrofagdeteksjon.

Et eksempel på en vellykket automatisk dobbel positivitetsvurdering er inkludert i fig. 3.

Korrelasjon mellom ulike celletyper

Den sterkeste korrelasjonen ble observert mellom CD4 pluss GATA3 pluss celletetthet og CD163 pluss celletetthet (Spearmans koeffisient 0.75, p < 0.001)="" i="" 6="" ukers="" biopsi="" (supplerende="" fig.="" 5a).="" denne="" korrelasjonen="" var="" svakere="" mellom="" cd4="" pluss="" tbet="" pluss="" celletetthet="" og="" cd163="" pluss="" celletetthet="" (spearmans="" koeffisient="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (supplerende="" fig.="" 5b)="" .="" når="" cellepopulasjonen="" begrenses="" til="" dobbeltpositive="" makrofager="" (cd68="" pluss="" cd163="" pluss="" ),="" var="" spearmans="" korrelasjonskoeffisient="" 0.65="" (p="">< 0.01)="" med="" cd4="" pluss="" gata3="" pluss="" celler="" og="" 0.66="" (p="">< 0.01)="" med="" cd4="" pluss="" tbet="" pluss="" celler="" (supplerende="" fig.="" 5c,="" d).="" å="" inkludere="" den="" subkapsulære="" regionen="" i="" analysene="" endret="" ikke="">

Sammenligning av inflammatoriske infiltrater mellompasienter som går videre til IFTA versus ikke-IFTA

Pasienter som gikk videre til IFTA etter 6 måneder viste signifikant høyere CD163 pluss celletettheter i biopsiene tatt 6 uker etter transplantasjon (median 505 celler/mm2) sammenlignet med pasienter som ikke utviklet seg til IFTA (median 370 celler/mm2; p=0 .043) (tabell 3). Inkludering av den subkapsulære regionen resulterte i en liten reduksjon av denne effekten (p=0.051). CD68 og CD4 ble brukt i begge panelene. Objektglass farget med mTSA-panel I viste mer CD68-positivitet enn objektglassene farget med mTSA-panel II. CD4-celletettheten er høyere i mTSA-panel II sammenlignet med mTSA-panel I (tabell 3).

Den peritubulære kapillærutstrekningen var lik i 6 ukers biopsier av DGF-pasienter med forskjellige IFTA-utfall (tabell 3), både når man ekskluderte (p=0.74) og inkluderte (p=0}.90) den subkapsulære regionen fra/i analysen.

Vurdering av CD3 pluss CD8−/CD3 pluss CD8 pluss celleforhold viste et signifikant høyere forhold hos pasienter med<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Den gjennomsnittlige korteste avstanden fra CD68 pluss-celler til CD3 pluss , CD3 pluss CD8 pluss , og CD20 pluss-celler (panel I) og fra CD163 pluss-celler til CD4 plus , CD4 pluss Tbet plus , og CD4 pluss GATA3 pluss-celler (panel II) gjorde ikke skiller seg vesentlig mellom pasientgruppene. Resultatene er visualisert i fig. 4.

cistanche-ekstrakt: forbedrer nyrefunksjonen og fysisk styrke

Diskusjon

I denne studien utviklet vi en metode for nøyaktig og objektiv kvantifisering av inflamatoriske celleinfiltrater i graftbiopsier av nyretransplanterte pasienter med DGF som omgår omfattende seriekutting av nyrebiopsimateriale. For dette formålet kombinerte vi multipleks IHC, tyramidsignalforsterkning, multispektral avbildning og kvantifisering av CNN. Vi var de første som konverterte flislagt multispektrale data til ett enkelt kunstig kromogent bilde per cellemarkør, noe som letter WSI-analyse og bruk av CNN-er designet for lysfelt IHC. Vi designet to nye CNN-er for påvisning av kjernefargede lymfocytter og makrofager og demonstrerte generaliserbarheten til CNN-er utviklet på tradisjonell IHC WSI til kunstig lysfelt IHC WSI. Anvendeligheten av metoden vår ble demonstrert ved å bruke de kvantitative resultatene oppnådd av CNN for å studere korrelasjoner av det inflammatoriske mikromiljøet i 6 ukers biopsier av DGF-pasienter med utvikling av IFTA 6 måneder etter transplantasjon.

Vi brukte et kommersielt tilgjengelig manuelt fargesett for multipleks IHC for å visualisere immunceller og peritubulære kapillærer i overvåkingsbiopsier oppnådd 6 uker etter transplantasjon. Multipleksfargingsprosedyren besto av flere vaske-, inkubasjons- og vevkokingstrinn og involverer flere reagensløsninger. Omfattende metodevalideringer og kvalitetskontroller er derfor av stor betydning, og bruk av spesifikke antistoffer som gir konsistent fargeintensitet anbefales. Til tross for de utførte valideringstrinnene, ble makrofaglignende fargingsmønstre sett i CD4-kanalene til lysbilder fra mTSA-paneler I og II. CD4- og CD68-fargesykluser ble ikke utført fortløpende, så dette fenomenet kunne ikke være forårsaket av ufullstendig stripping av CD68-antistoffet (tilleggstabell 1). Selv om sjeldne forekomster av makrofag dobbel-positivitet med CD4 er beskrevet [31], ligger en mer plausibel forklaring i nærheten av fluoroforenes emisjonsspektre som ble brukt til CD4 (520 nm) og CD68 (540 nm) visualisering, begge dekket. ved hjelp av FITC filterkuben til fluorescensmikroskopet. Dette kan forårsake "blødning" av det sterke CD68-signalet inn i CD4-kanalen. Mye av dette signalet ble ekskludert fra analyse i panel I fordi bare CD4 pluss-celler som var dobbeltpositive med CD3 ble brukt til generell T-hjelpercelleanalyse. Ikke desto mindre bestemte vi oss for å indirekte vurdere generelle T-hjelperceller også, ved å bruke CD3 pluss CD8− som erstatning. I panel II ble CD4 utelukkende brukt i kombinasjon med Tibet og GATA3, noe som begrenser risikoen for bruk av falske positive deteksjoner.

Lavere CD68-positivitet ble observert i panel II sammenlignet med panel I. Vi antar at dette er resultatet av sterisk hemming av tyramidavsetning som tilhører CD163 ("paraplyeffekt") [32]. Vi observerte signifikant flere CD163-positive celler i den studerte kohorten enn i mandelvev som ble brukt til å sjekke for sterisk hemming, noe som muligens forklarer hvorfor denne effekten ikke ble oppdaget under valideringen.

Multiplex IHC har blitt kombinert med multispektral avbildning for undersøkelse av tumormikromiljøet i flere onkologiske studier, og nylig også for analyse av nyreallograftavstøtning [33–35]. For å trekke ut bidraget til alle markører i mTSA-lysbilder, avbildes seksjoner med et Vectra-system eller et lignende fluorescensmikroskop med et multispektralt oppsett. Etter å ha tatt opp et oversiktsbilde med lav forstørrelse, deler Vectra-systemet opp vevet i fliser og skanner automatisk flisene multispektralt. Dette resulterer i bildefliser med flere medvirkende spektre. Fordi spektrene til de enkle fluoroforene er kjent fra det forhåndsinnspilte spektrale "biblioteket", er det mulig å dekomponere multipleksflisene til flere enkeltfliser som representerer bidraget til hver fluorofor ("unmixing"). I de fleste studier blir de ublandede bildene deretter analysert med kommersiell programvare. I mange tilfeller støtter ikke disse programmene WSI-analyse, har vanskeligheter med å analysere grupperte celler og er ofte ikke motstandsdyktige mot artefakter og fargevariasjoner. Konvertering av de ublandede flisene til kunstige lysfelt IHC WSI-er, gjorde det mulig for oss å bruke en eksisterende CNN spesifikt designet for lymfocyttdeteksjon i IHC [22] (referert til som lymfocyttdeteksjon CNN I). Dette nettverket kan oppdage individuelle og klyngede lymfocytter med høy nøyaktighet samtidig som det er motstandsdyktig mot bakgrunnsfarging (fig. 2, CD3). I tillegg trente vi to nye CNN-er for påvisning av celler med nukleære fargingsmønstre (Tibet, GATA3) (lymfocyttdeteksjon CNN II) og for påvisning av makrofager. Makrofager er notorisk vanskelige å oppdage på grunn av deres spredte fargemønster. Makrofagdeteksjonen CNN ble derfor opplært ved å bruke merknadene til fire forskjellige eksperter. Før merknadene ble laget, ble det planlagt flere møter hvor kriteriene for å kommentere makrofager ble diskutert og vurdert. Dette resulterte i et nettverk som kan oppdage makrofager på en reproduserbar måte samtidig som den er robust for ikke-spesifikk farging (tabell 2, fig. 2 og tilleggsfig. 6). Så vidt vi vet er dette den første algoritmen for makrofagdeteksjon i skannede histopatologiske seksjoner. Vi testet ytelsen til alle tre nettverkene på et testsett bestående av tradisjonelle IHC WSI (lik de som ble brukt under trening) og på et sekundært testsett som besto av kunstig lysfelt IHC WSI, generert fra de multispektralt registrerte bildene. Alle CNN-er viser veldig god ytelse på de primære testsettene og lignende F{11}}poeng på de sekundære testsettene. Ytelsesmålingene for lymfocyttdeteksjon CNN I ble beregnet på normalt vev, artefakter og celleklynger. Det kunstige lysfelt IHC i det andre testsettet inneholdt ingen vevsartefakter og færre celleklynger. Dette kan forklare den generelle bedre ytelsen til dette nettverket på det andre testsettet. Makrofagdeteksjonen CNN ble trent og testet på merknader fra fire forskjellige annotatorer. Mens annoteringskriterier ble spesielt diskutert, ble det likevel observert variasjoner i merknadsstil. CNNs følsomhet er derfor trolig et sted midt i ytterpunktene i kommentarstilen. Merknadene for det andre testsettet ble generert av en annotator, som tilsynelatende samsvarte med CNN-sensitiviteten.

Ved å bruke de beskrevne CNN-ene tillot oss å undersøke det inflammatoriske infiltratet med enestående nøyaktighet i en unik serie med strengt utvalgte tidlige overvåkingsbiopsier av transplanterte pasienter med DGF.

Dessverre måtte flere prøver ekskluderes fra analyse, hovedsakelig på grunn av utilstrekkelig restvev etter diagnostisk opparbeiding. Selv med den begrensede størrelsen på datasettet fant vi signifikant høyere CD163 pluss celletettheter i biopsier av DGF-pasienter som gikk videre til utviklingen av IFTA, som er i tråd med den potensielt profibrotiske rollen til disse cellene [11]. Selv om den observerte trenden var i samsvar med publiserte data, kunne vi ikke bekrefte den skadelige effekten av tidlig tilstedeværelse av CD68 pluss makrofager som tidligere er rapportert for andre nyretransplanterte pasientgrupper [7, 36, 37]. Vi fant en positiv korrelasjon mellom tetthetene til CD4 pluss GATA3 pluss-celler og CD163 pluss-celler, noe som kan bekrefte bidraget til T-hjelper 2-lymfocytter mot et pro-fibrotisk mikromiljø. Selv om ingen nye prediktive biomarkører for IFTA-utvikling hos DGF-pasienter ble oppdaget i denne studien, utviklet vi med suksess metoder for nøyaktig, reproduserbar og skalerbar vurdering av inflammatorisk infiltrat i sparsomt vev som transplantasjonsbiopsier. Disse metodene er verdifulle for fremtidige kvantitative studier på betennelse i histopatologisk vev.

For å lindre binyretretthet med cistanche, klikk her for å få flere detaljer

Datatilgjengelighet

Samarbeidsforespørsler som involverer bruk av data presentert i denne studien kan rettes til den tilsvarende forfatteren (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) eller FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Anerkjennelser

Vi takker Mark Gorris og Kiek Verrijp for deres råd om mTSA-farging og bildebehandling, Merijn van Erp for å utvikle tilpasset ImageJ-funksjonalitet, og Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg og Martijn Otten for å generere grunnsannhet for makrofagdeteksjonsnettverket. I tillegg takker vi Irina Scheffner for hennes hjelp med den kliniske datainnsamlingen.

ForfatterbidragMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH og JAWML

designet studien. Pasientmateriale og kliniske data ble samlet inn og levert av JS, WG og FF. FF koordinerte innsatsen som ble utført ved MHH. JHB, EJS og JK scoret PAS-slide for IFTA-prosent. MH utførte mTSA-farging, validering av panel I og II, og avbildning og utblanding av panel I. VV avbildet og ublandet panel II. DJG utviklet metodene for å konvertere mTSA-fliser til kunstig lysfelt WSI. MH utførte konverteringene. ZS-C utviklet lymfocyttdeteksjons-CNN og skrev skriptene for lymfocyttkvantifiseringer. JL utviklet makrofagdeteksjons-CNN og skrev skriptene for makrofagkvantifiseringer. MH utførte celle- og kapillærkvantifiseringene. NSS beregnet celleavstandene. MH, BS, LBH og JAWML analyserte dataene. MH laget figurene og utarbeidet papiret. Den endelige versjonen av manuskriptet ble revidert og godkjent av alle forfattere.

FinansieringDette arbeidet ble støttet av ERACoSysMed-initiativet (prosjekt SysMIFTA) som en del av EUs Horizon 2020-rammeprogram tilbudt av ZonMw (tilskudd nr. 9003035004), med medfinansiering av det tyske forsknings- og utdanningsdepartementet (BMBF), tilskuddsnr. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) og FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML mottok konsulenthonorarer fra Philips (Nederland), og tilskudd fra

ContextVision, Philips (Nederland) og Sectra (Sverige), utenfor det innsendte arbeidet. JK mottok økonomisk støtte fra Dutch Kidney Foundation (prosjekt DEEPGRAFT, tilskudd nr. 17OKG23).

Overholdelse av etiske standarder

InteressekonfliktForfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Etikkgodkjenning og samtykke til å deltaDatainnsamling og analyse ble utført med informert pasientsamtykke og med godkjenning fra etikkstyret (nr. 2765) ved Hannover Medical School.

Utgivers notatSpringer Nature forblir nøytral med hensyn til jurisdiksjonskrav i publiserte kart og institusjonelle tilknytninger.

Åpen tilgangDenne artikkelen er lisensiert under en Creative Commons Attribution 4.0 internasjonal lisens, som tillater bruk, deling, tilpasning, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium eller format, så lenge du gir passende kreditt til den(e) originale forfatteren(e) ) og kilden, oppgi en lenke til Creative Commons-lisensen, og angi om endringer ble gjort. Bildene eller annet tredjepartsmateriale i denne artikkelen er inkludert i artikkelens Creative Commons-lisens med mindre annet er angitt i en kredittgrense til materialet. Hvis materiale ikke er inkludert i artikkelens Creative Commons-lisens og din tiltenkte bruk ikke er tillatt av lovbestemt regulering eller overskrider tillatt bruk, må du innhente tillatelse direkte fra opphavsrettsinnehaveren.

Referanser

1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Forsinket graftfunksjon i nyretransplantasjonen. Am J Transplant. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Risikofaktorer for langvarig transplantattap hos nyretransplanterte med kronisk allograftdysfunksjon. Exp Clin Transplant. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Sammenheng mellom forsinket graftfunksjon og allograft og pasientoverlevelse: en systematisk oversikt og metaanalyse. Nephrol-skivetransplantasjon. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Forsinket nyretransplantasjonsfunksjon: fra mekanisme til oversettelse. Nyre Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. Scoring av total betennelse er overlegen den nåværende Banff-betennelsesskåren når det gjelder å forutsi utfall og graden av molekylær forstyrrelse i nyre-allotransplantater. Am J Transplant. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Forutsi påfølgende nedgang i nyre-allograftfunksjon fra tidlige overvåkingsbiopsier. Am J Transplant. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. Makrofagers rolle i utviklingen av human renal allograftfibrose i det første året etter transplantasjon. Am J Transplant. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. Alternativt aktiverte makrofager i patogenesen av kronisk nyre allograft skade. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007– 17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Makrofageplastisitet og interaksjon med lymfocyttundergrupper: kreft som et paradigme. Nat Immunol. 2010;11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Nyremikromiljøer og makrofagfenotyper bestemmer progresjon eller oppløsning av nyrebetennelse og fibrose. Nyre Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrophages in organ transplantation. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. T-hjelper 1, 2 og 17 celleundergrupper hos nyretransplanterte pasienter med forsinket graftfunksjon. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Scoring av tumorinfiltrerende lymfocytter: fra visuell estimering til maskinlæring. Seminar Cancer Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. En bildeanalysebasert metode for kvantifisering av kroniske allograftskadeindeksparametre. AMPS. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Bruk av vannskillealgoritmer til segmentering av klyngede kjerner. Cytometri. 1997;28:289-97.

16. Lai YK, Rosin PL. Effektiv sirkulær terskel. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992– 1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. En undersøkelse om dyp læring i medisinsk bildeanalyse. Med Bilde Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Bildeanalyse og maskinlæring i digital patologi: utfordringer og muligheter. Med Bilde Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Diagnostisk vurdering av dyplæringsalgoritmer for påvisning av lymfeknutemetastaser hos kvinner med brystkreft. JAMA. 2017;318:2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Dyplæringsbasert histopatologisk vurdering av nyrevev. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.