Målretting mot laktatdehydrogenase A med katekin resensibiliserer SNU620/5FU gastriske kreftceller til 5-fluorouracil del 1
Mar 23, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
Abstrakt:Resistens mot kreftbehandling forekommer i praktisk talt alle typer kreft og blir en stor vanskelighet i kreftbehandling. Selv om 5-fluorouracil (5FU) er det første valget av kreftbehandling for magekreft, er effektiviteten begrenset på grunn av medikamentresistens. Nylig har endret kreftmetabolisme, inkludert Warburg-effekten, en preferanse for glykolyse fremfor oksidativ fosforylering for energiproduksjon, blitt akseptert som en sentral mekanisme som regulerer motstand mot kjemoterapi. Vi undersøkte derfor den detaljerte mekanismen og mulig nytte av antiglykolytiske midler for å lindre 5FU-resistens ved å bruke etablerte magekreftcellelinjer, SNU620 og SNU620/5FU.SNU620/5FU, en magekreftcelle som har resistens mot 5FU, viste mye høyere laktatproduksjon og ekspresjon avglykolyse-relaterte enzymer, slik som laktatdehydrogenase A(LDHA), enn de til foreldre SNU620-cellene. For å begrense glykolyse, undersøkte vi katekin og dets derivater, som er kjentanti-inflammatoriskog antikreft naturlige produkter fordi epigallocatechin gallat tidligere har blitt rapportert som en suppressor av LDHA-uttrykk. Catechin, den enkleste forbindelsen blant dem, hadde den høyeste hemmende effekten på laktatproduksjon og LDHA-aktivitet. I tillegg viste kombinasjonen av 5FU og katekin ytterligere cytotoksisitet og induserte reaktive oksygenarter (ROS)-mediert apoptose i SNU620/5FU-celler. Derfor, basert på disse resultatene, foreslår vi katekin som en kandidat for utvikling av et nytt hjelpestoff som reduserer kjemoresistens til 5FU ved å begrense LDHA.
Nøkkelord:5-fluorouracil;kjemoresistent; glykolyse; laktatdehydrogenase; katekin
1. Introduksjon
Bemerkelsesverdige fremskritt er oppnådd i behandlingen av magekreft med kirurgisk reseksjon av primærtumoren og 5-fluorouracil (5FU)-basert kombinasjonskjemoterapi, som epirubicin, cisplatin og fluorouracil og docetaxel, oxaliplatin og 5FU[1 ,21 Til dags dato er 5FU, en analog av uracil som blokkerer DNA-syntese ved å hemme tymidylatsyntase [3], fortsatt et vanlig brukt kjemoterapimedisin for behandling av magekreft [1, A4]. Imidlertid har den kliniske effekten av kjemoterapi vært utilfredsstillende på grunn av tilbakefall av primær eller metastatisk kreft relatert til medikamentresistens [1,5].
Cistanche kan forbedre immuniteten
Flere cellulære prosesser blir sett på som nøkkelmekanismer som ligger til grunn for kjemoresistens, inkludert medikamentaktivering eller inaktivering, reparasjonsmaskineri av DNA-skader, modifikasjoner i legemiddelmål, inaktivering av apoptotiske veier og økt autofagi [6,7]. Kreft er heterogent og ulike kreftformer bruker både glykolyse og oksidativ fosforylering for energiomsetning [8]. Imidlertid har metabolsk omprogrammering, spesielt unormal aerob glykolyse, blitt rapportert som en nøkkelaktør i utviklingen av resistens mot kjemoterapeutiske legemidler, inkludert 5FU, ved magekreft [9]. Laktatdehydrogenase A (LDHA) og pyruvatdehydrogenasekinaser (PDK) er kjent som nøkkelregulatorer for aerob glykolyse som produserer laktat fra pyruvat [10,11]. Kombinasjonen av dikloracetat, en etablert hemmer av PDK, gjenoppretter følsomheten mot 5FU [12]. I tillegg har LDHA, et nøkkelenzym som katalyserer omdannelsen av pyruvat til laktat, blitt rapportert som et potensielt mål for behandling av magekreft [13,14]. Nedbryting av LDHA-ekspresjon i kreftceller hemmer tumorigenisitet gjennom å øke mitokondriell respirasjon og redusere cellelevedyktighet [15]. Flere LDHA-hemmere, som FX11, PSTMB og GSK 2837808A, reduserer ATP-nivåer og genererer oksidativt stress, og forårsaker til slutt apoptotisk celledød [16-18]. Selv om en studie viste at hemming av LDHA med mikroRNA-34a gjenopprettet motstanden mot 5FU i tykktarmskreft [19], har ingen tidligere studier rapportert effekten av genetiske eller farmakologiske LDHA-hemmere på kjemoresistens.
Polyfenoler i grønn te, inkludert katekin (CA), epicatechin (EC), gallocatechin (GC), epigallocatechin (EGC), epikatechin-3-gallat (EKG) og epigallokatekin-3-gallat (EGCG), fremmer mennesker helse ved å forebygge og behandle flere sykdommer, inkludert betennelse, diabetes, kardiovaskulær sykdom og ondartet kreft [20,21]. Blant polyfenoler øker EGCG 5FU kjemosensitivitet i kolorektal kreft og hepatocellulære karsinomceller ved å aktivere AMPK-veier og begrense kreftstammen [22,23]. I tillegg har EGCG blitt rapportert å hemme LDHA ved å undertrykke dets uttrykk i bryst- og bukspyttkjertelkreftcellene [24,25].
I denne studien antok vi at CA kan være en kandidat for et hjelpestoff for å redusere motstanden mot 5FU i magekreftceller. Det ble undersøkt at den hemmende effekten av CA, og/eller dens kombinasjon med 5FU, på LDHA-aktiviteten og derved induserte mitokondrielle reaktive oksygenarter (ROS) og apoptotisk celledød i 5FU-resistente celler.
2. Resultater
2.1. Glykolytiske egenskaper av 5FU-resistente celler
Forbedret spredning er et kjennetegn ved kjemoresistens inkludert 5FU-resistente kreftceller [26,27]. Først bekreftet vi motstanden mot 5FU og langsiktige vekstrater for SNU620- og SNU620/5FU-celler. Når disse cellene ble dyrket med de indikerte konsentrasjonene av 5FU i 48 timer, var den estimerte dosen som forårsaket 50 prosent vekstinhibering (Gl50) i SNU620/5FU-celler (100,63 uM) mye høyere enn den som forårsaket GIso i sine foreldres SNU620-celler (μ88 μM. ）（Figur 1A og tilleggsfigur S1）. I tillegg var veksthastighetene til SNU620/5FU-celler raskere enn for SNU620-celler (figur 1B og tilleggsfigur S2). Siden kjemoresistens og raskt voksende egenskaper kan være relatert til forhøyede glykolytiske egenskaper i magekreftceller [28], ble ekstracellulære forsuringshastigheter (ECAR) og oksygenforbruksrater (OCR) målt i begge cellene i nærvær av oksamat, en velkjent glykolysehemmer, eller ikke. Resultatene viste at SNU620/5FU-celler signifikant utskilte mer laktat enn det som ble utskilt av SNU620-celler og deretter surgjorde kulturmediet (figur 1C og tilleggsfigur S3). Imidlertid ble ingen signifikant endring i OCR observert mellom disse cellene (figur 1D). mRNA- og proteinekspresjonsnivåene til LDHA ble målt. LDHA-ekspresjon var høyere i SNU620/5FU-celler enn i SNU620-celler (figur 1E, F). Videre undersøkte vi mRNA- og proteinekspresjonsnivåene til PDK-isotyper og fant at de til PDK2 og PDK3 var høyere i SNU620/5FU-celler enn i SNU620-celler (tilleggsfigur S4A, B). Fosforyleringen av E1-underenheten av pyruvatdehydrogenase (PDHA1), som ble økt av PDK-er, ble også evaluert, og den ble funnet å være høyere i SNU620/5FU-celler enn i SNU620-celler (tilleggsfigur S4C). I tillegg brukte vi oksamat som en LDHA-hemmer for å overvinne 5FU-resistens i SNU620/5FU-celler. Denne forbindelsen hemmet cellevekst i både SNU620- og SNU620/5FU-celler (tilleggsfigur S5). Videre undertrykte samtidig behandling med oksamat og 5FU cellevekst, sammenlignet med individuell behandling med oksamat eller 5FUin SNU620/5FU-celler (figur 1G). Disse dataene antyder at SNU620/5FU-celler uttrykker LDHA i høy grad, og hemming av LDHA-aktivitet kan overvinne motstanden til SNU/5FU-celler mot 5FU.
Figur 1. Ifølge resultatene har 5-fluorouracil (5FU)-resistente celler en forhøyet glykolytisk karakteristikk: (A)SNU620- og SNU620/5FU-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjonene av 5FU i 48 timer. Levedyktigheten til disse cellene ble evaluert via MTT-analyse; (B) vekstnivåer av SNU620- og SNU620/5FU-celler ble målt hver dag i 4 dager med MTT-analyse; (C,D)SNU620- og SNU620/5FU-celler ble behandlet med oksamat ( 5mM) eller ikke i 24 timer, og ECAR- og OCR-verdier ble evaluert av Seahorse XF-analysator; (E, F) uttrykkene av LDHA i SNU620- og SNU620/5FU-celler ble påvist via qRT-PCR og Western blot-analyse; (G) SNU620- og SNU620/5FU-celler ble behandlet med oksamat (25 mM) og/eller 5FU (10 μM) i 48 timer. Resultatene vises som gjennomsnitt ± SEM.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
2.2. CA undertrykker LDHA-aktivitet
Laktatproduksjon ble analysert med CA og dets derivater, inkludert EC, GC, EGC og EGCG, i SNU620/5FU-celler. Sammenlignet med disse derivatene reduserte CA laktatproduksjonen mer effektivt (figur 2A). Videre, in vitro, ble LDHA-aktiviteten som sagt bekreftet, og CA viste en sterkere hemmende effekt på LDHA-aktivitet enn dens derivater (figur 2B). De hemmende effektene av CA på in vitro LDHA- og LDHB-aktiviteter ble målt på en doseavhengig måte. CA hemmet LDHA-aktivitet uten å påvirke LDHB-aktivitet (figur 2C, D). I tillegg ble LDHA- og LDHB-aktiviteter målt med EGCG, som er kjent for å hemme LDHA-aktivitet, og ble funnet å ha redusert doseavhengig (tilleggsfigur S6A, B). Videre ble intracellulære LDHA- og LDHB-aktiviteter evaluert med de angitte konsentrasjonene av CA i SNU620/5FU-celler. CA hemmet LDHA-aktivitet på en doseavhengig måte in vitro-resultater, men ikke LDHB-aktivitet (figur 2E, F). Proteinekspresjonsnivåer av p-PDHA1, PDK2, PDK3 og LDHA ble også målt i SNU620/5FU-celler etter CA-behandling (tilleggsfigur S7), og vi observerte at de ikke ble påvirket av denne behandlingen. Disse resultatene tyder på at CA regulerer LDHA-aktivitet uten å påvirke uttrykket.
2.3. Virkningsmåte for LDHA-hemming av CA
For å analysere hemmingsmekanismen til LDHA-aktiviteten på CA og dens derivater, utførte vi molekylær modellering av bindingsinteraksjonen mellom human rekombinant LDHA og CA (figur 3A,B). Resultatene viste at CA kan samhandle med restene av T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 og T247 av LDHA. Blant dem er R105, S136 og R168 kritiske for substrat (pyruvat)binding. Dermed antok vi at CA kan forstyrre substratbindingsstedene. Tvert imot er EGCG bundet til LDHA via et annet nettsted. For å verifisere virkemåten til LDHA-hemming av CA ytterligere, ble Michaelis-Menten og Lineweaver-Burk-plottene bekreftet med forskjellige konsentrasjoner av pyruvat og CA. LDHA-aktiviteten ble økt på en pyruvatdoseavhengig måte. Det ble imidlertid reversert av økningen av CA. Resultatene fra Michaelis-Menten og Lineweaver-Burk plott viste at CA er en ikke-konkurrerende hemmer av LDHA (Figur 3C, D). I tillegg viste isotermisk titreringskalorimetri (ITC) data at CA binder seg fysisk til LDHA med en Kd. verdi på 197 uM (tilleggsfigur S8). Disse resultatene gir innsikt i at CA undertrykker LDHA-aktivitet gjennom å binde substratbindingsstedet til LDHA.
2.4. CA gjensensibiliserer 5FU-resistens ved å redusere LDHA-aktivitet
Vi evaluerte de cytotoksiske effektene av CA på SNU620- og SNU620/5FU-celler og fant at CA undertrykte vekst i begge cellegruppene (Figur 4A). For å verifisere at vekstinhiberingen var relatert til undertrykkelsen av LDHA-aktivitet, ble ekspresjonen av LDHA opphevet av kort hårnålsribonukleinsyre (shRNA) for LDHA (shLDHA) og dens ekspresjon ble gjenvunnet ved transfeksjon LDHA-uttrykkende plasmid (tilleggsfigur S9A, B ).I shLDHA-transfekterte SNU620/5FU-celler ble ikke laktatproduksjonen og cellelevedyktigheten markant endret ved CA-behandling, sammenlignet med disse av falske transfekterte celler (Figur 4B, C). I tillegg var den vekstinhiberende effekten av CA. økt ved gjenvinning av LDHA-ekspresjon i LDHA-knockdown SNU620/5FU-celler (Figur 4D). Videre ble SNU620- og SNU620/5FU-celler undersøkt etter behandling av CA og 5FU individuelt eller kombinasjonen av begge. Samtidig behandling med CA og 5FU hemmet betydelig veksten av SNU620/5FU-celler (figur 4E). I tillegg ble kombinasjonseffekter av CA og 5FU undersøkt i flere andre cellelinjer, som human gastrisk kreft AGS, pankreascancer Panic-1, MIA PaCa-2 og tykktarmskreft LS174T og RKO celler, sammenlignet med SNU620 og SNU620/5FU-celler. Laktatproduksjonen og LDHA-ekspresjonen viste en god korrelasjon med hverandre, og disse glykolytiske egenskapene er relativt høye i SNU620/5FU, AGS og RKO (tilleggsfigur S10A, B). Dessuten reduserte kombinasjonsbehandlingen av CA og 5FU betydelig levedyktigheten til celler, sammenlignet med en enkelt behandling av 5FU i glykolytiske celler inkludert AGS og RKO (tilleggsfigur S10C). Imidlertid hemmet samtidig behandling med CA og 5FU ikke signifikant vekst i SNU620-, Panic-1-, MIA PaCa-2- og LS174T-celler, som viste lave LDHA-uttrykk. Disse resultatene antydet at den sensibiliserende effekten av CA overfor 5FU-resistente celler kan være relatert til dens hemmende effekt på LDHA-aktivitet.
Figur 2. Catechin(CA) hemmer LDHA-aktivitet, men ikke uttrykket:(A)laktatproduksjon av SNU620/5FU ble målt etter behandling med CA-derivater (10 μM) i 24 timer; (B) in vitro LDHA-aktivitet ble evaluert ved behandling med CA-derivater (10 uM) og oksamat (20 mM); (C, D) in vitro, LDHA- og LDHB-aktiviteter ble estimert med de angitte konsentrasjonene av CA; (E, F) cellene ble behandlet med angitte konsentrasjoner av CA i 24 timer. Intracellulære LDHA- og LDHB-aktiviteter ble målt ved å bruke cellelysatene som en enzymkilde. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SEM. **s<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
Figur 4. Cellelevedyktighet ble hemmet ved samtidig behandling med katekin (CA) og 5-fluorouracil (5FU) i 5FU-resistente celler:(A) levedyktigheten til SNU620- og SNU620/5FU-celler ble vurdert etter behandling med de angitte konsentrasjonene av CA i 48 timer; (B) SNU620/5FU-pLKO.1- og SNU620/5FU-shLDHA-celler ble behandlet med CA (10 μM) i 24 timer. Laktatproduksjonen ble målt i kulturmediene til SNU620/5FU-pLKO.1- og SNU620/5FU-shLDHA-celler; (C, D)SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA pluss EV , og SNU620/5FU-shLDHA pluss LDHA#2-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjonene av CA i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved å bruke en MTT-analyse; (E) SNU620- og SNU620/5FU-celler ble behandlet med CA (10 μM) og/eller 5FU (10μM) i 48 timer. Levedyktigheten til disse cellene ble målt via MTT-analyse. Resultatene er vist som gjennomsnitt±SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
Denne artikkelen er hentet fra Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms
