Galectin-3 har anti-nekroptotisk og anti-apoptotisk effekt ved cisplatin-indusert akutt tubulær nekrose

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Suhail Al-Salama et al

Cistanche tubulosa dosering for nyresykdom, klikk her for å få prøven

Abstrakt

Bakgrunn/mål:Akuttnyreskade (AKI) er en folkehelsebelastning med økt sykelighet, dødelighet og helsekostnader. Det er assosiert med økt risiko for utvikling av kroniskenyresykdom og død. Akutt tubulær nekrose (ATN) er den vanligste årsaken til AKI. Apoptose og vevsnekrose spiller en viktig rolle i ATN. Galectin 3 (GAL-3), et beta-galaktosidbindende lektin, er kjent for å ha en rolle i betennelse, apoptose og oksidativt stress, men dets rolle i cisplatin-indusert akutt tubulær nekrose er ikke klart belyst.

Metoder:Hann C57B6-J og C57BL-6 –GAL-3 knock-out mus ble brukt til å indusere ATN ved å bruke en cisplatin musemodell av akutt tubulær nekrose. GAL-3-ekspresjon, apoptotiske, nekrotiske og nekroptotiske proteiner inyrerble målt ved bruk av standard histologiske, immunhistokjemiske og enzymkoblede immunosorbentanalyseteknikker. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SE Statistisk signifikante forskjeller (s<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

Resultater:Det var en betydelig økning i GAL-3 inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med kontrollmusene. I tillegg var det signifikant høyere prosentandeler av ATN, høyere nivåer av plasmaurea og kreatinin, og høyere nivåer av cathepsin B og cathepsin D, inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3 villmus. På samme måte var det betydelig høyere nivåer av nekroptoseproteiner RIPK1, RIPK3 og MLKL inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3 villmus. Dessuten var det betydelig høyere nivåer avnyrepro-apoptotiske proteiner; spaltet caspase-3, spaltet PARP, TRAIL og FAS i cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus sammenlignet med cisplatin-behandlede GAL-3 villmus.

Konklusjon:GAL-3 kan påvirke celleoverlevelse og -død gjennom sin interaksjon med nekroptotiske, apoptotiske og pro-overlevelsesproteiner i nyretubuli under cisplatinindusert akutt tubulær nekrose.

Stikkord: Nyre• Akutt tubulær nekrose • Cisplatin • Galektin-3 • Nekroptose • Apoptose

Introduksjon

Akuttnyreskade (AKI) er preget av en brå reduksjon inyrefunksjon basert på økt serumkreatininnivå, reduksjon i urinproduksjon, behov for nyreerstatningsterapi eller en kombinasjon av disse faktorene [1].

DeNyreDisease Improving Global Outcome (KDIGO) klinisk praksis for AKI, definerer AKI som enten en økning i serumkreatinin med mer enn eller lik 0,3 mg/dl (større enn eller lik 26,5 µmol/l) innen 48 timer; eller en økning i serumkreatinin til mer enn eller lik 1,5 ganger baseline, som er kjent eller antatt å ha skjedd innen de siste 7 dagene; eller urinvolum<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

Akutt tubulær nekrose (ATN) er en vanlig årsak til AKI [3]. Iskemiske og nefrotoksiske lovbrudd er hovedårsakene til ATN [3]. Til tross for omfattende studier på ATN, som inkluderer celleskade, celledød og regenerering, er de underliggende mekanismene ikke klart definert.

Apoptose er en form for programmert celledød mediert av caspaser. Betydelige rapporter har vist at apoptose spiller en viktig rolle i ATN [3, 4]. På den annen side er nekrose en form for celledød preget av tidlig plasmamembranpermeabilisering, organellhevelse og desintegrasjon av celleinnhold [5]. Nekrose oppstår ofte når cellene blir utfordret med overdreven ytre stress. Nekrose har tradisjonelt blitt sett på som passiv og uprogrammert; derfor hadde svært få anstrengelser blitt gjort for å undersøke mekanismen for nekrose, til tross for dens utbredelse i menneskelige sykdommer [5]. En velkjent type nekrose er nekroptose [5]. Nekroptose er en programmert ikke-apoptotisk celledød indusert av en rekke ekstracellulære stimuli, slik som tumornekrosefaktor (TNF) [5]. Det ble opprinnelig definert som celledød preget av nekrotisk celledødsmorfologi med samtidig aktivering av reseptorinteragerende serin/treonin-proteinkinase 1 (RIPK1). RIPK1 aktiverer reseptorinteragerende serin/treonin-proteinkinase 3 (RIPK3) for å danne et kompleks som kalles nekrosom [6]. Senere får den aktiverte RIPK3 evnen til å fosforylere og aktivere blandet kinasedomene-lignende (MLKL) [6]. Fosforylerte MLKL-molekyler er i stand til å danne oligomerer for å lette deres translokasjon til cellemembranen gjennom binding til fosfatidylinositollipider og kardiolipin. De translokerte MLKL-oligomerene fungerer som kanaler i cellemembranen for å indusere enten tilstrømning av natrium og utstrømning av kaliumioner [7] eller alternativt en tilstrømning av kalsiumioner [8]. På begge måter vil dette føre til nekrotisk celledød gjennom plasmamembranpermeabilisering og ruptur, noe som fører til søl av det intracellulære innholdet inn i organet.

I dette prosjektet har vi brukt cisplatin (Cis) for å indusere akutt tubulær nekrose. Cis har et bredt spekter av antitumoreffekter og har blitt brukt til å behandle ulike ondartede svulster [9]. Ikke desto mindre er nefrotoksisitet den viktigste bivirkningen og er preget av nyretubulær cellenekrose, vevsskade, nedsatt nyrefunksjon og akutt.nyrefeil [10]. Til tross for ulike tiltak som er iverksatt for å overvinne nyreskade, er nesten 4–23 prosent av pasientene rammet av AKI [11]. De kjente mekanismene for cisplatin-indusert nyreskade inkluderer apoptose, oksidativt stress og inflammatorisk respons på grunn av direkte skade på renale tubulære epitelceller og nyrekar [12].

Galectin-3 (GAL-3), 35 kDa protein, er et unikt kimærlignende som har ett C-terminalt karbohydratgjenkjenningsdomene (CRD) koblet til et langt N-terminalt domene (ND) [13 ].GAL-3 finnes på celleoverflaten, cytoplasmaet og cellekjernen samt i den ekstracellulære matrisen [13].

Intracellulær GAL-3 har vært involvert i celleproliferasjon og anti-apoptotiske mekanismer [14, 15]. Det påvirker K-Ras- og Akt-proteiner og regulerer dermed også differensieringsoverlevelse og død [14, 15]. Mens ekstracellulær GAL-3 medierer celle-celleadhesjon, celle-matrise-interaksjon og signalering, betennelse og apoptose [16].

GAL-3 har vist seg å translokere enten fra cytosolen eller fra kjernen til mitokondriene etter eksponering for apoptotiske stimuli og å blokkere endringer i mitokondriemembranpotensialet, og dermed forhindre apoptose [17]. Studier har også vist at GAL-3 kan hemme TNF-indusert apoptose gjennom aktivering av AKT [18]. Andre studier har vist at GAL-3 og Beclin1 er involvert i to koordinerte veier for programmert celledød, apoptose og autofagi [18]. I dette prosjektet antar vi at GAL-3 har en beskyttende rolle på det renale tubulære epitelet ved akutt tubulær skade. Vi har brukt en murin modell av akutt tubulær skade for å undersøke den beskyttende rollen til GAL-3 i cisplatinindusert akutt tubulær skade gjennom måling av nyrefunksjoner (plasmaurea og kreatinin),nyrenekroptoseproteiner (RIP-1, RIP-3 og MLKL), nekroseproteiner (Cathepsin D og Cathepsin B), apoptoseproteiner (spaltet Caspase-3, spaltet PARP, TRAIL og FAS) , og celleoverlevelsesmarkører (p-NF-KB, beta-catenin og Wnt), ved bruk av standard enzymkoblet immunosorbentanalyse, biokjemisk analysator, histologiske og immunhistokjemiske prosedyrer.

Materialer og metoder

Vi har brukt en mus eksperimentell modell av akuttnyreskade som er omfattende beskrevet i litteraturen og brukt til å studere akuttnyreskade i laboratorier over hele verden [19].

Musemodell av akutt tubulær nekrose

C57BL/6 og C57BL/6 –GAL-3 knock-out (KO) mus som veide 25-30 g ble brukt. Mus ble holdt på en standard diett. Mus ble holdt fem per bur under en 12-t lys og mørk tidsplan i minst 1 uke før Cisplatin-administrasjon.

Cisplatin (EBEWE Pharma GmbH Nfg. KG, Unterach, ØSTERRIKE) ble fersk brukt på administrasjonsdagen i en konsentrasjon på 0,5 mg/ml. Musene fikk enten 30 mg/kg kroppsvekt cisplatin [11] eller bærer (normalt saltvann) intraperitonealt (IP), hvoretter musene igjen hadde fri tilgang til mat og vann. Dødshjelpsmetoden startet med en intraperitoneal injeksjon av anestesimidler, som inkluderte en kombinasjon av ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg), deretter ble nyrene fjernet og blodprøver ble tatt 96 timer etter cisplatinadministrasjon. Blod ble samlet i EDTA-vakutainere.Nyrerble deretter resektert, vasket i iskald fosfatbufret saltvann (PBS), den ene halvdelen av hver nyre ble umiddelbart frosset ned i flytende nitrogen og senere lagret i en -80 graders fryser. Den andre halvparten ble umiddelbart fikset i 10 prosent bufret formell saltvann i 24 timer. Oppsamlet blod ble sentrifugert ved 3000 RPM i 15 minutter. Plasmaet ble samlet opp, alikvotert og lagret ved -80 grader inntil videre analyse.

Prøvebehandling for proteinekstraksjon

Totalt protein ble ekstrahert franyreprøver ved homogenisering med lyseringsbuffer og oppsamling av supernatanten etter sentrifugering. For totalt cellelysat ble nyreprøvene tint, veid og lagt i kald lyseringsbuffer som inneholdt 5{{20}} mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mM EDTA, 20 mM -glyserofosfat, 25 mM NaF, 1 prosent Triton X-100, 10 prosent vekt/volum glyserol og proteasehemmertablett (Roche komplett proteasehemmer cocktailtabletter). Nyrene ble homogenisert på is med en homogenisator (IKA T25 Ultra Turrax). Prøvene ble deretter sentrifugert ved 14000 RPM i 15 minutter ved 4 grader, supernatanten ble samlet opp, alikvotert og lagret ved -80 grader inntil videre analyse. Kjernefysisk og cytoplasmatisk proteinekstraksjon ble utført etter protokollen beskrevet andre steder [19]. Kort fortalt ble nyreprøvene tint på is, veid og homogenisert på is med buffer inneholdende Tris HCl 10 mmol/l, CaCl2 3 mmol/l, MgCl2 2 mmol/l, EDTA 0,1 mmol/l , Fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) 0,5 mmol/l, sukrose 0,32 mmol/l, ditiotreitol (DTT) 1 mmol/l, Nonidet P-40 (NP-40) 0,5 prosent og proteasehemmercocktail 1 prosent. Homogenatene ble sentrifugert ved 800 RPM i 10 minutter. Supernatanten ble fjernet og holdt som cytoplasmatiske fraksjoner. Pelleten ble vasket to ganger med homogeniseringsbuffer uten NP-40 og resuspendert med en buffer med lavt saltinnhold inneholdende HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 20 mmol/l, EDTA 0,2 mmol /l. Glyserol 25 prosent, PMSF 0,5 mmol/l og DTT 0,5 mmol/l. Etter inkubering på is i 5 minutter, et likt volum høysaltbuffer inneholdende HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 800 mmol/l, EDTA 0,2 mmol/l. Glyserol 25 prosent, PMSF 0,5 mmol/l, DTT 0,5 mmol/l, NP-40 1 prosent og proteasehemmercocktail 1 prosent, ble tilsatt, blandingen ble inkubert på is i 30 minutter, sentrifugert ved 14000 RPM i 15 minutter ved 4 grader, og supernatanter ble lagret som kjernefraksjonen. Total proteinkonsentrasjon ble bestemt ved BCA-proteinanalysemetoden (Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit).

Prøvebehandling for histologi

Nyrene ble skåret ut, vasket med iskald PBS og veid. Hvernyreble delt i to halvdeler, og hver halvdel var en kassett og fiksert direkte i 10 prosent bufret formalin. Seksjoner ble dehydrert i økende konsentrasjoner av etanol, renset med xylen og innstøpt med parafin. Tre-µm seksjoner ble fremstilt fra parafinblokker og farget med hematoxylin og eosin og periodic acid Schiff (PAS)-farger ved bruk av standardprosedyrer [20]. De fargede snittene ble evaluert av histopatologen som deltok i dette prosjektet.

Immunhistokjemi

Fem-um seksjoner ble avparafinisert med xylen og rehydrert med gradert alkohol. Snitt ble deretter plassert i gjenvinningsløsning med høy pH (pH 9) i vannbad ved 95oC i 20 minutter. Seksjoner ble deretter vasket med destillert vann i 5 minutter etterfulgt av TBST-buffer i 5 minutter. Seksjoner ble deretter behandlet med peroksidaseblokk i 10 minutter etterfulgt av proteinblokk i 10 minutter. Seksjoner ble deretter inkubert i én time ved romtemperatur med anti-spaltet caspase-3-antistoff (Rabbit Polyclonal, 1:300, Cell signaling technology, Danvers, MA USA), anti-spaltet PARP-antistoff (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Cellesignaleringsteknologi, Danvers, MA, USA), anti-beta-catenin antistoff (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-fosfo-NF-κB antistoff (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Wnt-3 (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal,1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 (kanin polyklonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og anti-MLKL 1 (kanin monoklonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) . Etter konjugering med primære antistoffer ble seksjoner inkubert med sekundært antistoff (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, USA) i 20 minutter ved romtemperatur etterfulgt av tilsetning av DAB-kromogen (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, Santa Clara, CA, USA) og motfarging ble utført med hematoksylin. Passende positive kontroller ble brukt. For negativ kontroll ble det primære antistoffet ikke lagt til seksjoner. Positive og negative kontroller ble brukt i hver batch av fargede objektglass (ikke vist i figurene).

Immunfluorescerende merking

Fem-μm seksjoner ble avparafinisert med xylen og rehydrert med gradert alkohol. Snitt ble plassert i Retrieval Solution med høy pH (pH 9) i vannbad ved 95 grader i 20 minutter. Seksjoner ble deretter vasket med destillert vann i 5 minutter etterfulgt av TBST-buffer i 5 minutter. Seksjoner ble deretter inkubert med anti-GAL-3 antistoff (Rabbit Polyclonal, 1:50, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 1 (kanin polyklonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og anti-MLKL 1 (kanin monoklonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) over natten ved romtemperatur. Seksjoner ble deretter inkubert med esel-anti-kanin Alexa Fluor 488, (Jackson Immune Research Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA, 1:100) antistoff. Til slutt ble seksjoner montert i DAPI-vannløselige monteringsmedier (Abcam, Cambridge, MA, USA) og sett med et Olympus fluorescerende mikroskop. Passende positive kontrollseksjoner ble brukt. For negativ kontroll ble det primære antistoffet ikke tilsatt til seksjoner og hele prosedyren ble utført på samme måte som nevnt ovenfor. Positive og negative kontroller ble brukt i hver batch av fargede objektglass (ikke vist i figurene).

Morfometrisk analyse

Morfometrisk analyse av akutt tubulær nekrose ble utført av to etterforskere som deltok i denne studien. Morfometrisk analyse av spaltet caspase-3, spaltet PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, phospho-NFK-B, Wnt-3, Beta-Catenin, uttrykk i renale tubulære celler ble gjort ved hjelp av ImageJ-programvare (http: //rsbweb.nih.gov/ij/). Spaltet caspase-3, spaltet PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, phospho-NFK-B, Wnt-3, Beta-Catenin, merking ble bestemt ved å telle antall positive celler i tilfeldig valgt høy effekt felt (HPF) i nyrene. Gjennomsnittlig antall positive celler konverteres fra per HPF til per mm2 (hver mm2= 4HPF). For, spaltet caspase-3, spaltet PARP, RIPK1, RIPK3 og Wnt-3, merking, ble celler vurdert

positiv når det var et cytoplasmatisk fargemønster. For MLKL-merking ble celler ansett som positive når det var et membranøst og cytoplasmatisk fargemønster. For fosfo-NFK-B og Beta-Catenin, merking, ble celler ansett som positive når det var et kjernefysisk fargingsmønster.

Enzym-linked immunosorbent assay

Nyrekonsentrasjoner av GAL-3, Cathepsin D, Cathepsin B, Cleaved caspase-3, TRAIL og FAS ble bestemt ved bruk av DuoSet enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) Development Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) ) for sandwich ELISA, ved å bruke standard prosedyre i henhold til produsentens instruksjoner. Nyrespaltede PARP-konsentrasjoner ble bestemt ved bruk av cellesignalteknologi Elisa-sett (Danvers, MA, USA) for sandwich Elisa, ved bruk av standardprosedyre i henhold til produsentens instruksjoner. Nyre-RIPK1-, RIPK3- og MLKL-konsentrasjoner ble bestemt ved bruk av MyBioSource (San Diego, CA, USA) Elisa-sett for sandwich Elisa, ved bruk av standardprosedyre i henhold til produsentens instruksjoner. Absorbansavlesninger ble gjort ved 450 nm, ved bruk av et 96-brønnplatespektrofotometer (BioTek ELx800 mikroplate Elisa-leser, Winooski, VT, USA). Konsentrasjoner av GAL-3, Cathepsin D, Cathepsin B, spaltet caspase-3, TRAIL, RIPK1, RIPK3, MLKL, spaltet PARP og FAS i nyreprøver ble bestemt ved interpolasjon fra en standardkurve. Nivåene ble normalisert til totale proteinkonsentrasjoner.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser ble gjort med Graph Pad Prism Software versjon 5. Flere sammenligninger mellom de ulike gruppene ble oppnådd ved enveis variansanalyse (ANOVA), etterfulgt av Newman Keuls post hoc multiple range-tester. Sammenligninger mellom to grupper ble oppnådd ved Student t-test. Data presenteres i gjennomsnitt ± standardfeil (SE). P-verdier < 0.05="" anses="" som="">

Resultater

Cisplatin-indusert akutt tubulær nekrose

Den cisplatinbehandlede GAL-3 villgruppen viser ATN som involverer (67,29 prosent ± 2,392) av nyreparenkym (fig. 1) med tap av børstekanter, hevelse av tubulære celler, intratubulære fallende celler, intratubulære sekresjoner og mitose ( Fig. 2B og 3B).

Den cisplatinbehandlede GAL-3 KO-gruppen viser ATN som involverer (78,54 prosent ± 0.8120) av nyreparenkym (fig. 1) med tap av børstekanter, hevelse av tubulære celler, intratubulære fallende celler, intratubulære sekresjoner, og mitose (fig. 2D & 3D).

Det er en betydelig høyere prosentandel av ATN inyreri cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3 villmus (P<0.002) (fig.="">

GAL-3 uttrykkes i akutt tubulær nekrose

Det er en betydelig økning i den cytoplasmatiske fraksjonskonsentrasjonen av GAL-3 inyreri den cisplatinbehandlede GAL-3 villgruppen (6084 ± 587,3 pg/mg) sammenlignet med GAL-3 villkontrollgruppen (1620 ± 62,3 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">nyreri den cisplatinbehandlede GAL-3 vill

gruppe (841,8 ± 41,11 pg/mg) sammenlignet med GAL-3 villkontrollgruppen (429,2 ± 39,56 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Immunfluorescerende farging av representativnyreseksjoner har vist et betydelig høyere uttrykk for GAL-3 i nyretubuli påvirket av akutt tubulær nekrose (fig. 4B-D) sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (fig. 4A).

GAL-3 er en anti-nekroptotisk mediator

Reseptorinteragerende serin/treonin-proteinkinase 1 (RIPK1). Det var en signifikant økning i RIPK-1-konsentrasjon (55,33 ± 3,766 pg/mg) inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (14,22 ± 1,687 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Flere sammenligninger mellom de fire eksperimentelle gruppene ved bruk av enveis ANOVA, etterfulgt av Newman-Keuls post hoc-test var statistisk signifikante (P<>

Immunhistokjemisk farging for RIPK-1 viste et betydelig høyere antall celler som uttrykker RIPK-1 inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3 villmus (P<0.001), (fig.="">

Reseptorinteragerende serin/treonin-proteinkinase 3 (RIPK3). Det var en signifikant økning i RIPK-3-konsentrasjon (616,4 ± 27,07 pg/mg) i nyrene til cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (17,46 ± 7.002 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">nyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn i cisplatin-behandlede GAL-3 villmus (616,4 ± 27,07 pg/mg), (P<0.001), (fig.="">

Immunhistokjemisk farging for RIPK-3 viste et signifikant høyere antall celler som uttrykker RIPK-3 i nyrene til cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3-villmus ( P<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Blandet avstamning kinase domene-lignende (MLKL). Det var en signifikant økning i MLKL-konsentrasjon (71,46 ± 1,757 pg/mg) inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (23,30 ± 0,5897pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Cathepsin B. Det var en signifikant økning i Cathepsin-B konsentrasjonen inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus (55,79 ± 4,141 pg/mg) sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (37,99 ± 1,206 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">nyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus (85,87 ± 9,220 pg/mg sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (32,81 ± 1,570 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Flere sammenligninger mellom de fire eksperimentelle gruppene ved bruk av enveis ANOVA, etterfulgt av Newman-Keuls post hoc-test var statistisk signifikante (P<>

Cathepsin-D. Det var en betydelig økning i Cathepsin-D-konsentrasjonen inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus (5145 ± 286,1 pg/mg) sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (4066 ± 107,7 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">nyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus (6695 ± 587,7 pg/mg) sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (3914 ± 87,51 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

Flere sammenligninger mellom de fire eksperimentelle gruppene ved bruk av enveis ANOVA, etterfulgt av Newman-Keuls post hoc-test var statistisk signifikante (P<>

GAL-3 er en anti-apoptotisk mediator

Spaltet kaspase-3. Det var en signifikant økning i konsentrasjonen av spaltet kaspase-3 (4665 ± 330,9 pg/mg) inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (3193 ± 75,30 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Immunhistokjemisk farging for spaltet caspase-3 viste et signifikant høyere antall apoptotiske celler i nyrene til cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3-villemus (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

Spaltet PARP. Det var en signifikant økning i konsentrasjonen av spaltet PARP (1446 ± 56,97 pg/mg) inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (171,5 ± 3,926 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Immunhistokjemisk farging for spaltet PARP viste et signifikant høyere antall positive celler i nyrene til cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3-villmus (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL). Det var en signifikant økning i TRAIL-konsentrasjon (120,9 ± 4,748 pg/mg) inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (86.14 ± 2.879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Immunhistokjemisk farging for spaltet kaspase-3 viste et betydelig høyere antall apoptotiske celler inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3 villmus (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

Spaltet PARP. Det var en signifikant økning i konsentrasjonen av spaltet PARP (1446 ± 56,97 pg/mg) i nyrene til cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (171,5 ± 3,926 pg/ mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">nyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus sammenlignet med GAL-3 KO-kontrollmus (236,1 ± 11,86 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Immunhistokjemisk farging for spaltet PARP viste et betydelig høyere antall positive celler inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3 villmus (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL). Det var en signifikant økning i TRAIL-konsentrasjon (120,9 ± 4,748 pg/mg) i nyrene til cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (86.14 ± 2,879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">nyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn i cisplatin-behandlede GAL-3 villmus (120,9 ± 4,748 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

FAS-legende.Det var en signifikant økning i FAS-konsentrasjon (332,5 ± 6,395 pg/mg) inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (77,72 ± 2,805 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">nyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus sammenlignet med GAL-3 KO-kontrollmus (134,1 ± 3,597 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Flere sammenligninger mellom de fire eksperimentelle gruppene ved bruk av enveis ANOVA, etterfulgt av Newman-Keuls post hoc-test var statistisk signifikante (P<>

GAL-3 og prosurvival-signaler

NF-KB.Immunhistokjemisk farging for fosfor-NF-kB viste et betydelig høyere antall celler farget med fosfor-NF-kB inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus enn cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus (P<0.001), (fig.="" 12="">

Beta Catenin.Immunhistokjemisk farging for Beta-catenin viste et betydelig høyere antall celler farget med Beta-catenin inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 villmus enn cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus (P<0.001), (fig.="" 12="">

Wnt-3a.Immunhistokjemisk farging for Wnt-3a viste et signifikant høyere antall celler farget med Wnt-3a i nyrene til cisplatinbehandlede GAL-3 villmus enn cisplatinbehandlede GAL-3 KO-mus (P<0.001), (fig.="" 12="">

Plasma UreaDet var en signifikant økning i plasma ureakonsentrasjon (23,88 ± 6,715 mmol/L) hos cisplatin-behandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (6,688 ± 0). 6066 mmol/L), (P<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

Flere sammenligninger mellom de fire eksperimentelle gruppene ved bruk av enveis ANOVA, etterfulgt av Newman-Keuls post hoc-test var statistisk signifikante (P<>

Plasma kreatinin

Det var en signifikant økning i plasmakreatininkonsentrasjon (48,42 ± 3,992 umol/L) hos cisplatinbehandlede GAL-3 villmus sammenlignet med GAL-3 villkontrollmus (13,27 ± 0). 3106 umol/L), (P<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Diskusjon

Akuttnyreskade er et vanlig helseproblem over hele verden. Hvert år er det om lag 13,3 millioner akutte tilfellernyreskade (AKI). En byrde som er i ferd med å bli spesielt høy i fremvoksende land [21]. Globalt er det 1,7 millioner dødsfall per år forårsaket av AKI. Fra det oppstår rundt 1,4 millioner i lav- og mellominntektsland [21]. AKI kan ofte forebygges og behandles med bare noen få, om noen, langsiktige helsekonsekvenser. Identifisering av hovedmekanismer og aktører som deltar i utviklingen av AKI vil bli reflektert på å forbedre pasientenes omsorg og minimere dødelighet og sykelighet.

Vi har vist en betydelig økning i GAL-3-konsentrasjon inyrerutsatt for AKI. Vi har også vist et signifikant høyere ekspresjon av GAL-3 i nyretubuli påvirket av akutt tubulær nekrose i cisplatin-behandlede GAL-3 villmus enn nyretubuli i den saltvannsbehandlede kontrollgruppen. Både cytoplasmatiske og nukleære konsentrasjoner av GAL-3 økes betydelig i nyretubuli etter ATN sammenlignet med saltvannsbehandlede mus. Det økte nivået av GAL-3 i skadde nyretubuli antyder at GAL-3 er en viktig aktør i ATN.

Vi har også brukt GAL-3 KO-mus for å undersøke den mekanistiske rollen til GAL-3 i ATN. Dette hjelper oss å se nøye på moduleringene av pro-apoptotiske, pro-nekroptotiske og prosurvival-proteiner i nærvær og fravær av GAL-3 og bestemmer om GAL-3 har noen effekt eller ikke på disse endringene .

Vi har vist en signifikant høyere prosentandel av tubuli påvirket av ATN i cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn i cisplatin-behandlede GAL-3-ville mus. Våre resultater har også vist en signifikant økning i cathepsin B og cathepsin D i nyrer påvirket av ATN. I tillegg er det betydelig høyere nivåer av cathepsin B og cathepsin D innyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn hos cisplatin-behandlede GAL-3 villmus. Katepsiner spiller viktige roller i signalveiene som driver apoptotisk og nekrotisk celledød, ved å degradere forskjellige substrater og/eller bidra til mitokondriell destabilisering [22]. Lysosomale proteaser, cathepsin B og cathepsin D er rikelig uttrykt i nyrene [23].

Cathepsin B, en cysteinproteinase som har optimal aktivitet i et surt miljø, deltar i mange fysiologiske og patologiske prosesser. Den fordøyer strukturelle proteiner og enzymer i cellen, bryter ned hovedelementene i kjellermembranen og aktiverer proenzymer, hormoner og vekstfaktorer [24]. Økte ekspresjonsnivåer og aktivering av cathepsin B har blitt observert i den humane proksimale tubulære epitelcellelinjen HK-2 som gjennomgår apoptose [25].

Cathepsin D uttrykkes signifikant i proksimale tubulære celler. Cathepsin D er en nøkkellysosomal asparaginprotease som er ansvarlig for nedbrytningen av proteiner og organeller ved autofagi-lysosomal så vel som under cellulær nekrose og ruptur av lysosommembranen [26]. Cathepsin D er signifikant økt i skadde tubuli etter nyreiskemi/reperfusjonsskade, noe som støtter vårt funn av en signifikant økning i cathepsin D inyrermed akutt tubulær nekrose [27].

De høyere nivåene av Cathepsin B og D med en høyere prosentandel av ATN inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3 villmus foreslår GAL-3 som en anti-nekrotisk mediator.

Vi har også vist betydelig høyere nivåer av nekroptoseproteiner; RIPK1, RIPK3 og MLKL inyrerav cisplatin-behandlede mus. Dessuten har vi identifisert betydelig høyere konsentrasjoner av RIPK1, RIPK3 og MLKL i nyrene til cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3-ville mus.

Studier har vist at cisplatin er assosiert med økt oksidativt stress [28]. Generering av reaktive oksygenarter (ROS), akkumulering av lipidperoksidasjonsprodukter inyrer, og undertrykte antioksidantsystemer antas å være hovedmekanismene for cisplatin-indusert AKI [29]. Inne i cellen omdannes cisplatin til en svært reaktiv form som raskt reagerer med tiolholdige antioksidantmolekyler som glutation [30]. Cisplatin kan også forårsake mitokondriell dysfunksjon og økt ROS-produksjon gjennom en svekket respirasjonskjede [31]. ROS letter RIPK1 autofosforylering og fremmer rekruttering av RIPK-3 og dannelsen av nekrosom [32]. I tillegg er ROS en kritisk induser av lysosomal membranpermeabilitet (LMP) [33].

Cai et al. [34] har vist at ROS-mediert LMP er involvert i induksjon av nekroptose i intervertebrale skiveceller fra kanin. På samme måte blir RIPK1-indusert mitokondriell-ROS-produksjon fulgt av LMP og mitokondriell dysfunksjon som et resultat av en positiv tilbakemeldingssløyfe mellom Ca2 pluss og JNK, noe som fører til nekroptose av A549- og H1299-celler [35, 36].

Dessuten har det blitt vist at oppregulert RIPK3 i nekroptose induserer endoplasmatisk retikulumstress som øker cellulær Ca2 pluss konsentrasjon og uttrykket av xanthinoksidase som fører til økt ROS-generering [37].

Cathepsin B og D er det viktigste funksjonelle innholdet som frigjøres fra lysosomer med økt LMP under prosessen med celledød [34]. Cathepsin B- og D-aktivering kan forsterke den nekroptotiske veien [38]. Så nekroptose kan induseres på en reseptoruavhengig måte [39]. Dessuten har rapporter vist at det er ytterligere stimuli, annet enn ROS, cathepsin B og D, for induksjon av nekroptose, og disse inkluderer oppregulering av TRAIL og FAS legende-proteiner [40]. Så den økte ROS enten på grunn av cisplatin eller induksjon av RIPK1 eller RIPK3 kan føre til økt LMP og frigjøring av cathepsin B og D som igjen forsterker nekroptose. På samme måte kan den økte ROS aktivere RIPK1, rekruttering av RIPK3, forbedring av nekrosomdannelse, fosforylering av MLKL, translokasjon av fosforylert MLKL til cellemembran som fører til nekrotisk celledød gjennom plasmamembranpermeabilisering og ruptur.

I denne studien tror vi at økt ROS, cathepsin B, cathepsin D, TRAIL og FAS er involvert i induksjonen av nekroptose i ATN.

For å bestemme rollen til GAL-3 i nekroptose, har vi målt RIPK1-, RIPk3- og MLKL-konsentrasjoner i nærvær og fravær av GAL-3 ved å bruke GAL-3 wild og GAL{{5 }} KO-mus.

De signifikant høyere konsentrasjonene av RIPK1, RIPK3 og MLKL i cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn cisplatin-behandlede GAL-3-mus indikerer at knock-out av GAL-3 er assosiert med en betydelig økning i nekroptoseproteiner, noe som tyder på en anti-nekroptotisk rolle til GAL-3.

Dessuten har vi vist betydelig høyere nivåer av pro-apoptotiske proteiner; spaltet caspase-3, spaltet PARP, TRAIL, FAS og apoptotiske legemer inyrerfølger ATN.

Under ATN tillater lysosomal membranpermeabilisering translokasjon av cathepsin D og cathepsin B fra lysosomet til cytosolen hvor det kan utøve sin pro-apoptotiske funksjon. Cytosolic cathepsin D spalter Bid-protein til tBid og utløser innsetting av Bax-protein i mitokondriemembranen. Dette fører til frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene inn i cytosolen, og aktivering av pro-kaspaser 9 og 3 [41]. I denne studien har både immunfluorescerende farging og proteinkonsentrasjon vist signifikant høyere ekspresjon av intracellulær GAL-3, både cytoplasmatiske og nukleære fraksjoner, i ATN inyrerav GAL-3 villmus sammenlignet med kontrollmus.

Så de høyere nivåene av pro-apoptotiske proteiner; spaltede caspase-3, TRAIL, FAS og apoptotiske kropper inyrerav cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus enn i cisplatin-behandlede GAL-3 ville mus antyder en anti-apoptotisk rolle for GAL-3. GAL-3 har vist seg å være kritisk involvert i apoptose avhengig av dens subcellulære lokalisering. Studier har vist at intracellulær GAL-3 kan hemme apoptose [42-44]. Til støtte for den anti-apoptotiske rollen til GAL-3 har vi identifisert et betydelig høyere antall celler som uttrykker fosfo-NF-κB, beta-catenin og Wnt-proteiner i nyrene til cisplatin-behandlet GAL{{15} } ville mus enn GAL-3 KO-mus. NF-KB er en transkripsjonsfaktor som spiller en viktig rolle i å regulere betennelse, celleproliferasjon og celleoverlevelse. Fosforylering spiller en kritisk rolle i aktiveringen av NF-KB nedstrøms for alle disse stimuli [45]. NF-KB er nå anerkjent som en viktig bidragsyter til celleoverlevelse og beskyttelse mot apoptose [46]. Wnt-proteinene har vist seg å ha beskyttende effekter på skadede celler gjennom deres anti-apoptotiske funksjon via aktivering av -catenin og c-Myc [47].

Wu et al. har også vist en signifikant økning i p-NF-kB inyrermed ATN [48]. Wang et al. har også vist oppregulering av Wnt/-catenin-signalveien ved akutt nyreskade [49]. Studier har vist at NF-kB er involvert i induksjonen av GAL-3 [50] så vel som at GAL-3 er involvert i aktiveringen av NF-kB [51]. Interessant nok har GAL-3 blitt funnet å være en ny bindingspartner til -catenin [52].

Disse funnene tyder på at den anti-apoptotiske rollen til GAL-3 også kan medieres gjennom aktivering av NF-KB og Wnt/-catenin-veier. GAL-3 ser ut til å knytte disse signaltransduksjonsveiene for overlevelse som er undersøkt i vår studie. Disse banene har også krysstale mellom seg på ulike nivåer. Wnt/-catenin pathway-spillere modulerer mange av effektene deres gjennom interaksjon med NF-KB og gjensidig påvirker NF-KB også Wnt/-catenin signalveien [53]. Derfor er det forståelig at GAL-3 spiller en sentral koblingsrolle i prosurvival-signaltransduksjonsveiene.

Vår studie viser at tilstedeværelsen eller fraværet av intracellulær GAL-3 er assosiert med signifikante endringer i proapoptotiske, pronecroptotic og prosurvival proteiner i cisplatin-indusert ATN og at de høye nivåene av GAL-3 i nyretubuli er mediering av et anti-apoptotisk, antinekroptotisk og prosurvival miljø som kan forme det fremtidige sykdomsforløpet. Dette antyder en beskyttende rolle for GAL-3 i akutt cisplatinindusert ATN, som støttes av betydelig lavere plasmanivåer av urea og kreatinin i GAL-3 ville cisplatinbehandlede mus enn GAL-3 KO cisplatin-behandlede mus (fig. 13).

Konklusjon

GAL-3 kan påvirke celleoverlevelse og -død gjennom sin interaksjon med nekroptotiske, apoptotiske og pro-overlevelsesproteiner i nyretubuli under cisplatinindusert akutt tubulær nekrose.

Anerkjennelser

Forfatterbidrag

Alle forfattere vurderte og godkjente den innsendte versjonen av manuskriptet. SA introduserte konseptet, designet studien, analyserte og tolket dataene, designet figurene og skrev papiret. GJ utførte dyreforsøk og ELISA-teknikk, MS utførte immunhistokjemisk og immunfluorescerende farging og relatert vevsbehandling. HT utførte dyreforsøk og ELISA-teknikk. JY utførte en biokjemisk analyse av nyrefunksjonen og sendte inn de resulterte dataene.

Avsløringserklæring

Forfatterne erklærer å ikke ha noen konkurrerende interesser.

Referanser

1 Lameire NH, Bagga A, Cruz D, De Maeseneer J, Endre Z, Kellum JA, Liu KD, Mehta RL, Pannu N, Van Biesen W, Vanholder R: Akutt nyreskade: en økende global bekymring. Lancet 2013;382:170-179.

2 KDIGO: Retningslinjer for klinisk praksis for akutt nyreskade. Nyre Int 2012;2:1–138.

3 Schumer M, Colombel MC, Sawczuk IS, Globe G, Connor J, O'Toole KM, Olsson CA, Wise GJ, Buttyan R: Morfologiske, biokjemiske og molekylære bevis på apoptose under reperfusjonsfasen etter korte perioder med nyreiskemi Am. J Pathol 1992;140:831-838.

4 Schumer AT, Davies DR, McLaren AJ, Cerundolo L, Morris PJ, Fuggle SV: Apoptose ved iskemi/reperfusjonsskade av humane nyreallografter. Transplantation 1998;66:872-876.

5 Degterev A, Huang Z, Boyce M, Li Y, Jagtap P, Mizushima N, Cuny GD, Mitchison TJ, Moskowitz MA, Yuan J: Kjemisk hemmer av ikke-apoptotisk celledød med terapeutisk potensial for iskemisk hjerneskade. Nat Chem Biol 2005;1:112–119.

6 Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G: Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;11:700–714.

7 Chen X, Li W, Ren J, Huang D, He WT, Song Y, Yang C, Li W, Zheng X, Chen P, Han J: Translokasjon av blandet kinasedomene-lignende protein til plasmamembran fører til nekrotisk celle død. Cell Res 2014;24:105–121.

8 Cai Z, Jitkaew S, Zhao J, Chiang HC, Choksi S, Liu J, Ward Y, Wu LG, Liu ZG: Plasmamembrantranslokasjon av trimerisert MLKL-protein er nødvendig for TNF-indusert nekroptose. Nat Cell Biol 2014;16:55–65.

9 Wang Y, Liu Y, Liu Y, Zhou W, Wang H, Wan G, Sun D, ​​Zhang N, Wang Y: Et polymert prodrug av cisplatin-basert på pullulan for målrettet terapi mot hepatocellulært karsinom. Int J Pharm 2015;483:89–100.

10 Pablo N, Dong Z: Cisplatin nefrotoksisitet: mekanismer og renobeskyttende strategier. Nyre Int 2008;73:994–1007.

11 Mi XJ, Hou JG, Wang Z, Han Y, Ren S, Hu JN, Chen C, Li W: De beskyttende effektene av maltol på cisplatin-indusert nefrotoksisitet gjennom AMPK-mediert PI3K/Akt og p53 signalveier. Sci Rep 2018;8:15922.

12 Ozkok A, Edelstein CL: Patofysiologi av cisplatin-indusert akutt nyreskade. Biomed Res Int 2014;2014:1–17.

13 Hughes RC: Sekresjon av galectinfamilien av pattedyrkarbohydratbindende proteiner. Biochim Biophys Acta 1999;1473:172-185.

14 Liu FT, Patterson RJ, Wang JL: Intracellulære funksjoner til galektiner. Biochim Biophys Acta 2002;1572:263- 273.

15 van den Brûle FA, Waltregny D, Liu FT, Castronovo V: Endring av det cytoplasmatiske/nukleære uttrykksmønsteret til galectin-3 korrelerer med prostatakarsinomprogresjon. Int J Cancer 2000;89:361-367.

16 Xue J, Gao X, Fu C, Cong Z, Jiang H, Wang W, Chen T, Wei Q, Qin C: Regulering av galectin-3-indusert apoptose av Jurkat-celler av både O-glykaner og N-glykaner på CD45. FEBS Lett 2013;587:3986-3994.

17 Matarrese P, Fusco O, Tinari N, Natoli C, Liu FT, Semeraro ML, Malorni W, Iacobelli S: Galectin-3 overekspresjon beskytter mot apoptose ved å forbedre celleadhesjonsegenskaper. Int J Cancer 2000;85:545- 554.

18 Oka N, Nakahara S, Takenaka Y, Fukumori T, Hogan V, Kanayama HO, Yanagawa T, Raz A: Galectin-3 hemmer tumornekrosefaktorrelatert apoptose-indusert ligandindusert apoptose ved å aktivere Akt i human blære karsinomceller. Cancer Res 2005;65:7546-7553.

19 Hashmi S, Al-Salam S: Galectin-3 kommer til uttrykk i myokardiet veldig tidlig etter hjerteinfarkt. Cardiovasc Pathol 2015;24:213-223.

20 Zhang S, Li R, Dong W, Yang H, Zhang L, Chen Y, Wang W, Li C, Wu Y, Ye Z, Zhao X, Li Z, Zhang M, Liu S, Liang X: RIPK3 medierer renal tubulær epitelcelleapoptose ved endotoksinindusert akutt nyreskade. Mol Med Rep 2019;20:1613-1620.

21 Liyanage T, Ninomiya T, Jha V, Neal B, Patrice HM, Okpechi I, Zhao MH, Lv J, Garg AX, Knight J, Rodgers A, Gallagher M, Kotwal S, Cass A, Perkovic V: Verdensomspennende tilgang til behandling for nyresykdom i sluttstadiet: en systematisk gjennomgang. Lancet 2015;385:1975-1982.

22 Turk B, Stoka V: Proteasesignalering ved celledød: caspaser versus cysteinkathepsiner. FEBS Lett 2007;581:2761–2767.

23 Pavlock GS, Southard JH, Starling JR, Belzer FO: Lysosomal enzymfrigjøring i hypodermisk perfuserte hundenyrer. Cryobiology 1984;21:521-528.

24 Werle B, Jülke B, Lah T, Spiess E, Ebert W: Cathepsin B-fraksjon aktiv ved fysiologisk pH på 7,5 er av prognostisk betydning ved plateepitelkarsinom i menneskelungene. Br J Cancer 1997;75:1137–1143.

25 Wang C, Jiang Z, Yao J, Wu X, Sun L, Liu C, Duan W, Yan M, Sun L, Liu J, Zhang L: Deltakelse av cathepsin B i emodin-indusert apoptose i HK-2 Celler. Toxicol Lett 2008;181:196–204.

26 Suzuki C, Tanida I, Ohmuraya M, Oliva Trejo JA, Kakuta S, Sunabori T, Uchiyama Y: Mangel på Cathepsin D i de renale proksimale tubulære cellene resulterte i økt følsomhet mot nyreiskemi/reperfusjonsskade. Int J Mol Sci 2019;20:1711.

27 Lameire N, Van Biesen W, Vanholder R. Akutt nyresvikt. Lancet 2005;365:417-430.

28 Yu W, Chen Y, Dubrulle J, Stassi F, Putluri V, Sreekumar A, Putluri N, Baluya D, Lai SY, Sandulache VC: Cisplatin genererer oksidativt stress som er ledsaget av raske endringer i sentral karbonmetabolisme. Sci Rep 2018;8:4306.

29 Aydinoz S, Uzun H, Cermiketal G: Effekter av ulike doser hyperbarisk oksygen på cisplatin-indusert nefrotoksisitet. Nyresvikt 2007;29:257–263.

30 Siddik ZH: Cisplatin: cytotoksisk virkning og molekylær basis for resistens. Oncogene 2003;22:7265–7279.