Natriumtiosulfat-supplert UW-løsning beskytter nyretransplantater mot langvarig kald iskemi-reperfusjonsskade i en murin modell av syngenisk nyretransplantasjon

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang et al

Cistanche tubulosa forhindrernyresykdom, klikk her for å fåprodukter og Cistanche Nz

ABSTRAKT

Introduksjon:Kald iskemi-reperfusjonsskade (IRI) er en uunngåelig hendelse som øker komplikasjoner etter transplantasjon. Vi har tidligere vist at tilskudd av University of Wisconsin (UW) løsning med ikke-FDA-godkjente hydrogensulfid (H2S) donormolekyler minimerer kald IRI og forbedrer nyretransplantatfunksjonen etter transplantasjon. Denne studien undersøker om et FDA-godkjent H2S-donormolekyl, natriumtiosulfat (STS), vil ha samme eller overlegne effekt i en klinisk relevant rottemodell av syngen ortotopisknyretransplantasjon.

Metode:Tretti Lewis-rotter gjennomgikk bilateral nefrektomi etterfulgt av syngen ortotopisk transplantasjon av venstrenyreetter 24-timers konservering i enten UW eller UW pluss STS-løsning ved 4 ◦C. Rotter ble overvåket til dag 14 etter transplantasjon og avlivet for å vurdere nyrefunksjonen (urinproduksjon, serumkreatinin og ureanitrogen i blodet).Nyreseksjoner ble farget med H&E, TUNEL, CD68 og myeloperoksidase (MPO) for å oppdage akutt tubulær nekrose (ATN), apoptose, makrofaginfiltrasjon og nøytrofilinfiltrasjon.

Resultat:UW pluss STS-transplantater viste signifikant forbedret graftfunksjon umiddelbart etter transplantasjon, med forbedret mottakeroverlevelse sammenlignet med UW-grafts (p < {0}}.05).="" histopatologisk="" undersøkelse="" avdekket="" signifikant="" redusert="" atn,="" apoptose,="" makrofager="" og="" nøytrofil="" infiltrasjon="" og="" nedregulering="" av="" pro-inflammatoriske="" og="" pro-apoptotiske="" gener="" i="" uw="" pluss="" sts="" graft="" sammenlignet="" med="" uw="" grafts="" (p=""><>

Konklusjon:Vi viser for første gang at konservering av nyretransplantater i STS-supplert UW-løsning beskytter mot langvarig kald IRI ved å undertrykke apoptotiske og inflammatoriske veier, og derved forbedre graftfunksjonen og forlenge mottakerens overlevelse. Dette kan representere en ny klinisk anvendelig terapeutisk strategi for å minimere det skadelige kliniske resultatet av langvarig kald IRI inyretransplantasjon.

Nøkkelord:Natriumtiosulfat (STS) Ischemi-reperfusjonsskade (IRI) Statisk kjølelagring (SCS)Nyretransplantasjon Overlevelse av transplantat og mottaker

1. Introduksjon

Nyretransplantasjon er den optimale behandlingen for sluttstadietnyrenyresykdom (ESRD). Sammenlignet med dialyse,nyretransplantasjon er overlegen, siden det gir bedre livskvalitet og gir en betydelig overlevelsesfordel sammen med kostnadseffektiviteten [1–3]. Imidlertid er anskaffelse av donors nyrer iboende assosiert med iskemi-reperfusjonsskade (IRI), en uunngåelig konsekvens av opphør og påfølgende gjenoppretting av blodstrøm under transplantasjon [4]. Den nåværende strategien for å redusere transplantasjonsindusert IRI er statisk kjølelagring (SCS) av nyretransplantater i standard konserveringsløsninger som University of Wisconsin (UW) løsning på isen ved 4 ◦C under pre-transplantasjonsperioden [5]. Imidlertid har forlenget SCS vist seg å være assosiert med økt celledød, betennelse og andre skadelige cellulære og molekylære hendelser, som til slutt resulterer i økt forekomst av forsinket graftfunksjon (DGF), akutt tubulær nekrose (ATN) og redusert graft overlevelse [6–10]. I tillegg, for å holde tritt med den globalt økende forekomsten av ESRD og et stadig økende antall pasienter på transplantasjonsventelister, aksepterer mange transplantasjonssentre nyretransplantasjoner med forlengede kalde iskemiske perioder, noe som ytterligere bidrar til generell vevsskade. Etter SCS er reperfusjon, når varmt oksygenert blod gjenopprettes i det kalde iskemiske transplantatet. Reperfusjon, som er effektorfasen av iskemisk skade, er preget av økt vevsskade [11–13].

En potensiell terapeutisk strategi for å begrense kald IRI undernyretransplantasjon innebærer tilskudd av standard konserveringsløsning med hydrogensulfid (H2S), en endogent produsert gasotransmitter som har vist seg å spille viktige fysiologiske roller i vasodilatasjon og cellulær signalering [14–16]. Vi har tidligere vist at forlenget SCS i H2S-supplert UW-løsning reduserer transplantasjonsindusert kald IRI og forbedrer transplantatoverlevelsen i murine modeller av syngen og allogen nyretransplantasjon [17–19,41, 42]. Imidlertid er H2S-donormolekylene som brukes i disse studiene ikke klinisk levedyktige. Dette har ført til vurderingen av å bruke natriumtiosulfat (STS), et H2S-donormedikament som er godkjent av Food and Drug Administration (FDA) for å behandle kalsifylakse hos ESRD-pasienter, cisplatinindusert toksisitet i kreftbehandling, og som en motgift mot cyanidforgiftning [20–23]. Nyere studier har vist at STS viser beskyttende effekter i dyremodeller av IRI [24–26]. Effekten på transplantasjonsindusert kald nyre-IRI er imidlertid ukjent. Derfor undersøker denne studien de renobeskyttende effektene av STS i en in vitro-modell av nyre-IRI og rottemodell for syngen ortotopisk nyretransplantasjon.

2. Materialer og metoder

2.1. Eksperimentell in vitro protokoll

En in vitro-modell av kald hypoksi og varm reoksygeneringsskade som etterligner cellulære forhold under in vivo kald IRI ble brukt for å vurdere de beskyttende effektene av STS under nyre IRI. Rottenyreepitelceller (NRK{{0}}E-cellelinje; ATCC, USA) ble brukt i in vitro-eksperimentene fordi disse cellene er mottakelige for iskemisk skade [27], og bruken av dem er i samsvar med rotte. transplantasjonsmodell brukt for det andre målet med denne studien. Cellene ble dyrket i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) inneholdende 10 prosent føtalt bovint serum (FBS) inaktivert ved varme ved 60 ◦C i 20 minutter og 1 prosent penicillin/streptomycin (P/S). Celler ble inkubert ved normale vekstforhold på 37◦C, 21 prosent O2 og 5 prosent CO2. Kontrollceller var under forhold identiske med de for pre-eksperimentelle celler. Eksperimentelle celler ble behandlet med enten serumfritt medium (SF), SF pluss 200 nM AP39 eller SF med varierende konsentrasjoner (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) natriumtiosulfatpentahydrat (STS), som ble oppnådd fra en 250 mg/ml injiserbar oppløsning av STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]). En konsentrasjon på 200 nM AP39 ble brukt fordi vi tidligere viste at AP39 ved denne konsentrasjonen er cytobeskyttende mot samme cellelinje i en lignende modell av kald IRI [20]. Celler ble deretter inkubert ved 10 ◦C i 24 timer under hypoksiske forhold (5 prosent CO2, 0,5 prosent O2, 95 prosent N2) i HypOxystation H85 hypoksikammer (HYPO2YGEN, USA) for å indusere kald iskemisk skade. En hypoterm temperatur på 10 ◦C ble brukt fordi dette var den laveste temperaturen som kunne oppnås teknologisk samtidig som et 0,5 prosent O2-nivå av hypoksi opprettholdes. Etter hypoksi ble mediet som inneholdt eksperimentelle celler erstattet med kontrollmedium, og cellene reoksygenert via inkubering under normale vekstforhold (37 ◦C, 21 prosent O2 og 5 prosent CO2) i 24 timer for å simulere reperfusjon og dens tilhørende skade. Etter 24 timers reoksygenering ble cellulær levedyktighet vurdert via farging av celler med FITC-konjugert Annexin-V (FITC-Annexin-V; BioLegend, USA) og 7-Aminoactinomycin D (7-AAD; BioLegend, USA ), som måler henholdsvis cellulær apoptose og nekrose. Celler ble analysert via flowcytometri ved bruk av CytoFLEX S (Beckman Coulter, USA). FlowJo versjon 11 (FlowJo LLC, USA) ble brukt for å tilpasse dataene for statistisk analyse.

2.2. Forsøksdyr

30 Lewis-hannrotter som veide 275–300 g og kjøpt fra Charles River (St. Constant, QC, Canada) ble holdt i Animal Care and Veterinary Services-anlegget ved Western University (London, ON) under standardforhold. Dyrestudier ble godkjent av Western University Council on Animal Care and Animal Use med en protokoll-ID 2018–155.

2.3. Nyretransplantasjonsmodell

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 prosent vekttap) eller død. Humane endepunkter ble kontrollert to ganger om dagen og alle rottene ble avlivet ved CO2-eksponering i et kammer med en strømningshastighet på 40 prosent. På tidspunktet for eutanasi var det ingen kirurgiske komplikasjoner som kunne ha resultert i variasjoner i resultatene.

2.4. Analyse av nyrefunksjon

Etter nyretransplantasjon ble rotter overvåket i metabolske bur i 14 dager og deretter avlivet. Blod- og urinprøver ble samlet på POD 3, 5, 7, 10 og 14 for å bestemme parametre for nyrefunksjon (serumkreatinin, blodurea-nitrogen [BUN], urinosmolalitet og urinproduksjon). BUN og serumkreatinin var fra nyretransplanterte og Sham-opererte rotter ble målt ved bruk av IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer-maskin (Markham, ON). Urinosmolalitetsnivåer ble bestemt ved frysepunktosmometri ved bruk av 3320 Osmometer-maskinen (Advanced Instruments, Norwood, MA) og sammenlignet med standarder fra selskapet.

2.5. Histopatologisk og morfometrisk analyse

Parafininnstøpt nyrevev ble kuttet i 4 µm tykke seksjoner og montert på mikroskopiske objektglass for histologi. Seksjonene ble farget med Hematoxylin og Eosin (H&E), Terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick-end-merking (TUNEL) for å bestemme graden av henholdsvis ATN og apoptose. H&E-seksjoner ble tildelt en poengsum for ATN av en blindet nyrepatolog i henhold til følgende skjema: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 prosent graft ATN. Nyreseksjoner ble også farget med følgende primære antistoffer: nyreskademarkør (KIM-1), makrofagoverflatemarkør CD68 og nøytrofilspesifikt enzym myeloperoksidase (MPO; Abcam®, Toronto, Canada) og visualisert med sekundære antistoffer og DAB-substratkromogen ved bruk av Dako Envision System (Dako, Glostrup, Danmark) i henhold til produsentens protokoll etterfulgt av analysert under Eclipse 90i digitalt lysmikroskop (Nikon® Instruments, New York) ved 10x forstørrelse og kvantifisert av ImageJ-programvare v. 1.8 (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

2.6. Kvantitativ PCR-analyse

Totalt RNA ble isolert fra nyretransplantasjonsvev oppnådd ved POD 3 ved bruk av RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Canada) og revers transkribert til cDNA ved bruk av OneScript® Plus cDNA-syntesesett (ABM, Canada) i forbindelse med oligo(dT)12– 18 primere i henhold til produsentens protokoll. Isolert RNA og cDNA ble analysert via nanodrop (DeNovix DS-11 Spectrophotometer, Canada) før bruk, med A260/280-vurderinger konsekvent henholdsvis > 1,95 og > 1,8. Reaksjonsblandingen til hver qPCR-prøve hadde et volum på 20 µL og ble laget i henhold til Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Canada)-protokollen og analysert ved bruk av CFX Connect Real-Time PCR Detection System-maskin (Bio-Rad, Canada) . Primersekvenser ble designet ved bruk av Primer-BLAST-programvare (NCBI) mot beta-aktin, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), interferon-gamma (IFN-), tumornekrosefaktor-alfa (TNF-), interleukin 6 (IL) -6), B-cellelymfom 2 (Bcl-2), Bcl-2--assosiert X-protein (BAX), caspase 3, BH3 interagerende domenedødsagonist (BID), c-jun. N-terminal kinase 1/2 (JNK1/2), Pparg koaktivator 1 alfa (PGC-1), mitokondriekompleks I (NDUFB8), mitokondriekompleks II (SDHB), mitogenaktivert proteinkinase 1/2 (ERK1 /2), gener for nøytrofil gelatinaselipokalin (NGAL) og nyreskademolekyl-1 (KIM-1). Alle gener av interesse ble normalisert mot beta-aktin. Foldeendringer av genuttrykk ble sammenlignet med Sham-opererte rotter og ble beregnet ved å bruke ΔΔCt-metoden.

2.7. Statistisk analyse

Alle statistiske analyser ble utført ved å bruke GraphPad (La Jolla, CA) Prism statistisk programvarepakke, versjon 9.0. Overlevelsesdata ble analysert ved bruk av Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og log rank test mens qPCR genekspresjonsdata ble analysert ved bruk av uparet enveis t-test. Alle andre data ble analysert ved å bruke enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys post-hoc test for å bestemme statistiske forskjeller mellom grupper. Statistisk signifikans ble akseptert på s<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Resultater

3.1. STS-supplerte serumfrie medier forbedrer overlevelse av renale tubulære epitelceller under kald hypoksi/reoksygenering

Flowcytometrianalyse etter farging for apoptose og nekrose viste at NRK{{0}}E-celler behandlet med SF under in vitro kald IRI viste signifikant redusert cellelevedyktighet sammenlignet med kontrollceller (normoksiske) (fig. 1A; p < 0.05).="" mens="" alle="" de="" eksperimentelle="" prøvene="" viste="" signifikant="" lavere="" renal="" tubulær="" epitelcellelevedyktighet="" enn="" celler="" dyrket="" under="" normoksiske="" forhold="" (p="">< 0.05),="" viste="" celler="" behandlet="" med="" sf="" supplert="" med="" 150="" µm="" og="" 500="" µm="" sts="" signifikant="" høyere="" levedyktighet="" enn="" de="" som="" ble="" behandlet="" med="" sf-medier="" alene="" (fig.="" 1a;="" p="">< 0,05),="" som="" tilsvarte="" markant="" redusert="" apoptose="" sammenlignet="" med="" celler="" behandlet="" med="" sf-medier="" alene="" (fig.="" 1b;="" p="">< 0,05).="" i="" tillegg="" ser="" økningen="" i="" cellelevedyktighet="" og="" reduksjon="" i="" apoptose="" ut="" til="" å="" nå="" optimale="" nivåer="" med="" 150="" µm="" og="" 500="" µm="" sts,="" ettersom="" en="" høyere="" dose="" reverserte="" disse="" trendene="" (fig.="" 1a="" og="">

3.2. Supplement av UW-løsning med STS forbedrer tidlig nyretransplantatoverlevelse og funksjon

Bevaring av nyretransplantater i STS-supplert UW-løsning forbedret mottakerens overlevelse signifikant med 83 prosent overlevelse til POD 14 (offerdag) sammenlignet med kontrollgruppen uten STS-tilskudd, som viste 12,5 prosent overlevelse, spesielt i de første 3 dagene (fig. 2A; p < 0.05).="" i="" tillegg="" forbedret="" sts-tilskudd="" markant="" graftfunksjonen="" i="" den="" tidlige="" posttransplantasjonsperioden="" sammenlignet="" med="" uw-behandling="" alene.="" serumkreatinin-="" og="" bun-nivåer="" var="" signifikant="" økt="" i="" både="" uw="" og="" uw="" pluss="" sts-grupper="" på="" pod="" 3,="" noe="" som="" korrelerte="" med="" redusert="" urinosmolalitet="" sammenlignet="" med="" sham="" (fig.="" 2b,="" c="" og="" 3a;="" p="">< 0.{{25="" }}5).="" serumkreatinin-="" og="" bun-nivåer="" i="" uw="" pluss="" sts-gruppen="" reduserte="" imidlertid="" signifikant="" på="" pod="" 3="" med="" en="" tilsvarende="" økning="" i="" urinosmolalitet="" sammenlignet="" med="" uw-gruppen="" (fig.="" 2b,="" c="" og="" 3a;="" p="">< 0,05).="" interessant="" nok="" sank="" nivåene="" av="" serumkreatinin="" og="" bun="" i="" uw="" pluss="" sts-gruppen="" jevnt="" fra="" pod="" 3="" til="" pod="" 14="" med="" økt="" urinosmolalitet="" og="" var="" sammenlignbare="" med="" de="" for="" sham="" (fig.="" 2b,="" c="" og="" 3a).="" dessuten="" var="" urinproduksjonen="" i="" uw="" pluss="" sts-gruppen="" signifikant="" høyere="" i="" løpet="" av="" de="" første="" fire="" postoperative="" dagene="" sammenlignet="" med="" uw-="" og="" sham-gruppene="" (fig.="" 3b;="" p="">< 0,05).="" imidlertid="" sank="" den="" jevnt="" mot="" baseline-verdien="" (sham)="" og="" var="" sammenlignbar="" med="" den="" for="" sham="" på="" pod="" 14,="" mens="" urinproduksjonen="" i="" den="" overlevende="" rotten="" i="" uw-gruppen="" forble="" høyere="" enn="" baseline-verdien="" på="" pod="" 14="" (fig.="">

3.3. Tilsetning av STS til UW-løsning reduserer transplantasjonsindusert celledød etter nyretransplantasjon

Nyreseksjoner oppnådd på POD 3 og 14 ble farget med TUNEL som et mål på apoptotisk celledød og skåret av en blindet nyrepatolog (fig. 4A). Nyretransplantater fra UW-gruppen viste signifikant høyere apoptotisk celledød på POD 3 som indikert av høyere TUNNEL-score sammenlignet med nyrer fra UW pluss STS- og Sham-grupper (fig. 5A og b; p < 0.{{11}="" }5).="" grafts="" fra="" uw="" plus="" sts-gruppen="" var="" ikke="" signifikant="" forskjellige="" sammenlignet="" med="" de="" fra="" sham="" på="" samme="" tidspunkt="" og="" ved="" pod="" 14="" (fig.="" 4b).="" i="" tillegg,="" mens="" transplantater="" fra="" både="" uw-="" og="" uw="" pluss="" sts-grupper="" viste="" signifikant="" økte="" atn-score="" på="" pod="" 3="" sammenlignet="" med="" sham-gruppen="" (fig.="" 5;="" p="">< 0.05),="" uw="" pluss="" sts-transplantater="" viste="" reduserte="" atn-skårer="" på="" pod="" 3="" sammenlignet="" med="" uw="" (fig.="" 5;="" p="">< 0,05).="" også,="" mens="" mottakere="" av="" uw-transplantater="" ikke="" overlevde="" til="" pod="" 14,="" og="" dermed="" deres="" atn-skåre="" ikke="" kunne="" bestemmes="" på="" pod="" 14,="" overlevde="" de="" av="" uw="" pluss="" sts-transplantater="" til="" pod="" 14,="" men="" viste="" signifikant="" økte="" atn-skårer="" sammenlignet="" med="" sham-gruppen="" (fig.="" 5;="" p=""><>

3.4. Nyretransplantater bevart i STS-supplert UW-løsning viste reduserte skademarkører og inflammatorisk infiltrat etter nyretransplantasjon

Nyreseksjoner oppnådd på POD 3 og 14 ble farget med KIM-1 for å oppdage proksimal tubulær skade samt CD68 (makrofagmarkør) og MPO (nøytrofilmarkør) og skåret av en blindet nyrepatolog (fig. 6A, 7A, og C). Nyrevevsekspresjon av KIM-1, CD68 og MPO var signifikant høyere i UW-gruppen på POD 3 sammenlignet med UW pluss STS- og Sham-gruppene (fig. 6B, 7B og D; p < {{11}="" }.05)="" mens="" uttrykk="" for="" disse="" markørene="" i="" uw="" pluss="" sts-transplantater="" ikke="" var="" signifikant="" forskjellig="" sammenlignet="" med="" sham="" på="" pod="" 14="" (fig.="" 6b,="" 7b="" og="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. STS-supplement til UW-løsning undertrykte nyreekspresjon av pro-inflammatoriske, pro-apoptotiske og mitokondrielle gener

Genekspresjon av pro-inflammatoriske, pro-apoptotiske, mitokondrie-målrettede og nyreskademarkører ble bestemt via qRT-PCR i transplanterte nyrer oppnådd på POD 3. Uttrykk av de pro-inflammatoriske genene IFN-, TNF- og IL{{8 }} ble markert økt i UW-transplantater i forhold til UW pluss STS-transplantater på POD 3 (fig. 8A; p < 0.05)="" og="" fulgte="" det="" samme="" mønsteret="" med="" pro-apoptotiske="" gener="" parp,="" bax="" ,="" kaspaser-3,="" bid,="" jnk1="" og="" jnk2="" (fig.="" 8a;="" p="">< 0.05)="" mens="" uttrykk="" for="" anti-apoptotisk="" bcl-2="" var="" litt="" økt="" i="" uw="" pluss="" sts-gruppen="" sammenlignet="" med="" uw-gruppen,="" selv="" om="" denne="" økningen="" ikke="" nådde="" statistisk="" signifikans="" (fig.="" 8a).="" i="" tillegg="" ble="" ekspresjonen="" av="" mitokondrielle="" gener="" pgc-1,="" ndufb8="" (kompleks="" i)="" og="" sdhb="" (kompleks="" ii)="" i="" uw-transplantater="" signifikant="" redusert="" sammenlignet="" med="" uw="" pluss="" sts-transplantater="" (fig.="" 8b;="" p="">< 0="" .05)="" mens="" det="" motsatte="" ble="" observert="" med="" erk1-="" og="" erk2-uttrykk="" (fig.="" 8b;="" p="">< 0,05).="" videre="" var="" kim-1-genekspresjonen="" i="" uw-transplantater="" signifikant="" økt="" sammenlignet="" med="" uw="" pluss="" sts-transplantater="" (fig.="" 8c;="" p="">< 0,05),="" mens="" redusert="" ngal-ekspresjon="" i="" uw="" pluss="" sts-transplantater="" ikke="" nådde="" statistisk="" signifikans="" sammenlignet="" med="" det="" i="" uw-transplantater="" (fig.="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Diskusjon

Denne studien etablerer tilskudd av standard konserveringsløsning med STS, en klinisk levedyktig FDA-godkjent H2S-donor, for å redusere transplantasjonsindusert kald nyre-IRI, forbedre graftkvaliteten og forlenge mottakerens overlevelse. Ved å bruke en in vitro-modell av nyre-IRI og rottemodell for syngen ortotopisk nyretransplantasjon, demonstrerer vi for første gang at tilskudd av UW-løsning med STS under langvarig SCS er til- og organbeskyttende.

Det primære funnet i vår in vitro-modell er at STS-tilskudd til serumfrie medier beskytter nyreepitelceller fra kald hypoksi og varm reoksygeneringsindusert apoptose og øker levedyktigheten, noe som er i samsvar med vår tidligere studie der vi viste de beskyttende effektene av mitokondriene. -målrettet H2S-donormedikament, AP39, i en in vitro-modell av kald nyre-IRI [20]. Interessant nok reverserte en høyere STS-konsentrasjon på 1 mM de gunstige effektene, noe som antyder at STS viser et bifasisk dose-responsfenomen referert til som hormesis, der en lavere konsentrasjon er cytobeskyttende mens en høyere konsentrasjon er cytotoksisk. Mitokondriell skade er en viktig konsekvens av renal IRI, da mitokondriell permeabilitet kan hemme adenosintrifosfat (ATP) produksjon og øke dannelsen av reaktive oksygenarter (ROS), en destruktiv mediator av vevsskade [13]. Det har nylig blitt antydet at mitokondrier er et primært sted for STS-aktivitet. Ikke bare er STS kjent for å generere H2S i mitokondriene via glutationavhengig reduksjon og vice versa gjennom sulfidoksidasjonsvei, men bevarer også mitokondriell ATP-syntese, reduserer ROS-produksjon og forbedrer komplekse enzymaktiviteter i elektrontransportkjeden (ETC) [24 ,28–30]. I tillegg viste nyere studier at STS betydelig økte ekspresjonen av PGC-1, en positiv regulator av mitokondriell biogenese og ATP-produksjon [26], som er i samsvar med vår in vivo-observasjon. Disse molekylære mekanismene kan forklare det betydelig økte uttrykket av mitokondrielle ETC-komplekser I og II (henholdsvis NDUFB8 og SDHB) i vår nyretransplantasjonsmodell med økt overlevelse og funksjon som observert i nyretransplantater bevart i STS-supplert UW-løsning.

Basert på våre in vitro-resultater bestemte vi oss for å undersøke om den beskyttende effekten av STS er anvendelig in vivo ved bruk av en transplantasjonsmodell der kald IRI er en viktig bidragsyter til graftdysfunksjon og økte post-transplantasjonskomplikasjoner. Våre funn viser at forlenget (24 timer) SCS av nyretransplantater i STS-supplert UW-løsning signifikant forbedrer graftkvaliteten og funksjonen preget av reduserte serumkreatinin- og BUN-nivåer, høyere urinproduksjon og forlenget mottakeroverlevelse sammenlignet med grafts konservert i UW-løsning alene . Det er viktig å merke seg at umiddelbar urinproduksjon selv etter klinisk nyretransplantasjon er et kritisk resultat som avgjør om dialyse er nødvendig for å adressere forsinket graftfunksjon (DGF). Derfor er vår observasjon at STS øker urinproduksjonen umiddelbart etter transplantasjon og er sammenlignbar med Sham-gruppen på POD 14 et lovende funn. Den observerte forbedringen i nyrefunksjonen etter transplantasjon av grafts bevart i STS-supplert UW-løsning ga også en betydelig overlevelsesfordel. Kvantitativt forlenget STS-tilskudd levetiden til transplantatet slik at 83 prosent (5/6) av rottene som fikk UW pluss STS-transplantater overlevde til POD 14 (ofringsdagen) sammenlignet med bare 12,5 prosent (1/8) av mottakerrottene av grafts konservert i UW-løsning uten STS-tilskudd. Dette funnet fra denne studien stemmer også overens med vår forrige studie, der bare 14 prosent (1 av 7) av mottakerrottene av transplantater ble bevart i UW-løsning i 24 timer uten H2S (GYY4137)-tilskudd, overlevde til POD 14 [20] .

I tillegg til å vise forbedring i nyrefunksjonsparametere, hemmet STS-tilskudd også nyretransplantatapoptose og inflammasjon ved å nedregulere vevsekspresjon av pro-apoptotiske og pro-inflammatoriske gener samtidig som anti-apoptotiske gener og reduserte CD68-positive makrofager og MPO-positive nøytrofiler, som totalt resulterte i redusert KIM-1-ekspresjon og ATN og til slutt bevarte nyremorfologi. Disse inflammatoriske cytokinene er kjent for å være mediatorer av celledød under kald IRI [31], og deres reduksjon i UW pluss STS-transplantater er sannsynligvis på grunn av de velkjente egenskapene til STS for å redusere endotelpermeabiliteten i vaskulært endotelialt monolag, svekke cytokinproduksjonen , og fremkalle produksjon av antiinflammatoriske cytokiner [32]. Funnet vårt om at STS-tilskudd til UW-løsning nedregulerer uttrykket av pro-inflammatoriske gener, samsvarer med det fra en tidligere studie på den anti-inflammatoriske aktiviteten til STS ved å redusere nivåene av TNF- og IL-6 i nevrologiske sykdommer [33 ,34]. Mekanistisk inaktiverer STS kaspase-3 ved å feste seg til det aktive stedet via sterke hydrogenbindinger og dermed forhindre tilgang av naturlig substrat til det aktive stedet, og til slutt stopper apoptose [35]. STS blokkerer også aktiveringen av JNK, et protein som spiller en kritisk rolle i apoptotisk signalering [35], noe som støtter vårt funn om den nedregulerende effekten av STS på caspase3 og JNK. Imidlertid er vi ikke i stand til å avgjøre om slike mekanismer er operative i denne studien siden vi ikke utførte ytterligere eksperimenter for å utforske disse molekylære mekanismene.

En stor begrensning ved vårt in vitro-eksperiment er vår tekniske utfordring med å bruke dagens standard konserveringstemperatur 4 ◦C [36], ettersom de 10 ◦C vi brukte var den laveste temperaturen som kunne oppnås teknologisk uten å sette det hypoksiske miljøet i fare. Dette er en reell forskjell med hensyn til cellulære fysiologiske prosesser og også i konserveringsteknikker. En mulig løsning er å bruke kjemisk indusert hypoksi i en plastpose og plassere den i et 4 ◦C kjøleskap for å gjenspeile de kliniske innstillingene for SCS. Imidlertid ble disse posene for generering av anaerobe atmosfære designet for å brukes ved varme temperaturer (21–37 ◦C) siden de kjemiske forbindelsene som induserer det hypoksiske miljøet fungerer under den tilstanden. Fremtidige studier bør ta sikte på å optimalisere temperaturen i hypoksikammeret for å etterligne kliniske SCS-innstillinger. Å oppnå en konsistent temperatur på 4 ◦C uten å kompromittere et hypoksisk miljø vil tillate oss å bestemme om de observerte fenotypene i den eksperimentelle in vitro kalde IRI-modellen er konsekvent uttrykt. Bortsett fra in vitro-eksperimentet, er vår rottetransplantasjonsmodell heller ikke uten ulempe. Vi utførte syngen nyretransplantasjon (genetisk identiske givere og mottakere med immunologisk kompatibilitet), som kun gjelder for identiske tvillinger ved klinisk nyretransplantasjon, mens de fleste kliniske nyretransplantasjoner er allogene (genetisk forskjellige givere og mottakere). Den allogene transplantasjonen tvinger transplantasjonsmottakere til å gjennomgå immunologiske tester før transplantasjon for å identifisere donorens humane leukocyttantigener (HLA; molekyler som induserer og regulerer immunrespons), bestemme immunologisk kompatibilitet mellom givere og mottakere, og unngå organavstøtning [37,38]. Fremtidige studier som bruker STS bør vurdere allogen transplantasjon. En annen begrensningsnyretransplantasjonsmodell er det faktum at vi fokuserte på levende givere, sub-optimale transplantater fra donasjon etter hjertedød (DCD)-givere blir stadig mer vanlig som en kilde til donorens nyrer i mange transplantasjonssentre globalt [39]. DCD utsetter donororganer for ulike perioder med varm iskemi i tillegg til kalde iskemiske tider under SCS, og er assosiert med økte forekomster av DGF og redusert graftoverlevelse sammenlignet med levende givere [40]. Derfor bør fremtidige studier vurdere DCD-nyretransplantasjonsmodellen for å vurdere effekten av STS mot IRI i denne modellen.

Som konklusjon viser vår studie at tilskudd av standard konserveringsløsning med et klinisk levedyktig H2S-donormedikament under forlenget SCS av nyretransplantater beskytter mot transplantasjonsindusert kald nyre-IRI, forbedrer den generelle graftkvaliteten og graftfunksjonen og forlenger transplantatmottakerens overlevelse. Tatt i betraktning at risikoen for DGF øker med forlenget kald iskemisk tid ved klinisk nyretransplantasjon, noe som reiser en stor klinisk bekymring, gir observasjonen om at STS beskytter nyretransplantasjoner under langvarig SCS og forhindrer DGF etter transplantasjon et stort klinisk løfte som kan redusere eller forhindre forekomst av DGF i klinisk nyretransplantasjon i nær fremtid. Dermed kan den fremtidige fordelen ved å legge STS til bevaringsløsninger presentere en potensiell løsning på dette pågående problemet. Samlet sett legger denne studien til den voksende mengden av litteratur som støtter de cytobeskyttende effektene av STS og andre H2S-donorer mot organ IRI, spesielt forbedrer graftresultater i transplantasjonsindusert kald nyre-IRI. Disse strategiene kan lette bruken av flere transplantater som er utsatt for forlengede kalde iskemiske tider, noe som kan øke mengden av transplanterbare organer.

CRediT forfatterbidragserklæring

Alle forfattere har samtykket til innsending av dette manuskriptet. Det er ingen interessekonflikt.

Referanser

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford, et al., Sammenligning av dødelighet hos alle pasienter på dialyse, pasienter på dialyse som venter på transplantasjon, og mottakere av en første kadaverisk transplantasjon, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, et al., Systematisk oversikt: nyretransplantasjon sammenlignet med dialyse i klinisk relevante utfall, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, et al., Cost-effectiveness of kidney transplantation from DCD in Italy, Transplant. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischemi-reperfusjonsskade, Eur. J. Trauma Emerg. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Orgelbevaring: nåværende konsepter og nye strategier for det neste tiåret, Transfus. Med. Hemother. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Cold ischemia and the redusert long-term survival of cadaveric renal allografts, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo, et al., Store effekter av forsinket graftfunksjon og kald iskemitid på nyreallograftoverlevelse, Nephrol. Slå. Transplantasjon. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Impact of cold ischemi time on graft survival among ECD transplant recipients: a paired kidney analysis, Am. J. Transplant. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Mottakerrisikofaktorer forbundet med forsinket graftfunksjon: en paret nyreanalyse, Transplantation 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay, et al., Hver ekstra time med kald iskemi øker signifikant risikoen for graftsvikt og dødelighet etter nyretransplantasjon, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Mitochondria-målrettede antioksidanter: fremtidsperspektiver i nyreiskemi-reperfusjonsskade, Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Oksidativt stress forårsaket av mitokondriell kalsiumoverbelastning, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, The role of mitochondria in ischemi/reperfusion injury, Transplantation 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Emerging role of gasotransmitters in renal transplantation, Am. J. Transplant. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Hydrogen sulfide and cell signaling: lagspiller eller dommer? Plant Physiol. Biochem. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, The vasorelaksant effect of H(2)S as a novel endogenous gasseous K(ATP) channel opener, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, et al., Hydrogensulfidbehandling reduserer nyreallograft-iskemi-reperfusjonsskade under kjølelagring og forbedrer tidlig transplantert nyrefunksjon og overlevelse etter allogen nyretransplantasjon, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Supplerende hydrogensulfid beskytter transplantert nyrefunksjon og forlenger mottakerens overlevelse etter langvarig kaldiskemi-reperfusjonsskade ved å dempe nyretransplantatapoptose og betennelse, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, et al., Hydrogen Sulfide beskytter nyretransplantater mot langvarig kaldiskemi-reperfusjonsskade via spesifikke mitokondrielle handlinger, Am. J. Transplant. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Sodium thiosulfate for acute cyanide poisoning: a study in a rat model, Ann. Pharm. Fr. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri, et al., Sodium thiosulfate beskytter mot nedsatt nyrefunksjon etter hypertermisk intraperitoneal kjemoterapi (HIPEC) med Cisplatin, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.