Going Micro i Leptospirosis nyresykdom Ⅱ

4. Vertsimmunitetsresponser på Leptospira spp.

Hovedveien til Leptospira er direkte penetrasjon av slimhinner eller åpnet hud gjennom blod, vev, urin eller forurenset vann, som sprer seg gjennom den systemiske sirkulasjonen og spres til flere organer, som f.lever, lunge og proksimale tubuli avnefron i nyrene, hvor den kan formere seg og overleve i en måned [51]. I den innledende fasen av infeksjonenmedfødt immunresponsspiller en grunnleggende rolle som den første forsvarslinjen i leptospirose, og påvirker responsen tilmønstergjenkjenningsreseptorer, makrofag fagocytose, induksjon av ekstracellulærnøytrofil akkumulering, ogintervensjon av komplementsystemet [52].

Deimmun responshos mennesker spiller en viktig rolle iutvikling av kliniske tegn, det samme gjør virulensfaktorene til noen patogene stammer. De fleste menneskelige leptospirose er asymptomatiske eller milde, og bare 10 % av tilfellene utvikler alvorlige former med multiorgansvikt og økt dødelighet relatert til encytokinstormog en immuno-lammelse status. Patogene arter stimulerer en humoral respons i bakteriemifasen, selv om den påfølgende oppførselen tilimmun responser uklart. I studier av pasienter med flere kliniske manifestasjoner av leptospirose, har alvorlighetsgraden av det kliniske bildet blitt assosiert med ulike serumcytokinnivåer, som TNF-, IL-10 og IL-6 [53], men denne konklusjonen er fortsatt kontroversiell [54]. Disse forholdene har ført til økt interesse for å forstå immunresponsen generelt og de biologiske hendelsene som oppstår under infeksjon.

HVOR LANG TAR DET FØR CISTANCHE FUNGERER?

4.1. Leptospira og komplementsystemet

Den proteolytiske aktiviteten til Leptospiral proteaser mot den ekstracellulære matrisen lar infeksjonen komme inn i sirkulasjonsstrømmen. Komplementsystemet i sirkulasjonssystemet er en av hovedmekanismene for den medfødte immunresponsen mot patogen Leptospira. Imidlertid har Leptospira utviklet strategier for å unnslippe angrepet av komplementsystemet ved å binde proteiner til komplementmolekyler og produsere proteaser, slik som thermolysin, et termostabilt nøytralt metalloproteinase-enzym som påvirker C3-proteinkjeden. Patogene stammer binder faktor H (FH), komplementfaktor H-relatert protein 1 (FHR-1), faktor-H-lignende protein 1 (FHL-1), og C4b-bindende protein (C4BP), alle hvorav er ansvarlige for å hemme komplementsystemet [55]. Det er tre hovedstrategier for komplementunndragelse av patogen Leptospira [55,56] gjennom interferens av vertskomplementregulatorer, vertsprotease og bakteriell protease. For komplementregulatorer bruker Leptospira Faktor H (FH; en regulator av alternativ komplementvei) og C4-bindende protein (C4BP; en regulator av klassiske og lektinkomplementveier) for å akselerere nedbrytningen av C3-konvertasene og også fungere som kofaktorer for faktor I for spaltning av C3b og C4b [57,58]. Leptospiral protein (LcpA), sammen med vitronektin (Vn; en terminal pathway regulator) binder C9 og hemmer dets polymerisering [59], og blokkerer dermed potensielt membranaktiverende kompleks (MAC) dannelse [60]. I tillegg binder patogen Leptospira flere vertsproteaser, slik som Urokinase-type plasminogenaktivator (uPA), som induserer aktivt plasmin [61] (en serinprotease) for fordøyelse av C3b, C4b og C5 på Leptospira-overflaten [62]. Dessuten kan metalloproteaser og termolysin, den endogene Leptospira-proteasen, spalte og inaktivere flere komplementproteiner (C2, C3, C4 og Faktor B) [60]. Kombinasjonen av komplementregulatorer, fra verten og patogene Leptospira, letter bakteriell kolonisering i målorganene til verten [63].

4.2. Leptospira og nøytrofiler

Under infeksjon utløser den patogene arten av Leptospira sterk aktivering av nøytrofiler og en pro-inflammatorisk respons. Nøytrofiler er viktige for kontroll av mikroorganismer, men de bidrar også til vevsskade i verten. Det har blitt demonstrert at lave nivåer av ekstracellulær nøytrofil akkumulering på grunn av lav nøytrofil aktivitet i sirkulasjonen øker leptospiremia, noe som indikerer at den intravaskulære dannelsen av nøytrofile rekrutteringer kan være avgjørende for å forhindre tidlig spredning av patogen Leptospira [64].

4.3. Leptospira og makrofager

I den innledende fasen av Leptospira-infeksjon spiller makrofager en viktig rolle i elimineringen av spiroketten. Denne effektormekanismen sammen med en effektiv cytokinrespons er relatert til fagocytisk kontroll og spredning av infeksjon, selv om Leptospira spp. har vist seg å indusere apoptose i makrofager via Fas/FasL-caspase-8/-3-veien og lette deres overlevelse og spredning i verten på grunn av frigjøring av mitokondriell faktor-induserende apoptose og endonuklease hos infiserte makrofager [65]. Nyere forskning har blitt utført på mikro-transkriptomet til makrofager infisert med Leptospira for å bestemme de epigenetiske mekanismene, for eksempel post-transkripsjonell regulering av RNA. Makrofager infisert med Leptospira har vist at mikroRNA (miRNA) reguleres av infeksjon med spiroketten, noe som viser at denne reguleringen er avgjørende for responsen til disse immunsystemcellene ved Leptospira-infeksjon [66]. I menneskelige makrofager har aktiveringen av betennelsen mediert av reaktive oksygenarter og lysosomal katepsin B generert av Leptospira-infeksjon fremtredende nivåer av NLRP3 og IL-18, noe som favoriserer produksjonen av IL-1 og fører til en høy mulighet for fagocytose og rask modellering av noen cytokiner korrelert med leptospiroseresistens [67].

4.4. Humoral respons på Leptospira

Den spesifikke humorale responsen mot Leptospira er preget av produksjon av IgM- og IgG-antistoffer på den tredje dagen etter symptomdebut. I tillegg er IgA-produksjon rapportert fra dag én til den niende måneden etter infeksjon; faktisk har økningen i IgM blitt brukt som et alternativt mål i tidlig diagnose av leptospirose [68]. Effekten av den humorale responsen hos mennesker med leptospirose gjør at den serologiske diagnosen kan stilles etter naturlig infeksjon [69]. Det viktigste aspektet ved den humorale responsen ved Leptospira-infeksjon kan være dannelsen av beskyttende antistoffer. Vaksiner som for tiden er tilgjengelige for leptospirose er sammensatt av komplette cellepreparater og har begrensninger, som lav effekt, flere bivirkninger, lavt immunminne og mangel på kryssbeskyttelse for serovarforskjeller. Dermed er utvikling av nye vaksiner nødvendig for sykdomskontroll, og det forskes for tiden for å produsere vaksiner fra genetisk immunisering [70]. Leptospiras OMPer har blitt ansett som et antigen, med bedre immunogenisitet for B-lymfocytter, som inkluderer de strukturelle epitopene OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} og LipL41263-282 [71]. Disse epitopene er lovende kandidater for utvikling av en universell vaksine.

4.5. Adaptiv immunrespons på Leptospira: T-celler og cytokiner

Patogene arter av Leptospira induserer en immunrespons mediert av T- og B-lymfocytter, ledsaget av uttrykket av cytokiner som kan være assosiert med gravitasjonsdiagrammer. Aktivering av T-celler under infeksjon med Leptospira initierer den inflammatoriske responsen, hovedsakelig gjennom cytokinproduksjon. Dette er kritisk for tidlig eliminering av infeksjon, men den ukontrollerte produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner kan også resultere i cytokinoverproduksjon etterfulgt av en tilstand av immuno-lammelse, som kan føre til sepsis og multiorgansvikt. T-lymfocytter produserer IL-1, IL-6, IL-12, interferon (IFN)- og TNF-, som fungerer som kjemo-attraktanter for å rekruttere leukocytter på infeksjonsstedet. Interessant nok, in ex vivo, prolifererte de naive δ T-cellene i kulturer av mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) stimulert med antigener av Leptospira sammen med produksjon av både IL-17 og IFN [72]. Videre, mens leptospirose-infiserte villtype mus viste høyere nivåer av mange cytokiner, inkludert IL-4, IL-10 og IL-13 sammenlignet med uinfiserte mus, Leptospira-indusert murine kroniske nefritt (Daf1-/- mus) viste høyere uttrykk for glattmuskelaktin, IL-10, IL-13, men ingen forskjell på IL-12 og IL{{21} } nivåer [73]. Som sådan kan Daf1 og IL-17 spille en avgjørende beskyttende rolle i CKD-progresjon som koblingen mellom Leptospira-indusert murin CKD med nyrefibrose [72,73]. Hypotesen om utvalgt cytokinrespons i sykdomsprogresjon er imidlertid fortsatt usikker i human leptospirose så langt. Hos pasienter med alvorlig leptospirose og lungepåvirkning ble forhøyede nivåer av IL-6, CXCL8 og IL-10 oppnådd sammenlignet med pasienter med mild leptospirose [53]. Disse høye konsentrasjonene av cytokiner hos pasienter med leptospirose fremhever deres nøkkelrolle i utviklingen av alvorlig leptospirose.

Hos pasienter med alvorlig infeksjon finnes CD4+ T-lymfocytter med en pro-inflammatorisk profil og produsenter av IL-2 og IFN- mens CD4+ CD25høye produsenter av IL-10 er nesten fraværende. Reguleringen av T-lymfocytt-mediert immunrespons ser ikke ut til å forhindre vevsskade generert av den inflammatoriske responsen på Leptospira. I CD4+ T-lymfocytter hos mennesker med alvorlig leptospirose er produksjonen av TNF- og andre pro-inflammatoriske cytokiner høyere enn hos de med den milde formen av sykdommen, noe som indikerer at disse cytokinene kan brukes som markører for alvorlighetsgrad i den immunologiske fasen av infeksjon [74]. Produksjonen av IL-10 har vært assosiert med risikoen for død hos mennesker med leptospirose; Imidlertid assosierte en studie utført på eksponerte og asymptomatiske mennesker produksjonen av dette cytokinet med kontroll av den inflammatoriske responsen og overlevelse [74]. Under Leptospira-infeksjon reguleres inflammatoriske mediatorer og virkningen av enkelte leukocyttceller, som T-lymfocytter, raskt hos resistente individer, i motsetning til det som skjer hos individer med alvorlige former for leptospirose [75].

For å oppsummere er immunresponsen på Leptospira-infeksjon ikke fullt ut forstått på grunn av den kliniske oppførselen til pasienter med leptospirose, som samhandler med de forskjellige virulensfaktorene i bakteriegenomet, noe som gir Leptospira en solid patogen kapasitet.

5. Kliniske manifestasjoner

De kliniske manifestasjonene av leptospirose er forskjellige, alt fra milde, uspesifikke symptomer, som influensalignende symptomer (feber, myalgi og hodepine), til alvorlige symptomer sammen med organskader i sluttstadiet (f.eks. AKI, akutt leversvikt , og blødende diatese, også kjent som Weils syndrom), akutt hemoptyse fra lungeblødning, akutt forvirring fra aseptisk meningoencefalitt og akutt hjertesvikt fra akutt eller subakutt myokarditt [7]. Følgelig består de tre indikatorene for mistenkt leptospiroseinfeksjon av (i)akutt febersykdom, (ii) gulsott og (iii)akutt nyreskade[12]. Prediktorene for en alvorlig form for leptospirose er alvorlig myalgi ved debut, alvorlig blødningstendens og markert gulsott. Interessant nok, tilstedeværelsen av enten eksisterendeKronisk nyre sykdom(liten nyrestørrelse) eller forstørrede, tette nyrer med anuri er relatert til det verste utfallet [12]. Pasienter med leptospirose-assosiert nyresykdom bør derfor behandles umiddelbart.

6. Diagnose

6.1. Klinisk diagnose

En diagnose av leptospirose er basert på eksponeringshistorien, risikofaktorer og kliniske manifestasjoner. En høy indeks for mistanke kan omgå senere organskader. Imidlertid forveksles symptomer på leptospirose ofte med andre årsaker til akutt febrilt syndrom, som dengue-infeksjon, malaria, hepatitt og aktiv autoimmun sykdom. Mangelen på patognomoniske tegn på leptospirose gjør at diagnosen tentativt er basert på evaluering av feber og myalgi hos pasienter fra et endemisk område. Av denne grunn er laboratoriediagnose av leptospirose avgjørende.

6.2. Laboratoriediagnose

Leptospirose er vanskelig å diagnostisere i laboratoriet, spesielt i den akutte fasen. Det kan utføres ved direkte å identifisere spiroketter eller deres komponenter i kroppsvæsker eller vev, isolere leptospirer i kultur, eller påvise spesielle antistoffer gjennom forskjellige kliniske faser. Leptospirose er vanskelig å skille fra sykdommer, som malaria, denguefeber, rickettsia, influensa, hepatitt og gul feber på grunn av det vage kliniske utseendet. Som et resultat er det nødvendig med laboratorietester for å bekrefte diagnosen. Påvisningen av antistoffer mot leptospirer, leptospirer selv eller deres deoksyribonukleinsyre er grunnlaget for disse testene (DNA). Gjeldende laboratoriediagnose inkluderer både direkte identifikasjon (påvisning av Leptospira spirochetes eller DNA i prøvene eller isolering av organismen fra prøver) og indirekte påvisning (serologisk diagnose eller serologi for identifisering av Leptospiral infeksjon, som er basert på påvisning av spesifikke antistoffer mot ulike Leptospirale antigener) (tabell 1).

6.2.1. Direkte mikroskopisk undersøkelse, kultur og antigenpåvisning

Leptospirer er tynne, lyse, aktivt bevegelige spiraler med karakteristisk rask spinning (trekningsmotilitet) under det konvensjonelle mørkefeltsmikroskopet (DFM) og ca. 10 leptospirer/ml er nødvendig for påvisning av én celle per felt. Med en uke lengre i infeksjonens varighet er det omtrent 10 % døde i utbytte av DFM (fra 100 til 90 %). For å øke følsomheten, flere spesielle fargingsmetoder; Warthin-Stjernesølvfarging [76] og immunfarging (immunhistokjemi, immunfluorescens, immunomagnetisk antigenfangst og immunoperoksidasefarging [77]) som krever serovarspesifikke primære antistoffer (isolert eller i kombinasjon).

Tabell 1. Laboratorietester for leptospirosediagnose.

LAMP, loop-mediert isoterm forsterkning; PCR, polymerasekjedereaksjon; NGS, neste generasjons sekvensering; IHA, indirekte hemagglutinasjon; ELISA, enzymkoblet immunosorbentanalyse; IgM, immunoglobulin M; MAT, makroskopisk agglutinasjonstest; MCAT, mikrokapselagglutinasjonstest; DNA, deoksyribonukleinsyre; DFM, mørkfeltsmikroskopi

Parallelt er Leptospira-kultur fra blod, urin, cerebrospinalvæske og biopsivev mulig i løpet av de første dagene til 10 dager etter debut av sykdomssymptomer (leptospirosestadiet). Fordi de er saktevoksende (6–8 timers doblingstid), kresne og utsatt for kontaminering, må kulturprøvene oppbevares i minst 3–4 måneder før de kastes som negative) med bare 23 % følsomhet, men det er nødvendig for legemiddelsensitivitetstesten [6]. Som sådan består EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) media (oljealbuminkompleks) av bovint serumalbumin (fraksjon V), Tween 80, ammoniumkloridtiamin, monokaliumfosfat, dinatriumfosfat og ulike næringsstoffer [78] ofte brukt, mens de mer spesialiserte T80/40/LH-mediene (polysorbat 40, laktalbuminhydrolysat, superoksiddismutase og kaninserum), er nødvendig for noen serovarer [79]. For den primære isolasjonen av det store og mangfoldige utvalget av kresne patogene leptospirer, ser Hornsby–Alt–Nally (HAN), ut til å være et godt medium [80].

Påvisning av leptospirale antigener med immunoperoksidase, immunfluorescens eller et immunomagnetisk antigenfangstsystem er utviklet for prøver med lav bakteriebelastning eller mørkfeltsmikroskopi kan ikke brukes, men utføres ikke rutinemessig på grunn av begrensningen på primært antistoff [77]. I kontrast, nukleinsyregjenkjenning med ny DNA-amplifikasjon; polymerasekjedereaksjon (PCR) (dvs. nestet-PCR, kvantitativ PCR [qPCR]), loop-mediert isotermisk amplifikasjon (LAMP) og neste generasjons sekvensering (NGS) er verdifulle for en tidlig og nøyaktig laboratoriediagnose, spesielt med Leptospira-isolasjon ved bruk av inokulering av biologiske medier og DNA-hybridisering (DNA-probe) [81,82]. En rekke leptospirale mål (som 16S ribosomalt RNA) eller DNA kan amplifiseres for diagnose [83] og sanntids PCR (RT-PCR) er mer sensitiv og spesifikk enn standard PCR [84]. Fordi noen RT-PCR-primere kan binde seg til et ikke-spesifikt sted, noe som fører til falske positive resultater, har de siste sanntids multiplekse PCR-analysene blitt utviklet ved bruk av to sett med primere [85]. Nested PCR hjelper også med å oppdage mer spesifikke og sensitive DNA-steder med flere sett med primere [86,87]. Nåværende trender for diagnose av leptospirose er imidlertid bruken av både serologiske og molekylære teknikker, som PCR og ELISA (enklere enn gullstandarden serologisk MAT), for ressursbegrensede land [88,89]. I tillegg er LAMP-teknikken [90] for å oppdage et 16S rRNA-gen (rrs), en kostnadseffektiv, rask og høy avkastning for å oppdage patogene leptospirer i urinen. Foreløpig er NGS den mest presist baserte kulturuavhengige metoden for kjernegenomanalyse i kroppsvæsker (blod og urin) [91] og den fremtidige retningen for leptospirosetester vil være å bevege seg mot den molekylære klassifiseringen av leptospirer, som overvinner begrensningen av kulturisolering av leptospirer fra kliniske prøver. Derfor er verdien av PCR i den kliniske diagnosen leptospirose spesielt god, og flere moderne teknikker dukker opp

6.2.2. Anti-Leptospira antistoffdeteksjon

Det benyttes flere serologiske diagnoser; for eksempel slektsspesifikke antistofftester (indirekte hemagglutinasjon [IHA], enzymkoblet immunosorbentanalyse [ELISA], Lepto Dri Dot [latexagglutinasjon], mikrokapselagglutinasjon [MCAT]), og serovarspesifikke antistofftester (mikroskopisk agglutinasjonstest [ MAT]) [92,93]. Som sådan er MAT-kriterier for diagnose (i) en fire ganger titerøkning i parede sera (serokonvertering av den nåværende infeksjonen) eller (ii) en enkelt høy titer (Større enn eller lik 1:400 eller 1:800, høyere i epidemi områder) (seropositivitet) (antistoffer kan vedvare i noen tid etter infeksjon eller kryssreaksjon med andre sykdommer). I tillegg krever MAT et levende panel av alle Leptospira-serovarer i regionen, med et panel av lokalt standardiserte serovarer [93,94] som følger Verdensorganisasjonen for dyrehelse (19 antigener som er representativt for 15 serogrupper) [95]. Fordi antistoffer kan påvises 5–7 dager etter infeksjon, kan MAT-testen være negativ (titer < 1:50) i løpet av de første dagene av infeksjonen. Diagnose av leptospirose kan utføres med urinprøver [96] ved bruk av både serologi og molekylær deteksjon (16S rRNA), spesielt hos pasienter med nylig infeksjon (MAT større enn eller lik 1:800 eller ELISA IgM-positiv eller begge deler) [97] .

Med begrensede ressurser er en klinisk prediksjonsscore [98] basert på relevant klinisk historie og relaterte laboratorietester med poengsum i syv aspekter som følger: hypotensjon (3), gulsott (2), muskelsmerter (2), AKI (1,5) , lavt hemoglobin (3), hypokalemi med hyponatremi (3) og nøytrofili (1) er foreslått (en cutoff oppsummert poengsum på 4 har arealet under mottakerens operasjonskarakteristiske kurve {{10}}.78 ( 95 % KI 0.68–0.89) for leptospirosediagnose [77]). Denne Thai-Lepto-ved-innleggelse sannsynlighetsscore kan være et diagnostisk verktøy for tidlig presumptiv diagnose av leptospirose hos pasienter med alvorlig klinisk mistanke om sykdommen.