Genkloning, funksjonell identifikasjon, strukturell og ekspresjonsanalyse av sukrosesyntase fra Cistanche Tubulosa Ⅱ

Resultater og analyse

1 Utvinning av sukrosesyntasegener i Cistanche tubulosa og kloning av CtSus-genet

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>antenne del.

Høykvalitets Cistanche Tubulosa for menns helse

Derfor ble ekspresjonsnivået FPKM-verdier for de to kandidatsukrosesyntasegenene oppnådd i den første screeningen i transkriptomdataene til forskjellige deler av Cistanche tubulosa normalisert ved Z-Score og differensialanalyse ble utført (figur 1A). Resultatene viste at CtSus-genet hadde det høyeste ekspresjonsnivået i haustoriet, og ekspresjonsnivået i den underjordiske delen var høyere enn det i luftdelen, noe som stemte overens med akkumuleringsmønsteret av glykosidforbindelser i forskjellige deler av Cistanche tubulosa, mens ekspresjonsnivået til CtSus1-genet i haustoriet var lavt. Derfor, basert på resultatene ovenfor, ble CtSus-genet valgt for påfølgende sekvensamplifisering, eksogen ekspresjon og funksjonell identifikasjon. Ved å bruke Cistanche tubulosa cDNA som en mal ble et enkeltbåndsprodukt oppnådd ved ~2500 bp etter PCR-amplifikasjon (figur 1B). PCR-produktet ble utvunnet fra gel og ligert til kloningsvektoren, og den full-lengde kodende regionen til målgenet ble oppnådd ved sekvensering. Lengden på CtSus-sekvensen var 2418 bp.

Figur 1. Genutforskning og kloning av CtSus fra C. tubulosa og bioinformatisk analyse av det kodede proteinet. A: Ekspresjonsnivåer av CtSus- og CtSus1-genene i forskjellige deler av C. tubulosanormaliserte som Z-score basert på deres FPKM-verdier; B: Genamplifikasjon av CtSus; M: DNA-markør;C: Konservativt domene av CtSus-protein forutsagt av SMART; D: Multippel sekvensjustering av CtSus og sukrosesyntaser identifisert fra andre planter inkludert Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum og Albuca bracteata. Sukrosesyntesedomenet og sukkeroverføringsdomenet er representert med henholdsvis røde og blå bokser; E: Fylogenetisk analyse av CtSus og sukrosesyntaser fra andre planter; F: SDS-PAGE-analyse av det heterologe uttrykket av CtSus ved bruk av pCold™ I vektor i E. coli. Bane 1: Proteinmarkør; Bane 2: Supernatantfraksjon; Bane 3: Presipitatfraksjon. Den røde pilen viser CtSus-proteinet. G: Koloni-PCR av en enkelt klon som inneholder begge to rekombinante plasmider. M: DNA-markør; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Tabell 2 Aminosyresekvenslikheter mellom CtSus og sukrosesyntaser identifisert fra andre planter

2.3 Fylogenetisk analyse

Det fylogenetiske treet konstruert av MEGA-programvare ble brukt til å analysere det fylogenetiske forholdet mellom sukrosesyntasen CtSus fra Cistanche tubulosa og andre planteavledede sukrosesyntaser. Resultatene er vist i figur 1E. Planteavledede sukrosesyntaser viser distinkte evolusjonære grener i tofrøbladede (region I og II) og monokotyler (region III). CtSus er i den tobladede grenen, og sekvensene som er nærmest beslektet med CtSus er alle fra Lamiaceae-planter (Cistanche tubulosa er en Lamiaceae Orobanchaceae-plante), mens den andre grenen hovedsakelig er sammensatt av Solanales-planter, noe som ytterligere indikerer den høye bevarings- og homologi av planteavledede sukrosesyntasegener i utviklingen av planter i samme rekkefølge. Blant dem er sukrosesyntasen PrSus (AEN79500.1) fra Phelipanche ramosa fra Orobanchaceae-planten nærmest beslektet med CtSus.

3 Eksogent uttrykk og aktivitetsanalyse av CtSus

3.1 Eksogent uttrykk av CtSus-genet pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus og pCold™ I-CtSus-plasmidene verifisert ved sekvensering ble overført til den ekspresjonskompetente E. coli Transetta (DE3), og de positive klonene ble screenet ved koloni-PCR for sekvenseringsverifisering. De oppnådde rekombinante ekspresjonsstammene ble indusert av IPTG lav temperatur for proteinekspresjon, bakteriene ble samlet ved sentrifugering, og lyseringsbufferen ble tilsatt for å bryte bakteriene for å oppnå supernatanten og bunnfallet, og SDS-PAGE ble utført for deteksjon. Resultatene viste at når pET-28a og pET-24b ble brukt som ekspresjonsvektorer, ble ikke CtSus uttrykt i E. coli, mens når pCold™ I ble brukt som ekspresjonsvektor, en klar CtSus rekombinant proteinbånd ble påvist i ~100 kDa-regionen, som var i samsvar med dets teoretisk forutsagte relative molekylmasse på 92,2 kDa (figur 1F).

3.2 Helcelletransformasjon

For å foreløpig verifisere den katalytiske funksjonen til CtSus, ble en co-ekspresjonsstamme av CtSus og glykosyltransferasegenet UGT71BD1 konstruert. UGT71BD1 ble klonet og identifisert fra Cistanche tubulosa og er en UDP-glukosyltransferase som i vid utstrekning kan akseptere aromatiske forbindelser som fenyletanoidglykosider, forskjellige typer flavonoider, stilben og kumarin som reseptorer og katalysere glukosyleringsreaksjonen til DP-hydroksyglucosegruppen ved bruk av UGT71BD1. som sukkerdonor [18]. Innføringen av CtSus kan teoretisk gi mer tilstrekkelig glykosyldonor UDP-glukose for glukosyleringsreaksjonen katalysert av UGT71BD1, og derved fremme reaksjonslikevekten for å bevege seg mot dannelsen av glykosyleringsprodukter, og dermed øke utbyttet av glykosyleringsprodukter. pCold™ I-CtSus-plasmidet og pET-28a-UGT71BD1-plasmidet ble samtidig transformert til det ekspresjonskompetente E. coli Transetta (DE3). Enkelte kloner som inneholdt begge rekombinante plasmider ble screenet ved koloni-PCR, og positive rekombinante ekspresjonsstammer ble oppnådd ved sekvenseringsverifisering (figur 1G). Den doble gen-koekspresjonen ble indusert in vitro, og pET-28aUGT71BD1 enkeltgenekspresjonsstammen ble brukt som kontrollgruppe. Aktiviteten til CtSus for å katalysere genereringen av UDP-glukosedonor ble foreløpig verifisert ved helcelletransformasjon. Resultatene av HPLC og høyoppløselig massespektrometri viste at når helcelletransformasjonsreaksjon ble utført med aconitine 1 og resveratrol 2 som substrater, ble generering av åpenbare glykosyleringsprodukter oppdaget etter 24 timers transformasjon, som vist i figur 2.

Figur 2 Helcellebiotransformasjon av substrat 1 eller 2 ved henholdsvis rekombinant stamme som inneholder UGT71BD1 eller rekombinant stamme som inneholder UGT71BD1-kobling med CtSus. A: HPLC-kromatogrammer av helcellebiotransformasjonen av substrat 1. Deteksjonsbølgelengden var 360 nm; B: HRESI-MS og MS2-spektra av produkt la; C: HPLC-kromatogrammer av helcellebiotransformasjonen av substrat 2; Deteksjonsbølgelengden var 330 nm. D: HRESI-MS-spektra for produktene 2a og 2b

Når 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, molekylformel C9H6O4) ble brukt som substrat, den produktkromatografiske toppen 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, forutsagt molekylformel C15H16O9) ble detektert etter 5,39 minutter, noe som stemte overens med UV absorpsjon av underlaget og kontrollproduktet. Samtidig ble en fragmenttopp på m/z 179.033 4 [M+H]+ detektert i MS2-spekteret til 1a, som ble produsert ved at 1a mistet et glukosemolekyl (162 Da), noe som indikerer at 1a var produktet av substrat 1 koblet til et glukosemolekyl. Konverteringsraten ble beregnet ved å integrere topparealet. Det ble funnet at konverteringshastigheten til UGT71BD1-helceller som katalyserer substrat 1 for å generere glykosylert produkt 1a var 71,87 %, mens tilsetningen av CtSus økte omdannelseshastigheten til reaksjonen til 95,84 %, 1,3 ganger den for kontrollgruppen. Når substratet var forbindelse 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, molekylformel C14H12O3), produktkromatografiske topper 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, forutsagt molekylært formel C20H22O8) og 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, forutsagt molekylformel C26H32O13) i samsvar med den karakteristiske UV-absorpsjonen av substratet og kontrollproduktet ble påvist ved henholdsvis 10,32 og 6,52 min. . En fragmenttopp ble påvist ved 3 [MH]-, som ble generert ved tap av ett glukosemolekyl (162 Da), noe som indikerer at 2a var produktet av substrat 2 koblet til ett glukosemolekyl. Ved å sammenligne med dataene i litteraturen [18] og massespektrometriprediksjonsinformasjonen, ble det bestemt at produkt 2b var produktet av substrat 2 koblet til to glukosemolekyler. Konverteringsraten ble beregnet ved å bruke det integrerte topparealet. Det ble funnet at tilsetning av CtSus kunne øke konverteringshastigheten til glykosyleringsreaksjonen av substrat 2 fra 64,01 % til 78,51 %, blant hvilke utbyttet av monosakkaridprodukt 2a økte fra 45,09 % til 63,58 %, og utbyttet av disakkaridprodukt 2b endret fra 18,92 % til 14,93 %.

3.3 Rensing av CtSus rekombinant protein og identifisering av in vitro enzymatisk aktivitet

Resultatene fra hele celletransformasjonseksperimentet antyder at CtSus har aktiviteten til å katalysere produksjonen av aktiv glukosedonor UDP-glukose. For ytterligere direkte å bekrefte denne katalytiske aktiviteten gjennom in vitro enzymatisk katalytisk reaksjon, ble fusjonsproteinet til CtSus-genet i pCold™-ekspresjonssystem separert og renset ved affinitetskromatografi. Resultatene viste at når pCold™ I ble brukt som ekspresjonsvektor, ble det rekombinante proteinet uttrykt i store mengder, men mest i bunnfallet. Når pCold™ TF ble brukt som ekspresjonsvektor, ble CtSus-genet uttrykt i store mengder i E. coli (figur 3A). Fusjonsproteinet ble renset ved HisTrap FF affinitetskromatografi og utsatt for in vitro enzymatisk katalytisk reaksjon. Resultatene er vist i figur 3B. Når sukrose og UDP ble brukt som substrater, sammenlignet med den negative kontrollgruppen, ble en ny produkttopp påvist etter 10,32 min. Dens retensjonstid og UV-absorpsjon var i samsvar med UDP-glukose. Produktet ble bevist å være UDP-glukose ved sammenligning med standarden. Imidlertid, siden fusjonsproteinet uttrykt av pCold™ TF-ekspresjonsvektoren inneholder en stor utløserfaktorløselig tag (merkeproteinstørrelsen er 48 kDa), vil det ha stor innvirkning på den katalytiske aktiviteten til proteinet. Derfor ble merkelappen til fusjonsproteinet ytterligere kuttet av faktor Xa-enzym, og CtSus-proteinet uten eksogene merker ble renset (figur 3A). Proteinet ble utsatt for in vitro enzymatisk katalyse, og resultatene viste at utbyttet av UDP-glukose økte fra 3,53 % til 10,66 %.

(Figur 3B). Resultatene ovenfor bekreftet aktiviteten til CtSus i å katalysere produksjonen av UDP-glukose gjennom in vitro enzymatisk katalyse, og viste også at tilstedeværelsen av en stor affinitetsmerke bidrar til det oppløselige uttrykket av CtSus, men det vil også betydelig påvirke vitro katalytisk aktivitet av enzymet.

Figur 3 Heterologt uttrykk og funksjonell identifikasjon av CtSus. A: SDS-PAGE-analyse av CtSus-proteiner. Bane 1: Proteinmarkør; Bane 2: Rekombinant CtSus med triggerfaktor; Bane 3: Utløs faktor-tag-spalting ved å bruke Faktor Xa-protease for å gi CtSus-proteinet merket med den røde pilen. B: Enzymatiske invitroanalyser ved bruk av fusjonsprotein og triggerfaktorfrie CtSus-proteiner for å katalysere syntesen av UDP-glukose i nærvær av henholdsvis sukrose og UDP, med referansestandard UDP-glukose. Kokt protein ble brukt som kontrollgruppe under de samme betingelser. Deteksjonsbølgelengden var 260 nm