Strukturell karakterisering og vurdering av anti-inflammatoriske og anti-tyrosinase aktiviteter av polyfenoler fra melastoma normal del 2

Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon

Forbindelse 3 hadde samme molekylformel som forbindelse 2, bestemt av dens HRESIMS-data. Sammenligning mellom NMR-dataene for 3 og 2 (tabell 2) viste at metoksylgruppen ved galloyl-C-4 i 2 skiftet til galloyl-C-3' i 3. Dette ble bekreftet av HMBC-korrelasjonene (Figur 2) av metoksylprotonene (8y 3.88) og aromatisk proton (bH7.24) med galloyl-C-3'(6c 149.1) i 3, og de kjemiske skiftene til metoksylgruppen, galloyl-C{ {24}}, galloyl-C-4 og galloyl-C-3' som skiftet fra henholdsvis bc60.8,151.5,141.3 og 146.5 i 2tobc56.7,146.6,140.7 og 149.1 i3.A positive bomullseffekt ved 237 nm og en negativ effekt ved 262 nm i CD-spekteret indikerte (S)-konfigurasjonen til HHDP-gruppen for 3 [24]. Konfigurasjonen av sukkerdelen ble utledet fra koblingskonstanten (=8,5 Hz) til det anomere protonet til glukosyldelen. Syrehydrolyse av 3 med 1 M HCl ga D-glukose, som ble bekreftet ved TLC- og GC-analyser. Derfor ble forbindelse 3 identifisert som 1-O-galloyl-6-O-(3-metoksygalloyl)-2,3-O-(S)-heksahydroksydifenoyl{{ 66}}D-glukose.

Molekylformelen til 4 ble utledet fra dets HRESIMS-spektrum (m/z 783,1032, [MH]-) som C35H28O21. Molekylvekten var 16 masseenheter mindre enn 3, noe som kan tilskrives fraværet av en hydroksyl og tilstedeværelsen av et aromatisk proton (6H6.87) ved vanilloyl-C-5' i 4 (tabell 2) . Dette ble bekreftet fra tilstedeværelsen av en 1,2,4-trisubstituert aromatisk del (μ7.60 （dd, J=8.3,1.8 Hz）,6.87 （d, J=8 .3 Hz）, og 7.57 （d, J=1.8 Hz）） og den kjemiske skiftendring av galloyl-C-5' ved δc 145.8 i 3 til vanilloyl-C-5 ' ved bc 115,9 i 4. Metoksylprotonene (6H 3.90) og aromatisk proton (H 6.87) korrelasjoner med vanilloyl-C-3' i HMBC-spekteret (Figur 2) bekreftet ytterligere det aromatiske protonet (H 6.87) ved vanilloyl-C-5'. Atropisomerismen til HHDP ble vist å være en S-konfigurasjon ved tilsynekomsten av positive og negative bomullseffekter ved henholdsvis 239 nm og 263 nm [24]. Koblingskonstantene til det anomere protonet i 4 var 8,5 Hz som minner om -anomer konfigurasjon. Syrehydrolysen viste at 4 hadde samme sukkerenheter som 3. Forbindelse 4 ble derfor identifisert som 1-O-galloyl-6-O-vanilloyl-2,3-O- (S)-heksahydroksydifenoyl- -D-glukose.

Klikk her for å vite mer

2.2. Anti-inflammatoriske aktivitetsanalyser

Four new compounds 1-4 were tested for potential anti-inflammatory activity by measuring the inhibition of nitric oxide (NO) production. Unfortunately, none of them displayed significantly anti-inflammatory activity. The IC5o values for the inhibition of NO production by compounds 1-4 are all>50 uM. Det er rapportert at de kjente flavonolene kaempferol(7)[26[, quercetin (10)[27l og myricetin-3-O- -L-rhamnopyranoside(12)28 har anti-inflammatorisk aktivitet, men kaempferol -3-rhamnoside (8) [26] og quercetin-3-O- -L-rhamnoside (11)[29] har ingen anti-inflammatorisk aktivitet. Fra eksperimentelle resultater og litteraturdata har flavonoidene i tittelplanten bedre anti-inflammatorisk aktivitet enn ellagitanniner, det kan være den aktive ingrediensen som tilsvarer den anti-inflammatoriske effekten til denne planten.

2.3. Tyrosinaseinhibitoriske aktivitetsanalyser

Alle forbindelser ble undersøkt for potensiell tyrosinaseinhiberende aktivitet. Som vist i tabell 3, viste nye forbindelser 2-4 moderate tyrosinaseinhiberende aktiviteter. Ny forbindelse 1 viste svak tyrosinaseinhiberende aktivitet. Quercetin (10)[30] har en betydelig tyrosinaseinhibitorisk aktivitet, og dets antityrosinaseaktivitet er bedre enn quercetin-3-OwL-rhamnoside(11)[26] og kaempferol (7) [26], som er konsistent med litteraturdataene. Dette indikerte at 3'- og 4/-hydroksygrupper på B-ringen og 3-hydroksygrupper på C-ringen i flavonoler var avgjørende for aktivitetene deres. Antityrosinaseaktiviteten til kaempferol (7)[26] er bedre enn kaempferol-3-rhamnosid (8)[26]og forbindelsene 8 og 12 [31] har ingen signifikant antityrosinaseaktivitet, noe som ytterligere støtter ovennevnte struktur-aktivitet relasjoner.

3. Eksperimentell 3.1.Materialer

Røttene til M.normale ble samlet inn fra Yanshan Town, Guilin City, Guangxi-provinsen, i september 2018, og autentisert av professor Yusong Huang (Guangxi Institute of Botany). Et kupongprøve (20180912) ble deponert i Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization, Guangxi Institute of Botany, Kina.

Cistanche kan forbedre immuniteten

3.2. Generelle eksperimentelle prosedyrer

Optiske rotasjoner ble målt med et ADP440 pluss polarimeter (λ 589 nm, banelengde 1,0 cm). NMR-spektrene ble innhentet på et Bruker Advance 500-spektrometer (Bruker Biospin AG, Fällanden, Sveits), og de gjenværende løsningsmiddeltoppene ble brukt som referanser. Koblingskonstanter og kjemiske skift ble gitt i henholdsvis Hz og på en δ (ppm) skala. ESIMS- og HIRESIMS-dataene ble registrert på henholdsvis et BRUKER HCT-massespektrometer og LCMS-IT-TOF-spektrometer (Shimadzu, Kyoto, Japan). GC ble utført på et Agilent 7890ON(Agilent Technologies, Inc. Chandler, AZ, USA)-system med en 0,32 mm id × 25 mL-Chirasil-Val-kolonne. Analytisk HPLC ble kjørt på et Shimadzu LC-2030C HPLC(Shimadzu, Kyoto, Japan)-system ved bruk av en 4,6id×250 mm Agilent Eclipse XDB-C18(5 um) kolonne. semi-preparativ HPLC ble utført på et Shimadzu LC-20AT HPLC-system ved bruk av en 20,0id×250 mm Dr. Maisch reprosil 100 C18 (5 um) kolonne ved en strømningshastighet på 4 ml/min. Kolonnekromatografi (CC) ble utført ved bruk av Sephadex LH-20 （25-100 μm; GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Sverige）, silikagelkolonne (200-300 mesh, Qingdao Marine Chemical Co. Ltd., Qingdao, Kina), MCI gel CHP 20P(75-150 um; Mitsubishi Chemical Co., Tokyo, Japan), og Chromatorex ODS (50 um, Merck, Darmstadt, Tyskland) kolonner.

3.3. Ekstraksjon og separasjon

Lufttørkede, pulveriserte røtter (10 kg) av M. normale ble ekstrahert med 8{{20}} prosent vandig aceton (3×7 dager) ved romtemperatur og hvert ekstrakt filtrert. Filtratene ble tørket under redusert trykk for å gi et råekstrakt (0,6 kg). Ekstraktet ble suspendert i H2O(1 L) og suksessivt fordelt med petroleumseter (3×2L), EtOAc (3×2 L). EtOAcekstrakten (8{{40}}g) ble delt inn i ti fraksjoner( Fr.1-10)ved silikagel CC (8 id×20 cm) som elueres med en gradient av CH2Cl-MeOH(100:0,95:5,90:10,80:20, 70 :30,50:50,0:100,v/v). Fr.4 (32 g) ble lastet på en MCI-gelkolonne (6i.d.×20 cm) og eluert med en gradient av MeOH-H,O（0∶100-100∶0,v/ø）to gi atten underfraksjoner（Fr4-1-4-18). Separasjon av underfraksjon Fr4-14(3,0g) ble utført med en annen silikagelkolonne (3i.d.×20 cm) som eluerte med en gradient av CH2Cl{{48 }}MeOH (97:3-80:20, o/v) og Sephadex LH-20 CCeluering med CH2Cl2-MeOH(1:1,v/o) for å gi 7(11,3 mg) ), 8 (10,6 mg), 9 (9,3 mg), 10 (20,6 mg), 11 (7,6 mg) og 12 (6,2 mg). Fr 6 (4,2 g) ble påført ODS C18-kolonnen og eluert med MeOH-H2O (20:80-80:20) for å oppnå 9 underfraksjoner (Fr 6-1-6-9). Videre separasjon av underfraksjon Fr 6-4(1,2 g) ved bruk av Sephadex LH-20 CC(eluert med MeOH-H2O,10:90-100:0)ga forbindelser 1(9,6 mg),5( 7,2 mg) og 6 (7,3 mg). Forbindelser 2(tR 130,5 min, 5,2 mg), 3(tR 146,8 min, 9,6 mg) og 4(tR 177,2 min, 15,3 mg) ble oppnådd fra Fr7(2,5 g) via semipreparativ HPLCeluering med en gradient av MeOH-H2O( 20:80-40:60, / u, 0-250 min).

3.4. Spektroskopiske data

Whisky tannin C (1): Brunt amorft pulver; [ ]-12.6 grader (c= 0.16, MeOH);UV （MeOH）λmaxnm （log e）∶203（2.02）,276（1.19）; CD （MeOH）λmax（△e）263（-7.8）,240（10.9）,225(2.9).1Hand 13C NMR-data,se tabell 1;HRESIMSm/z:[MH]{{24} }.1240(beregnet for C4sH33O27-, 1005,1215). 1-O-(4-metoksygalloyl)-6-O-galloyl-2,3-O-(S)-heksahydroksydifenoyl- -D-glukose( 2): Brunt amorft pulver amorft pulver; 【 】5-5.5 grader （c=0.17, MeOH）; UV (MeOH) 入maks nm （log e）∶203 （2.52）,275（2.01）; CD （MeOH）λmax（△8）264（-8.0）,238（30.6）,218（1.3）.'H og 13C-NMR-data, se tabell 2; HRESIMS m/z:799,0983[MH]-(beregnet for C3sH2O22-, 799,099).

{{0}}O-galloyl-6-O-(3-metoksygalloyl)-2,3-O-(S)-heksahydroksydifenol-6- D-glukose(3); Brunt amorft pulver;【 】7-33.5 grader （c=0.12, MeOH）; UV (MeOH) 入maks nm （log e）∶203 （2.40）,273（1.68）; CD （MeOH）λmax（△e）262（-3.1）,237（11.1）,210（-2.7）.'Hand13CNMR-data, se tabell 2;HRESIMS m.1069 m/z:069 [MH]-(beregnet for C35H2O22-,799,0999). 1-O-galloyl-6-O-vanilloyl-2,3-O-(S)-heksahydroksydifenoyl- -D-glukose (4): Brunt amorft pulver; 【 】7-20.6 grader （c=0.15, MeOH）; UV(MeOH)λmaks nm (log e)∶203 (2.42),278(1.86); CD（MeOH）λmax（△e）263（-12.1）,239（42.5）, 219（0.9）.'H og 13CNMR-data, se tabell 2;HRESIMS m/z: 323MH.]10 783MH. (beregnet for C35H27O21-,783,1050).

3.5. Syrehydrolyse av 2-4

Forbindelse 2 (2 mg) ble behandlet med 1 M HCl (5 mL) ved 8 0 grader i 4 timer, og deretter ekstrahert med etylacetat (3x5 mL). Den vandige fasen ble tørket under en strøm av N2 for å generere en nøytral rest som ble analysert ved bruk av TLC(SiO2) med EtOAc-pyridin-EtOH-H, O(7:1:1:2) som løsningsmiddelsystem. R-verdien til den nøytrale resten var den samme som for autentisk D-glukose, noe som indikerer at sukkerkomponenten til 2 var glukose. Den nøytrale resten og 5 mg L-cystein-metylesterhydroklorid ble oppløst suksessivt i 3 ml vannfri pyridin og oppvarmet ved 80 grader i 1 time. Etter fjerning av løsningsmidlet ved fordampning under redusert trykk, ble reaksjonsblandingen deretter omsatt med 0,6 ml N-trimetylsilylimidazol ved 80 grader i 1 time. Reaksjonsblandingen ble fordelt med n-heksan og H, O, og deretter ble n-heksanlaget analysert med et GC-instrument. Injektor- og detektortemperaturene ble satt til henholdsvis 250 grader og 280 grader. Den opprinnelige kolonnetemperaturen ble holdt ved 160 grader i 1 min, deretter økt til 280C ved 5 grader/min og holdt i 10 minutter. Den autentiske D-glukosen og den autentiske L-glukosen ble silylert og analysert på samme måte, og deres retensjonstid var henholdsvis 19,09 og 19,25 min. Resultatene av GC-analysen indikerte at sukkerkomponenten til 2 var D-glukose (t 19,1 min). Sukkerkomponentene til 3 og 4 ble bestemt ved bruk av samme prosedyre.

3.6. Anti-inflammatorisk aktivitet

3.6.1.NO Produksjon av LPS-stimulerte RAW 264.7 celler

RAW 264.7-cellene ble dyrket i DMEM supplert med 10 prosent FBS ved 37 grader i en fuktet atmosfære på 5 prosent CO2 i 24 timer. Celler i en 24-brønnplate (5 x 104 celler/brønn) ble behandlet med 200 ng/mL LPS og testforbindelsene. Etter 22 timer ble mediene samlet, og nivået av nitritt ble målt ved å bruke Griess Reagent System (Promega, Madison, WI, USA).

3.6.2. Cellelevedyktighet

MTT-analyse ble utført for å måle cytotoksisiteten til testprøver på RAW264.7-cellelinjen. Celler som var i den logaritmiske vekstfasen ble sådd i en 96-brønnplate med en tetthet på 5× 10 pluss -6×10* celler/brønn og inkubert ved 37 grader med 5 prosent CO, i 24 h. Deretter ble cellene behandlet med 100 μL kulturmedium ved forskjellige konsentrasjoner av testprøver i 24 timer. Mediet ble kastet og 100 ul FBS-fritt medium inneholdende MTT (1 mg/ml) ble tilsatt til hver brønn. Etter inkubering i inkubatoren i 4 timer, ble supernatanten kastet og 100 μL DMSO ble tilsatt til hver brønn for å løse opp formazan. Absorbansen ble målt ved 570 nm ved bruk av en mikroplateleser.

3.7. Anti-Ty/rosinase-aktivitet

Anti-tyrosinaseaktivitetene til isolatene ble undersøkt i henhold til prosedyren beskrevet av Aoki et al. med små modifikasjoner [21]. L-DOPA og kojinsyre ble brukt som henholdsvis substrat og positiv kontroll. Løsning av L-DOPA ved 5.0 mM, sopptyrosinase ved 100 U/mL, samt prøver i forskjellige konsentrasjoner ble fremstilt i fosfatbuffer (pH6.8) .20 μL av prøveløsningen og 10 μL sopp-tyrosinase-løsning ble blandet og pre-inkubert ved 37 grader i 10 minutter, deretter ble 40 ul L-DOPA-løsning tilsatt og inkubert ved 37 grader i 5 minutter. Reaksjonssystemet til anti-tyrosinaseaktivitetseksperimentet er vist i tabell 4. Absorbansen ble målt ved 475 nm ved bruk av Spark 10M multimodus mikroplateleser (Tecan Trading AG, Zürich, Sveits). Alle analyser ble gjentatt tre ganger og hver gang i tre eksemplarer. Prosent hemming av tyrosinaseaktivitet ble beregnet ved å bruke følgende formel:

hvor T representerer absorbansen med prøve og tyrosinase; To representerer absorbansen med en prøve, men ingen tyrosinase; C representerer absorbansen med tyrosinase, men ingen prøve; Co representerer absorbansen uten tyrosinase og prøve.

4. Konklusjoner

Studien er ment å utforske mer antiinflammatoriske og enzymhemmende aktiviteter av polyfenoler fra røttene til M.normale på grunnlag av våre tidligere arbeider [20]. Som forventet ble tolv polyfenoler hentet fra flisanlegget for første gang, og forbindelsen 1-4 var ny ellagitannin. Den vellykkede isolasjonen og strukturidentifikasjonen av ellagitannin gir materialer for screening av antiinflammatoriske legemidler og enzymhemmere og bidrar også til utvikling og utnyttelse av M.normale. Ellagitanniner 1-4 har ingen signifikante tyrosinaseinhiberende aktiviteter og antiinflammatoriske aktiviteter, noe som gjør det mindre sannsynlig at det er et potensielt antiinflammatorisk legemiddel eller enzymhemmer. Heldigvis har de nye effekter, som anti-fedme [6,7]. Flavonoider har bedre anti-inflammatorisk og hemmende enzymaktivitet enn ellagitanniner i røttene til M. normale, og de er mer sannsynlig å være betennelsesdempende og anti-enzymhemmere. Studiet av forholdet struktur-aktivitet er nyttig for å finne nye anti-inflammatoriske legemidler og enzymhemmere.

Denne artikkelen er hentet fra Molecules 2021, 26, 3913. https://doi.org/10.3390/molecules26133913 https://www.mdpi.com/journal/molecules