Encellet transkriptomikk avslører forstyrret nyrefilter celle-celle-interaksjoner etter tidlig og selektiv podocyttskade
Jul 02, 2024
Resultater
Single-Cell Profiling of >29,000 glomerulære berikede nyreceller
Gjeldende enkeltcelleprotokoller foridentifisere hele nyren<2.5% glomerular cells,9 and although a renset glomerulært preparatbruk av magnetiske perler beriker denne populasjonen,22 klarer den ikke å fange andre cellertyper nyresom kan være av interesse. En siktingsmetode ble brukt for samtidig å berike glomeruli og fange opp flere nyrecelletyper for å utvide disse funnene og utvikle en detaljert forståelse av celle-celle-interaksjoner i glomerulus i sammenheng med hele det cellulære landskapet i nyren, før og etter podocyttskade.
For å identifisere de tidlige transkripsjonelle effektene av podocyttablasjon på en celletypespesifikk måte, ble scRNAseq utført mednyrevevfra WT og iCTCFpod / mus samlet ved seriell sikting etter 1 uke med doksycyklinbehandling (figur 1A). Nyrevev fra fire WT-dyr (fire biologiske replikater) og fire iCTCFpod/dyr ga totalt 14.783 WT og 14.727 iCTCFpod/celler profilert etter filtrering (tilleggsfigur S1, A og B; tilleggstabeller S1 og S2). Data ble normalisert for å fjerne effekter på grunn av antall UMI-er og prosentandel av mitokondrieavlesninger. Etter integrasjon av WT og iCTCFpod / prøver, ble en lav oppløsning av clustering brukt til å oppdage ni klynger (figur 1B). Biologiske replikater av WT og iCTCFpod / prøver ble fordelt mellom alle klynger (tilleggsfigur S2, AC). Alle celletyper av glomerulus, så vel som ytterligere nyrecelletyper, ble identifisert ved bruk av etablerte og dataavledede markører (figur 1C; tilleggstabell S3; tilleggsfigur S3A).
Glomerulære celler, som representerer totalt 82,1 % av alle gjenvunnede celler [36,9 % podocytter, 42,1 % glomerulære endotelceller (GECs), 2,7 % mesangiale celler og 0.36 % PECs] ble isolert og samlet (Figur 1D) . Fire klynger av podocytter, fem klynger av GEC-er og en klynge hver av mesangiale celler og PEC-er, som uttrykker kanoniske celletypemarkører, ble identifisert (Figur 1E; Supplerende figur S3B). Biologiske replikater av WT og iCTCFpod / prøver ble fordelt over alle klynger (tilleggsfigur S2, DF; tilleggstabell S4). Som forventet, gitt at podocyttspesifikk CTCF-sletting fører til histologisk detekterbart podocytttap etter 2 uker, inneholdt 13 iCTCFpod/prøver en lavere prosentandel podocytter enn WT-prøver (figur 1F; tilleggstabell S5). iCTCFpod / prøver hadde 13,1 % færre podo-cytter, 11,9 % flere GEC-er og 1,5 % flere mesangiale celler enn WT-prøver (tilleggstabell S5). PEC-er bidro<1% to either of the iCTCFpod / or WT samples. This finding suggests that disruption of transcriptional programs critical for podocyte survival precedes histologically detectable podocyte injury and loss and highlights the power of scRNAseq in discerning subtle changes that can be missed by histologic analysis.
Podocyttspesifikk induserbar CTCF-sletting fører til genekspresjonsendringer i alle glomerulære celletyper
Differensiell ekspresjonsanalyse ble utført i hver av 11 klynger som sammenlignet iCTCFpod / og WT-celler (tilleggstabell S6). Gener ble ansett som differensielt uttrykte hvis de ble funnet i minst 10% av cellene i en gitt klynge, med en minimums absolutt logfoldendring på 0.1 og en justert P < 0. 05. Ctcf ble differensielt uttrykt i hver av de fire podocytt-klyngene, med gjennomsnittlige logfold-endringer på henholdsvis 0.390, 0.189, 0.331 og 0.303. Antallet celler i hver klynge ble samplet ned og differensialekspresjonsanalysen gjentatt for å sammenligne antall differensielt uttrykte gener blant de 11 klyngene. Podocyttklyngene hadde de mest differensielt uttrykte genene, etterfulgt av GEC-1 og GEC-2 (Figur 1G). De resterende tre klyngene av GEC-er, sammen med mesangialcellene og PEC-ene, hadde langt færre differensielt uttrykte gener (figur 1G), noe som tyder på at GEC-1 og GEC-2, blant alle glomerulære klynger, var mest påvirket av følgene av CTCF-delesjonsdrevet podocyttskade.
Sykdomsassosierte genprogrammer identifisert i spesifikke podocytt- og endotelcelleklynger
Denne studien forsøkte først å undersøke hvordan de individuelle podocytt-klyngene reagerer på skade. Et Venn-diagram av de differensielt uttrykte genene i hver av de fire podocyttklyngene avslørte at podocytt 1 hadde de mest unikt differensielt uttrykte genene til de fire podocyttklyngene (figur 2A; tilleggstabell S7). Observasjonen av at en av fire podocyttklynger var mer fremtredende påvirket, stemmer overens med tidligere histologiske data som indikerer at ikke alle podocytter påvirkes like alvorlig i møte med skade, og fremhever kraften til scRNAseq til å molekylært karakterisere heterogeniteten til celletilstander innenfor samme celletype.23
En overrepresentasjonsanalyse ble utført for å identifisere genprogrammer beriket som en konsekvens av CTCF-tap i podocytt 1-klyngen (tilleggstabell S8). De øverste berikede vilkårene ble visualisert med et berikelseskart for å gruppere gjensidig overlappende gensett (figur 2B). En fremtredende gruppe av berikede termer var mitokondrielle funksjoner, inkludert ATP-syntese, mitokondriell organisering, elektrontransportkjede og oksidativ fosforylering (figur 2B). Disse dataene utvider nyere arbeid som peker på mitokondriell dysfunksjon som et tegn på podocyttskade.24 I tillegg har menneskelig genetikk pekt på viktigheten av mitokondrielle funksjoner i podocytter, inkludert flere mutasjoner i CoQ biosynteseveien (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, og ADCK4) som forårsaker nefrotisk syndrom, hovedsakelig hos barn.25,26 Det har derfor blitt postulert at podocytt mitokondriell dysfunksjon kan representere en fremtredende celletilstand assosiert med alle sykdommer som stammer fra podocyttap.24 Dataene gir støtte for denne forestillingen ved enkeltstående -celleoppløsning, noe som antyder at mitokondriell dysfunksjon kan representere den tidligste skadetilstanden i en spesifikk populasjon av podocytter, noe som fører til tap av podocytter.
En overrepresentasjonsanalyse ble utført for å identifisere genprogrammer beriket som en konsekvens av CTCF-tap i podocytt 1-klyngen (tilleggstabell S8). De øverste berikede vilkårene ble visualisert med et berikelseskart for å gruppere gjensidig overlappende gensett (figur 2B). En fremtredende gruppe av berikede termer var mitokondrielle funksjoner, inkludert ATP-syntese, mitokondriell organisering, elektrontransportkjede og oksidativ fosforylering (figur 2B). Disse dataene utvider nyere arbeid som peker på mitokondriell dysfunksjon som et tegn på podocyttskade.24 I tillegg har menneskelig genetikk pekt på viktigheten av mitokondrielle funksjoner i podocytter, inkludert flere mutasjoner i CoQ biosynteseveien (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, og ADCK4) som forårsaker nefrotisk syndrom, hovedsakelig hos barn.25,26 Det har derfor blitt postulert at podocytt mitokondriell dysfunksjon kan representere en fremtredende celletilstand assosiert med alle sykdommer som stammer fra podocyttap.24 Dataene gir støtte for denne forestillingen ved enkeltstående -celleoppløsning, noe som antyder at mitokondriell dysfunksjon kan representere den tidligste skadetilstanden i en spesifikk populasjon av podocytter, noe som fører til tap av podocytter.
En av hovedgruppene av berikede termer fra overrepresentasjonsanalysen (figur 2B) var cytoskjelettorganisering samt en relatert enkelt beriket term for cellematriseadhesjon. Aktincytoskjelettet spiller en essensiell rolle i å opprettholde podocyttenes unike og komplekse struktur, og adhesjon til GBM er avgjørende for podocyttfunksjonen.27 Modne fokale adhesjoner inneholder hundrevis av proteiner som forbinder aktincytoskjelettet, reseptormatrisebinding, intracellulær signaltransduksjon og aktinpolymerisasjon. Et av de mest nedregulerte genene i podocytt 1 var Rhpn1 (tilleggsfigur S4A), en essensiell komponent for å etablere podocyttcytoskjelettdynamikk og opprettholde podocyttfotprosessarkitektur.28 Arp2/3-komplekskomponenten Arpc3, en driver for aktinpolymerisering, ble oppregulert i podocytt 1-klyngen (figur 2C; Supplerende figur S4B). Et gen for en tilleggskomponent i komplekset, Actr2, ble også oppregulert i både podocytt 1 og podocytt 4. I tillegg aktiverer Wasl, hvis proteinprodukt, N-WASP, Arp2/3-komplekset og er nødvendig for vedlikeholdet av podocyttfotprosesser in vivo29, ble også oppregulert i podocytt 1, podocytt 3 og podocytt 4. Cytoskjelettregulatoren Arhgdia, hvis delesjon er assosiert med nefrotisk syndrom hos mus,30 ble nedregulert i podocytt 1 (figur 2C). Ekspresjonsnivåene til to Rho GTPaser
Figur 3 Podocytt-klynge oppregulerer Col4a5. A: Col4a5 ble signifikant oppregulert i induserbar podocyttspesifikk CTCF-sletting (iCTCFpod / ) podocytt 1-celler sammenlignet med villtype (WT) podocytt 1-celler. Kollagen type IV ɑ5 (COL4A5) reseptorer ble sterkt uttrykt i mesangiale celler og glomerulære endotelcelle (GEC) subclusters 1 til 4. Størrelsen på pilspissen representerer det relative uttrykket av reseptoren. B: Kvantifisering av hybridiseringskjedereaksjon (HCR). Col4a5 ble signifikant oppregulert i iCTCFpod/Nphs2-uttrykkende celler sammenlignet med WT Nphs{{20}}uttrykkende celler. Fire WT og fire iCTCFpod / mus ble evaluert. Alle glomeruli fra tre bilder ble kvantifisert. C: Col4a5-ekspresjon i glomeruli av WT og iCTCFpod / dyr som evaluert av HCR. *P < 0,0001 (to-sidet t-test med Welch-korreksjon). Opprinnelig forstørrelse, 40; 63 (forstørrelser av innrammede områder) (C). Skala stenger Z 50 mm (C). IFI, immunfluorescerende avbildning.
GEC-1 and GEC-2 had nearly as many differentially expressed genes as podocyte clusters 2 to 4, whereas the remaining GEC clusters, mesangial cells, and PECs had fewer differentially expressed genes. Therefore, these two endothelial clusters were most affected by podocyte injury. GEC-1 expressed >600 unikt differensielt uttrykte gener (tilleggsfigur S6A; tilleggstabell S9). Overrepresentasjonsanalyse indikerte at de unikt differensielt uttrykte genene i GEC -1 ble beriket i genprogrammer for cellemigrasjon og adhesjon (tilleggsfigur S6, B og C; tilleggstabell S10). Disse analysene avslørte de tidligste transkripsjonsendringene som oppstår i GEC-er som en respons på podocyttskade.
Modellering av intercellulær kommunikasjon avslører nøkkelinteraksjoner mellom celletyper som respons på tidlig podocyttskade
Etter å ha identifisert forstyrrede genprogrammer i flere forskjellige celleklynger, forsøkte studien deretter å forstå hvordan glomerulær celle-celle-krysstale ble påvirket av podocyttskade. Studien undersøkte først listen over differensielt uttrykte gener i podocytt-, GEC- og mesangiale celleklynger. Ekspresjonen av to sentrale autokrine prosurvival-ligander, Vegfa og Pdgfb, samt uttrykket av PDGFB-reseptoren, Pdgfrb, ble forstyrret (tilleggstabell S6). Vegfa-ekspresjon ble redusert i alle podocyttklynger (gjennomsnittlig logfoldendring mellom 0.034 og 0.149). I kontrast ble Pdgfb-ekspresjonen økt i alle GEC-klynger (gjennomsnittlig logfoldendring mellom 0.031 og 0,140), og reseptoren Pdgfrb ble oppregulert i mesangiale celler (gjennomsnittlig logfoldendring på 0,155). Denne analysen antydet at podocyttskade fører til redusert ekspresjon av prosurvival-liganden Vegfa, noe som påvirker GEC-er negativt. For å kompensere kan GEC-er oppregulere prosurvival-liganden Pdgfb, og trigge mesangiale celler til å oppregulere reseptoren Pdgfrb.
NicheNet, en ny algoritme som utleder hvordan ligandreseptorinteraksjoner avledet fra ekspresjonsdata kan påvirke spesifikke mål ved å integrere eksisterende kunnskap om signal- og regulatoriske nettverk, ble brukt til å undersøke ligand-reseptorinteraksjoner og deres antatte målgener i dypere dybde.20 NicheNet ble brukt på modell i interaksjoner mellom podocytter og GEC-er så vel som mesangiale celler og GEC-er som potensielt kan indusere differensielt uttrykte gener (målgener) i GEC-er i setting av podocyttskade (figur 4A). For denne analysen ble alle klynger av hver celletype kombinert til en enkelt klynge. De beste predikerte ligander uttrykt av mesangiale celler og/eller podocytter var pleiotrofin (Ptn), angiopoietin 2 (Angpt2), Col4a1, vaskulær celleadhesjonsmolekyl 1, benmorfogenetisk protein 4 (Bmp4), Ephrin B1, bindevevsvekstfaktor og semaforering 3e (Sema3e) (Figur 4B). Ekspresjonsmønsteret til GEC-reseptorer som disse liganden er kjent for å virke gjennom, ble kartlagt ved siden av ligandaktivitetsanalysen. I tillegg ble de forutsagte målgenene som ble differensielt uttrykt i iCTCFpod / GECs sammenlignet med WT-kontroller også kartlagt. Resultatene i figur 4B er oppsummert som sirkulære plott i figur 4, C og D.
Flere ligander, reseptorer og målgener var bemerkelsesverdige fra denne analysen. Pleiotrophin, en ligand sterkt uttrykt i mesangiale celler (Figur 4B), er en utskilt vekstfaktor som kan binde og hemme proteintyrosinfosfatasereseptor type B, og stimulere endotelcellemigrasjon via økt Tek (Tie2)/Angpt137 og Kdr (Vegfr2)/Vegfa38 signalisering. Følgelig ble Tek betydelig oppregulert i GEC-er (figur 4B). Angpt2, sterkt uttrykt i mesangiale celler, er en antagonistisk ligand av Tek, som hemmer bindingen av Angpt1.39 Fordi Angpt1-signalering er kjent for å fremme podocyttoverlevelse og en forstyrrelse av Angpt1/Angpt2-forholdet bidrar til utviklingen av DKD,40, denne liganden reseptoranalyse så ut til å peke på maladaptiv Tek-signalering i GEC-er som en av de tidligste konsekvensene av podocyttskade
Denne studien fant også fremtredende endringer i type IV kollagenuttrykk i flere glomerulære celler (figur 4B). Normalt produsert av friske podocytter, går kollagen IV heterotrimerer over fra ɑ1ɑ1ɑ2 til ɑ3ɑ4ɑ5 under glomerulær utvikling, noe som er nødvendig for riktig GBM-dannelse og funksjon.33,34 Oppregulering av Col4a1, sammen med utvidelse av mesangialmatrisen, er ofte observert i DKD.41,42 I den nåværende analysen ble Col4a1 uttrykt av både mesangiale celler og GEC-er (gjennomsnittlig uttrykk for ligand-varmekart) (Figur 4B) og ble spesifikt oppregulert i iCTCFpod / GEC-er sammenlignet med WT-kontroller. Disse dataene tyder på at GEC-er oppregulerer Col4a1 ved podocyttskade, noe som kan føre til en stivere, fibrotisk GBM som bidrar til utviklingen av segmentell sklerose.33
Bmp4 var en høyt uttrykt mesangial ligand identifisert ved NicheNet-analyse (figur 4, BD). BMPer spiller nøkkelroller i nyreutvikling og sykdom.43 Bmp4 er oppregulert i forhold til diabetisk nefropati hos rotter,42 og behandling av mus med diabetes med et anti-BMP4-antistoff forhindrer oppregulering av Col4a1 og mesangial matriseutvidelse .44 Av spesiell interesse ble mesangial Bmp4 funnet å utløse GEC Smad6-uttrykk (figur 4B). Ekspresjon av Smad6 induseres av BMP-er, og i en negativ tilbakemeldingssløyfe hemmer Smad6 spesifikt BMP-er, inkludert BMP4.45 Smad6 ble nedregulert i iCTCFpod / GEC-er sammenlignet med WT-kontroller, noe som tyder på økt BMP-signalering i endotelceller i sammenheng med podocyttskade .
En av de prioriterte liganden identifisert i podocytter var Sema3e (figur 4, BD). Klasse 3 semaforiner er utskilte proteiner som fungerer i en rekke biologiske prosesser, inkludert angiogenese, lymfangiogenese og sykdom.46 Sema3a er oppregulert i human DKD,47 og Sema3g ble nylig identifisert som et podocyttspesifikt gen som beskytter podocytter mot betennelse in vivo. 48 Rollen til Sema3e i podocytten er fortsatt uklar. Den nåværende analysen avslørte et tidligere ukjent reseptor-ligand-par der podocytt Sema3e interagerer med plexinD1 på GEC-er for å utløse flere nedstrøms genmål i setting av podocyttskade (figur 4, C og D).
Blant flere nylig identifiserte GEC-målgener ble Hes1 og Cx3cl1 også funnet i adhesjonsgenprogrammene beriket med GEC -1 (Figur 4, BD; Supplerende Figur S6). Hes1 er et mål for Notch-signalering, som spiller en viktig rolle i den utviklende nyren, men reaktivering kan føre til fibrose.49 Cx3cl1 er et kjemokin hovedsakelig produsert av glomerulært endotel som fungerer som et kjemoattraktant og adhesjonsmolekyl for sin reseptor, Cx3cr1, som er allestedsnærværende uttrykt på mononukleære og sirkulatoriske lymfatiske leukocytter.50 Cx3cl1 har vært implisert i enforskjellige nyresykdommer, inkludertDKD, IgA nefropati og glomerulonefritt.50 Hes1 og Cx3cl1 ble begge oppregulert i iCTCFpod/GECs sammenlignet med WT-kontroller, noe som tyder på at GECs reagerer på podocyttskade ved å oppregulere proinflammatoriske og profibroseprogrammer.
Til slutt, fordi mange av liganden og målene identifisert i NicheNet-analysen er implisert i DKD, både i gnagermodeller og mennesker, ble datasettet sammenlignet med et enkelt kjerne-transkriptomisk datasett av tidlig menneskelig DKD.10 En spesifikk sammenligning ble gjort av differensielt uttrykte gener mellom menneskelige og musecelleklynger. Av de 138 differensielt uttrykte genene i humane DKD GEC-er, ble 25 gener også identifisert i mus iCTCFpod / endotelceller, inkludert Col4a1 (tilleggsfigur S7; tilleggstabell S11). Sammen antyder disse resultatene at endotelcelleprogrammer som ofte forstyrres i human DKD, delvis kan rekapituleres i musemodellen for tidlig glomerulær skade via selektiv podocyttablasjon. I tillegg tyder disse resultatene på at det, i tillegg til podocytter, kan være potensielle endotelspesifikke mål og terapeutiske strategier for å stoppe eller bremse progresjonen av komplekse og sterktutbredte nyresykdommer, som f.eksDKD.
