Synergistiske antiinflammatoriske effekter av Laminaria Japonica Fucoidan og Cistanche Tubulosa-ekstrakt

Som en immunrespons mot fremmede antigener frigjør makrofager pro-inflammatoriske cytokiner som tumornekrosefaktor- (TNF-), interleukin-1 (IL- 1), IL-6 og andre. Slike cytokiner induserer en kjemotaktisk tilstrømning av granulocytter, monocytter, lymfocytter og mastceller til skadet vev som fremmer antigenfjerning og vevsgjenoppretting. Imidlertid forverrer overdreven infiltrasjon og aktivering av cellene vevsskader, noe som fører til ødem (vaskulær ekssudasjon) og smerte som er velkjente betennelsesfenomener.

TNF- er en viktig faktor for å indusere nitrogenoksidsyntase (iNOS) genuttrykk i flere cellelinjer. iNOS-aktivering fører til produksjon av nitrogenoksid (NO) som ikke bare modulerer flere fysiologiske funksjoner som bakteriedrepende og vasodilatasjon, men også forårsaker betennelse. Etter vevsskade genererer nedbrytning av fosfolipaser av cellemembranfosfolipider arakidonsyre. Arakidonsyre dekomponeres videre av cyklooksygenase (COX) til prostaglandiner (PG). Overdreven mengde PGE2 dannet av COX-II induserer flere cytokiner for betennelse. Siden både NO og PGE2 fungerer som hovedfaktorer for inflammasjon og smerteinduksjon, er TNF- –NO- og COX-II-PGE2-veier hovedstrømmene i den inflammatoriske prosessen, som hemmes av kortikosteroider og ikke-steroide.anti-inflammatoriske legemidler(NSAIDs), henholdsvis.

Selv om det finnes flere steroider og NSAIDs forterapi av inflammatoriske sykdommer, kan disse legemidlene gi opphav til uønskede effekter på immunsystemet, mage-tarmkanalen, nyrene, leveren, sentralnervesystemet, blodtrykket og det kardiovaskulære systemet. Derfor er det nødvendig å minimere de negative effektene av kjemiske medisiner ved å erstatte dem eller bruke dem i kombinasjon med naturlige produkter.

Fucoidan, et sulfatpolysakkaridkompleks fra tang som Laminaria japonica og Cladosiphon okamuranus bredt distribuert i mange land, har blitt brukt som terapeutika i orientalsk medisin i lang tid. I tidligere studier har det blitt påvist at fucoidan har antioksidativt, anti-koagulerende, anti-kreft ogantiinflammatoriske aktiviteter. Følgelig tiltrekker de gunstige effektene av fucoidan på inflammatoriske sykdommer, iskemi, immundysfunksjon og svulster etterforskernes oppmerksomhet. På den annen side,Cistanche tubulosa(CT) har også blitt mye brukt som en tradisjonell medisin i Kina. Det ble rapportert at CT-ekstrakter senker produksjonen av TNF-á og IL- 4 som er viktige faktorer for NO-produksjon i inflammatoriske veier [19].

Slike tidligere funn førte til at vi undersøkte kombinasjonseffekten av fucoidan og CT-ekstrakt på de to hovedveiene for betennelse. For å belyse virkningsmekanismen analyserte vi NO og PGE2 i eksudatene fra karragenan-indusert luftposebetennelse.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FOREBYGGINGINFLAMMATORISKE AKTIVITETERPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materialer og metoder

Materialer

Halvrenset fucoidan og vannekstrakt av CT ble oppnådd fra Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Korea). Fucoidan og CT-ekstrakt ble holdt ved 4 grader, blandet (1:3) oppløst i renset vann før bruk, og oralt administrert i et volum på 5 ml/kg.

Cellekultur og NO kvantifisering

Den murine makrofagen RAW 264.7 cellelinjen ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, USA), og dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Sigma, St. Louis, USA) inneholdende 10 % føtalt bovint serum og antibiotika [100 U/mL penicillin (Sigma) og 100 µg/ml streptomycin (Sigma)]. Cellene ble inkubert i en fuktet 5 % CO2 atmosfære ved 37 grader.

For å vurdere effekten av fucoidan og CT-ekstrakt på utskillelsen av NO, ble RAW 264.7-celler (1×106 celler/ml) inkubert med fucoidan eller CT-ekstrakt (1–320 µg/ml) i 5 minutter , etterfulgt av interferon- (IFN-, 10 U/ml) og lipopolysakkarid (LPS, 10 µg/ml) i 24 timer. I våre foreløpige studier ble det bekreftet at behandling med IFN-pluss LPS for aktivering av RAW 264.7-celler ikke påvirket levedyktigheten til cellene i opptil 24 timer og at fucoidan og CT-ekstrakt ikke var cytotoksisk opp til 1 mg/ml. Konsentrasjonen av nitritt (NO2 – ), det oksiderte produktet av NO, ble målt som en indikator på NO. Kulturmediet ble blandet med et likt volum av Griess-reagens (1 % sulfanilamid, 0,1 % naftyletylendiamin i 2,5 % fosforsyre) [21], og inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. Nitrittkonsentrasjon ble analysert ved 540 nm, hvor NaNO2 ble brukt til å generere en standardkurve.

Dyr og behandling

ICR-hannmus (7 uker gamle) ble kjøpt fra Daehan Biolink (Eumseong, Korea), og plassert i et rom med konstante miljøforhold (22±2ºC; 40-70 % relativ fuktighet; 12-timers lys -mørk syklus; 150-300 lux lysstyrke). Pelletsfôr og renset vann var tilgjengelig ad libitum. Alle dyreforsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Chungbuk National University (CBNU), Korea, og utført i henhold til Standard Operation Procedures (SOP) til Laboratory Animal Research Center, CBNU.

Musene (n=8/gruppe) ble oralt behandlet med fucoidan (18 eller 54 mg/kg), CT-ekstrakt (54 eller 162 mg/kg), eller deres blanding (18+54, {{6 }} eller 90+270 mg/kg) én gang daglig i 7 dager. Lave doser fucoidan (18 mg/kg) og CT-ekstrakt (54 mg/kg) kom fra estimerte humane doser på 100 mg/kropp (70 kg) og 300 mg/kropp etter overflateoversettelse av kroppsvekt (Km{{14 }} for henholdsvis menneske/Km=3 for mus). Høye doser fucoidan og CT-ekstrakt ble satt til 3 ganger, alene eller i blanding, og den høyeste doseblandingen ble fiksert til 5 ganger for å vurdere maksimale synergistiske effekter.

På den første dagen av fucoidan- og CT-ekstraktbehandling ble mus subkutant injisert med 10 ml steril luft på baksiden for å danne en pose [22,23]. Etter 2 og 5 dager ble posen injisert på nytt med 5 ml luft. En time etter den siste behandlingen ble 1 ml karragenan (1 % i saltvann; Sigma) eller bæreren (saltvann) injisert i posen.

Analyser av eksudatene

Luftposen ble vasket med 1 ml kald saltvann 6 timer etter karragenaninjeksjon, og nettovolumet av skyllevæske ble registrert. Totalt antall inflammatoriske celler, nøytrofiler, monocytter og lymfocytter ble bestemt ved bruk av en skjærteller. Konsentrasjonene av NO og PGE2 ble bestemt med henholdsvis Griess-reagens (Sigma) og enzymimmunoassay (EIA) ved bruk av et Correlate-EIA-sett (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR BLOKKERING AV INFLAMMATORISK CELLEKJEMOTAKSIS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatologisk undersøkelse

Vev for posen ble fjernet og fiksert i en nøytral formalinløsning. Parafininnstøpte vevsglass ble farget med hematoxylin-eosin, og undersøkt under et lysmikroskop for inflammatoriske lesjoner.

Statistisk analyse

Resultatene presenteres som gjennomsnitt±SE. Eksperimentelle gruppesammenligninger ble gjort ved enveis variansanalyse etterfulgt av en Tukeys testkorreksjon. AP-verdi<0.05 was considered statistically significant.

Resultater

In vitro økte RAW 264.7 cellekultur, IFN- og LPS-behandling i stor grad NO-produksjonen (figur 1). Forbehandling med fucoidan (1–320 µg/ml) påvirket ikke NO-frigjøringen fra makrofagcellelinjen (figur 1A). Til sammenligning undertrykte CT-ekstrakt (32–320 µg/ml) NO-produksjonen betydelig, noe som tyder på en antiinflammatorisk aktivitet (figur 1B).

Injeksjon av karragenan i museluftposen økte ekssudatvolumet i posen markant (figur 2). Slik økt ekssudasjon ble dempet ved behandling med fucoidan (18 mg/kg) og CT-ekstrakt (54 og 162 mg/kg). Spesielt reduserte kombinasjonsbehandlingen av fucoidan og CT-ekstrakt ekssudatvolumet ytterligere sammenlignet med de individuelle effektene, selv om høyere dosekombinasjoner (54+162 mg/kg og 90+270 mg/kg) ikke viste ytterligere effekt. til laveste dosekombinasjon (18+54 mg/kg) (Figur 2A). N grads spenning i posen økte også drastisk etter karragenaninjeksjon (figur 2B). Sammenlignet med den milde effekten av fucoidan, reduserte CT-ekstrakt N-gradskonsentrasjonen markant. Kombinasjonsbehandling av fucoidan og CT-ekstrakt reduserte NO-nivået ytterligere på en doseavhengig måte. Tilsvarende ble det økte PGE2-innholdet synergistisk undertrykt av kombinasjonsterapien av fucoidan og CT-ekstrakt (figur 2C).

Parallelt med de inflammatoriske mediatorene i posen økte antallet inflammatoriske celler drastisk ved karragenaninjeksjon: 37,8, 4,8 og 24,1 ganger kontrollnivåer for henholdsvis nøytrofiler, monocytter og lymfocytter (tabell 1). Fucoidan og CT-ekstrakt reduserte imidlertid den inflammatoriske celleinfiltrasjonen betydelig, der fucoidan var noe overlegen CT-ekstrakt. Uventet ble ingen synergistisk effekt i inflammatorisk celleinfiltrasjon oppnådd ved samtidig administrering av fucoidan og CT-ekstrakt.

Som utledet fra den inflammatoriske celleinfiltrasjonen i eksudatene, viste det subkutane vevet rundt luftposer alvorlige inflammatoriske lesjoner (figur 3). Enormt mange celler i det fortykkede subkutane vevet eksponert for Carrageenan ble observert (Figur 3B), sammenlignet med de nesten normale funksjonene hos kontrolldyr (Figur 3A). Slike inflammatoriske lesjoner ble bemerkelsesverdig svekket ved behandling med fucoidan (figur 3C og 3D) eller CT-ekstrakt (figur 3E og 3F).

Spesielt ble høyere antiinflammatoriske effekter oppnådd ved kombinasjonsterapi med fucoidan og CT-ekstrakt (figur 3G-3I).

Diskusjon

Ved å bruke en in viv-grad arrageenan-indusert luftposebetennelsesmodell induserer injeksjon av luft i ryggen til gnagere spredning av celler som stratifiserer på overflaten av hulrommet for å danne en struktur som ligner på synovium. I denne modellen økte injeksjonen av karragenan-indusert inflammatorisk celleinfiltrasjon ekssudatet, noe som indikerer vaskulær lekkasje. Luftposen fungerer som et reservoar av inflammatoriske celler og mediatorer som enkelt kan måles i væsken som samler seg lokalt.

Blant de forskjellige inflammatoriske mediatorene som kan indusere vaskulær permeabilitet, er det velkjent at NO og PGE2 er viktige faktorer involvert i patogenesen til mange inflammatoriske sykdommer. De er også kjent som mediatorer av smerteinduksjon og persepsjon. iNOS, som uttrykkes og aktiveres i forskjellige celletyper ved stimulering med TNF- og/eller LPS under betennelse, produserer høye, vedvarende konsentrasjoner av NO. NO er ​​et viktig regulatorisk molekyl i forskjellige fysiologiske funksjoner, slik som vasodilatasjon som fører til vaskulær lekkasje. PGE2, som genereres fra arakidonsyre via COX, bidrar til utviklingen av mange inflammatoriske sykdommer, og overproduksjon av PGE2 som respons på ulike inflammatoriske stimuleringer er assosiert med oppregulering av COX-II-nivåer og progresjon av betennelse. Derfor har TNF- - NO- og COX-II-PGE2-veier blitt betraktet som to hovedstrømmer av inflammatoriske prosesser, som blokkeres av inhibitorer av henholdsvis iNOS (kortikosteroider) og COX (NSAIDs).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBUD AV BETENNELSESSYKDOMMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

I denne studien reduserte samtidig administrering av fucoidan og CT-ekstrakt ekssudatvolumet i posen, noe som tyder på at de har undertrykkende aktivitet mot vaskulær lekkasje (figur 2A). Sammenlignet med de individuelle effektene av hver fucoidan- og CT-ekstrakt, økte kombinasjonsbehandlingen ytterligere, noe som antyder at to-graden forsterker handlingen synergistisk. Slike synergistiske effekter mellom fucoidan og CT-ekstrakt ble støttet av deres aktiviteter på NO- og PGE2-nivåene i ekssudatene (figur 3B og 2C).

Interessant nok ble det imidlertid bekreftet at fucoidan ikke direkte hemmer aktiveringen av makrofager in vitro-analyse (figur 1A). Tilsvarende var det hemmende potensialet til fucoidan på NO- og PGE2-akkumulering in vivo-analysen relativt lavere enn for CT-ekstrakt (figur 2B og 2C). En slik virkningsmekanisme til fucoidan er forskjellig fra en direkte inaktivering av cellene med CT-ekstrakt (figur 1B). Til sammenligning utøvde fucoidan en høy effekt på hemming av inflammatorisk celleinfiltrasjon i posene (tabell 1). Fucoidan var overlegen CT-ekstrakt når det gjaldt å blokkere migrasjonen av nøytrofiler, monocytter og lymfocytter til de karragenan-induserte vevsskadestedene. Interessant nok var det ingen synergistisk anti-migrasjonseffekt, noe som tyder på ulike virkningsmekanismer mellom fucoidan og CT-ekstrakt: dvs. fucoidan blokkerer infiltrasjon av inflammatoriske celler, mens CT-ekstrakt hemmer aktivering av cellene.

Polymorfonukleære celler, spesielt nøytrofiler, er de viktigste cellulære komponentene som rekrutteres til akutte inflammatoriske steder indusert av karragenan. I tillegg spiller påfølgende inflammatoriske celler som makrofager og lymfocytter også sentrale roller i den inflammatoriske prosessen ved å utskille cytokiner. Når det ble forbehandlet med fucoidan eller CT-ekstrakt, ble antallet hvite blodlegemer som migrerte inn i de karrageenaninjiserte luftposene markert undertrykt. Dette resultatet stemte overens med en effekt som ville oppnås av kortikosteroider som deksametason, men ikke av NSAIDs inkludert indometacin. Derfor antas det at fucoidan og CT-ekstraktet delvis har en egenskap til steroider.

I tillegg til den blokkerende virkningen på inflammatorisk cellekjemotaksi, syntes CT-ekstrakt å undertrykke aktiveringen av makrofager. Dette ble bekreftet av dets hemmende virkning på NO in vitro og in vivo, som er den viktigste inflammatoriske mediatoren produsert av makrofager. Dermed kan effekten av CT-ekstrakt på makrofager skyldes en undertrykkelse av mRNA-ekspresjon og/eller en direkte hemming av iNOS-aktivitet i disse cellene.

PGE2 er også en av de viktigste inflammatoriske mediatorene. Den øker parallelt med vevsødem, som undertrykkes av NSAIDs, hemmere av COX. Karragenan kan øke PGE2-produksjonen ved å indusere COX-II mRNA og COX-II protein i poseekssudatet. I denne modellen økte karragenan betydelig mengden PGE2, og det ble vesentlig undertrykt av CT-ekstrakt. Det er interessant å merke seg at dette resultatet stemte overens med en effekt som ville oppnås med et NSAID indometacin. Derfor utledes det fra resultatene at CT-ekstrakt har ytterligere egenskaper til NSAIDs. Samlet antas det at CT-ekstrakt utøvde både kortikosteroid- og NSAID-lignende effekter i den karragenan-induserte betennelsesmodellen, og at fucoidan forbedretantiinflammatoriske effekter av CT-ekstraktved å blokkere inflammatorisk celleinfiltrasjon.

Selv om å definere den eksakte virkningsmekanismen krever ytterligere studier, svekket en blanding av fucoidan og CT-ekstrakt markant betennelsestegn ved å blokkere TNF- –NO og COX-II-PGE2-veiene i karrageenan-indusert luftposebetennelse. Disse funnene gir bevis på at kombinasjonsbehandling av fucoidan og CT-ekstrakt kan være en lovende kandidat for lindring av ulike typer betennelser som reagerer på kortikosteroider eller NSAIDs.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBUD AV BETENNELSESSYKDOMMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%