Målrettet neste generasjons sekvensering identifiserer patogene varianter ved diabetisk nyresykdom

Resultater

Studiekohorter

To hundre og seks pasienter medCKD, inkludert 97NDKDpasienter og 109DKDpasienter, fra Utah Kidney Study, ble vellykket sekvensert ved hjelp av et tilpasset genpanel. Medianalderen for NDKD- og DKD-pasienter inkludert i denne studien var henholdsvis 47,9 og 62.0. Flertallet av pasientene i vår NDKD-kohort (56,7 prosent) hadde en klinisk diagnose glomerulopati, 20,6 prosent hadde cystisk nyresykdom, 5,2 prosent hadde medfødt nyresykdom og 4,1 prosent hadde tubulointerstitiell sykdom. Omtrent 13 prosent av disse pasientene hadde andre former for NDKD. Alle diabetespasienter inkludert i denne studien hadde en diabetesdiagnose som var før diagnosen deres CKD og hadde diabetes oppført som den primære årsaken til CKD i deres EMR. Blant disse pasientene hadde 80,7 prosent diagnosen T2D og 76,1 prosent ble behandlet med insulin da de ble registrert i Utah Kidney Study. Trettiåtte prosent av NDKD-pasientene og nesten 34 prosent av DKD-pasientene rapporterte at de hadde en førstegradsslektning med nyresykdom.

Målrettet NGS av nyresykdomsrelatert gen

Ved å bruke vårt målrettede sekvenseringspanel identifiserte vi 1 259 sjeldne, funksjonelle varianter (dvs. ikke-synonyme, stoppgevinst/tap, spleising, innsetting/sletting av rammeskift og innsetting/sletting i rammen) i 345 nyresykdomsrelaterte gener blant de 2{ {8}}6 pasienter inkludert i denne studien. Av disse variantene ble 63 (5,0 prosent) klassifisert som patogene eller sannsynlig patogene ved bruk av ACMG-AMP-retningslinjene; de resterende variantene ble klassifisert som 'varianter av ukjent betydning' (VUS) (n=1,024; 81,3 prosent ) eller godartede/sannsynlige godartede varianter (n=172; 13,7 prosent ).

Diagnostiske varianter i nyresykdomsrelaterte gener hos NDKD-pasienter

Totalt ble patogene eller sannsynlige patogene varianter identifisert hos 35 av de 97 NDKD-pasientene (36 prosent) inkludert i vår studie. Vi identifiserte 17 diagnostiske varianter (dvs. patogene eller sannsynlige patogene varianter i samsvar med arvemønsteret assosiert med pasientens kliniske diagnose), inkludert 13 nye varianter (76,5 prosent) som ikke er til stede i gnomAD-databasen, hos 18 NDKD-pasienter (18,6 prosent ) inkludert i vår studie. Disse patogene eller sannsynlig patogene enkeltnukleotid- og innsettings-/delesjonsvariantene ble påvist i 7 gener (CFH, COL4A3, COL4A5, GLA, PAX2, PDK1 og PDK2). PKD1 og PKD2 var genene med høyest byrde av kandidatdiagnostiske varianter.

Det diagnostiske utbyttet var høyest (9 av 20; 45,0 prosent) hos pasienter diagnostisert med cystisk nyresykdom. Totalt 9 pasienter bar diagnostiske varianter i PKD1 eller PKD2, gener kjent for å være årsak til autosomal dominant polycystisk nyresykdom (ADPKD); 8 av de identifiserte PKD1/PKD2-variantene var fraværende i populasjonsdata. Ytterligere fem pasienter med cystisk nyresykdom hadde nye VUS-er i PKD1 eller PKD2 som er spådd å være skadelig ved bruk av beregningsbaserte prediksjonsverktøy. Selv om disse variantene ikke oppfyller strenge ACMG-AMP-kriterier for å klassifisere disse som klinisk signifikante, har de støttende bevis på patogenisitet. Ytterligere undersøkelse av disse variantene, inkludert segregeringsanalyse og funksjonelle analyser, sammen med denne beregningsstøtten, kan ytterligere øke det diagnostiske utbyttet av genetisk screening hos pasienter med cystisk nyresykdom som er inkludert i denne studien.

I tillegg identifiserte vi APOL1-risikoalleler (G1: p.Ser342Gly og p.Ile384Met og/eller G2: p.Asn388_Try389del) hos 2 afroamerikanske NDKD-pasienter med kliniske diagnoser av glomerulonefritt (G1/G1-genotype) og hypertensiv nefropati (henholdsvis G1/G2-genotype).

Omklassifisering av nyresykdomsdiagnoser hos NDKD-pasienter basert på genetiske diagnoser— Sekvensering av nyresykdomsrelaterte gener hos 4 NDKD-pasienter

(4,1 prosent ) tillot oss å identifisere varianter som stemmer overens med genetiske diagnoser som skilte seg fra deres dokumenterte kliniske diagnoser. Blant disse pasientene identifiserte vi en stor homozygot sletting av NPHP1 hos en pasient diagnostisert med antinøytrofil cytoplasmatisk antistoff-assosiert (ANCA) vaskulitt etter en nyrebiopsi, som utgjorde omtrent 80 prosent av pasientene med denne sykdommen, noe som tyder på at denne personen kan ha to samtidige nyresykdommer (dvs. familiær juvenil nefronoftise og ANCA-vaskulitt). Tilsvarende ble 1 pasient diagnostisert med PKD funnet å ha en diagnostisk variant i COL4A3 (p.R1661C). Denne samme varianten, selv om den er sjelden i befolkningen (MAF=3.6×10−4), ble observert hos ytterligere 2 pasienter i vår studie (en pasient med medfødt nefrotisk syndrom og en pasient diagnostisert med DKD) og har tidligere blitt observert hos pasienter med FSGS og autosomalt recessivt Alport-syndrom (MIM 104200). For hver av disse pasientene er deres genetiske diagnose mer konsistent med glomerulær sykdom, inkludert tynn basalmembrannefropati (TBMN), FSGS eller Alport syndrom.

Tilsvarende identifiserte vi en sjelden variant i GLA (p.A143T) hos en pasient med klinisk diagnose

med medfødt nyresykdom; denne varianten er tidligere rapportert å være patogen hos pasienter med Fabrys sykdom (MIM 301500). Til slutt ble 1 pasient diagnostisert med IgA nefropati funnet å bære sjeldne sammensatte heterozygote varianter i IFT122 (p.R166W og p.R779X), som er kjent for å bidra til ciliær dysfunksjon og cystisk nyresykdom.

Sjeldne varianter i nyresykdomsrelaterte gener hos pasienter med DKD— Ved å bruke ACMG-AMP-retningslinjene for å klassifisere varianter i de samme nyresykdomsrelaterte genene, ble patogene eller sannsynlige patogene varianter identifisert hos 22,0 prosent (24 av 109) av DKD-pasientene inkludert i denne studien (tabell 2B). Andelen varianter var lik blant både T1D- og T2D-pasienter (henholdsvis 19 prosent mot 23 prosent; p-verdi > 0.05). Selv om det ikke er statistisk signifikant, rapporterte nesten en tredjedel av DKD-pasienter (27,0 prosent) som hadde en patogen eller sannsynlig patogen variant en familiehistorie med nyresykdom, sammenlignet med bare 19,4 prosent av DKD-pasienter uten en kjent familiehistorie med nyresykdom. Totalt ble 29 patogene eller sannsynlige patogene varianter identifisert i 23 gener hos disse pasientene. C5orf42 (også kalt CPLANE1 og JBTS17) hadde den høyeste byrden av patogene eller sannsynlige patogene varianter blant disse pasientene.3

Interessant nok ble det funnet at 9 DKD-pasienter hadde sjeldne patogene eller sannsynlige patogene varianter i kjente ciliopatigener, inkludert DYNC2H1, INPP5E, XPNPEP3, NEK8 og C5orf42. Seks av variantene identifisert i disse genene er antatte tap-av-funksjon (pLOF) varianter som enten påvirker spleisesteder eller introduserer premature stoppkodoner (dvs. nonsensvarianter eller innsetting/sletting av rammeskift). Blant disse pasientene hadde 1 bialleliske varianter i C5orf42 (p.I165Yfs*17, en patogen variant, og p.S123F, en variant med støttende bevis på patogenisitet spådd å være skadelig av minst 5 av 6 beregningsmetoder), noe som tyder på at denne pasienten er sannsynligvis en sammensatt heterozygot bærer av skadelige varianter i dette genet.

Sjeldne diagnostiske NDKD-varianter identifisert i en undergruppe av DKD-pasienter—Tre DKD-pasienter (2,8 prosent) ble funnet å bære sjeldne varianter som tyder på at den underliggende årsaken til deres nyresykdom kanskje ikke er en konsekvens av deres diabetes. En pasient med CKD tilskrevet T2D ble funnet å ha en sjelden diagnostisk variant i AQP2 (p.N220T); et gen som forårsaker en autosomal dominant form for nefrogen diabetes insipidus, en tilstand preget av alvorlig polyuri. På samme måte ble en patogen REN-variant (p.R49X) identifisert hos en andre pasient med T2D. Patogene varianter i REN er assosiert med autosomal dominant tubulointerstitiell nyresykdom (ADTKD). Siden begge disse pasientene også har en historie med diabetisk retinopati, kan de ha samtidig DKD og NDKD. Til slutt ble 1 T2D-pasient funnet å bære en diagnostisk variant i COL4A3 (p.R1661C). Som nevnt ovenfor har denne varianten blitt observert hos pasienter med FSGS og autosomalt recessivt Alport syndrom. I motsetning til DKD-pasientene med AQP2- og REN-varianter, til tross for mer enn 35 år med diabetes, har ikke denne pasienten dokumentert bevis på retinopati eller nevropati, noe som ytterligere antyder at denne pasienten sannsynligvis har NDKD.

Genetisk byrde av sjeldne varianter i nyresykdomsrelaterte gener hos NDKD- og DKD-pasienter—We performed gene-based burden association tests to compare the rate of rare variants between NDKD and DKD patients aggregated within each gene. As expected, the most significant enrichment of rare pathogenic or likely pathogenic variants was observed in PKD1 among NDKD patients. Similarly, although not statistically significant (p-value >0.05), ble berikelsen av sjeldne patogene eller sannsynlige patogene varianter også observert i PKD2 blant NDKD-pasienter. Omvendt ble et overskudd av sjeldne varianter i C5orf42 sett hos DKD-pasienter.

Siden varianter klassifisert som VUS-er ved bruk av ACMG-AMP-retningslinjer ikke kan utelukkes som godartede, og sannsynligvis inkluderer patogene varianter, utvidet vi våre genbaserte belastningsanalyser til å inkludere sjeldne varianter med støttende bevis på patogenisitet basert på beregningsmetoder for prediksjon. Som vi ser i vår analyse av sjeldne patogene eller sannsynlige patogene varianter alene, observerte vi en overbelastning av sjeldne varianter i både PKD1 (p-verdi=0.01) og PKD2 (p-verdi=0.04 ) hos NDKD-pasienter. Sjeldne varianter i COL4A5 (p-verdi=0.008) ble også betydelig beriket i NDKD sammenlignet med DKD-pasienter. Interessant nok, i tillegg til å styrke assosiasjonen sett hos DKD-pasienter med sjeldne varianter i C5orf42 (p-verdi= 0.04), oppdaget denne analysen berikelse av sjeldne varianter hos DKD-pasienter i både ACE (p-verdi {{21 }}.008) og NEK8 (p-verdi=0.04).

Diskusjon/Konklusjon

Målet med denne studien var å undersøke nytten av NGS for å forstå det molekylære grunnlaget for nyresykdom hos pasienter med og uten diabetes. Mens genetisk testing har vist seg å hjelpe til med å gi mer nøyaktige diagnoser hos pasienter med arvelige former for nyresykdom, inkludert ADPKD, Alports syndrom og Fabrys sykdom, brukes den til pasienter medDKD, og dens nytte for å identifisere uventet nyresykdom hos pasienter diagnostisert med DKD, har vært begrenset. For å undersøke dette ytterligere, utførte vi målrettet NGS i totalt 206 pasienter med CKD, inkludert 97 NDKD og 109 DKD-pasienter, ved å bruke et tilpasset genpanel bestående av 345 nyresykdomsrelaterte gener. Vår analyse identifiserte diagnostiske varianter som stemte overens med den kliniske diagnosen til omtrent 19 prosent av NDKD-pasientene inkludert i denne studien. Mens en tredjedel av NDKD-pasientene ble funnet å bære patogene eller sannsynlige patogene varianter, som klassifisert av ACMG-AMP-retningslinjene, hadde mer enn 20 prosent av DKD-pasientene inkludert i denne studien lignende klassifiserte varianter (dvs. patogene eller sannsynlige patogene varianter). ) i de samme nyresykdomsrelaterte genene. Vi oppdaget genetiske varianter som tyder på NDKD hos omtrent 3 prosent av diabetespasientene inkludert i denne studien.

Flere av genene som ble funnet å bære patogene varianter iDKDpasienter, inkludert CUBN, PEX5, VDR og COL4A3, har tidligere vært involvert i diabetisk nefropati. Kodevarianter i CUBN, et gen uttrykt i den apikale børstekanten til proksimale tubuliceller, er kjent for å være assosiert med albuminuri. En nylig gjennomgående assosiasjonsstudie identifiserte en sjelden kodende variant i CUBN som var uavhengig av tidligere identifiserte vanlige varianter i dette genet og som hadde mer enn en 3.5- ganger sterkere effekt hos pasienter med diabetes i forhold til de uten diabetes . Tilsvarende har en multi-omics systembiologianalyse av Saito et al. fant at PEX5, en peroksisomal biogenesemarkør er assosiert med diabetisk nefropati via peroksisomal dysfunksjon og spiller en rolle i nedreguleringen av peroksisomrelaterte metabolitter. Mer nylig, som en del av den største genomomfattende assosiasjonsstudien på DKD til dags dato, identifiserte Juvenile Diabetes Research Foundations Diabetic Nephropathy Collaborative Research Initiative 16 genomomfattende signifikante loci assosiert med DKD; interessant nok er 2 av de beste signalene fra denne studien i kjente nyresykdomsrelaterte gener (COL4A3 og BMP7). COL4A3 koder for en viktig strukturell komponent av den glomerulære basalmembranen og er assosiert med arvelige nefropatier, inkludert Alport syndrom, FSGS og TBMN. Den sjeldne COL4A3-varianten ble identifisert hos 3 pasienter inkludert i vår studie (1 DKD- og 2 NDKD-pasienter) har tidligere blitt observert i en familie med biopsi-påvist FSGS, noe som tyder på at denne varianten kan bidra til nyresykdom uavhengig av diabetesstatus.

I nærvær av hyperglykemi, forårsaker defekter i flimmerhårens struktur eller funksjon strukturelle og funksjonelle endringer i nyrene, inkludert podocyttutsletting, interstitiell betennelse og proteinuri. Interessant nok ble det funnet at 25 prosent av DKD-pasienter var positive for patogene eller sannsynlige patogene varianter hadde sjeldne varianter i kjente ciliopati-assosierte gener, inkludert 3 pasienter som ble funnet å ha sjeldne pLOF-varianter i C5orf42, et gen som er assosiert med sjeldne autosomale recessive ciliopatier preget av cystisk nyresykdom. Tilsvarende identifiserte vi sjeldne, sannsynlige patogene varianter i XPNPEP3 hos 2 DKD-pasienter med ESRD; defekter i XPNPEP3 forårsaker nefronoftise-lignende nefropati, en cystisk nyresykdom som fører til ESRD. Til sammen antyder disse dataene at varianter i nyresykdomsrelaterte gener i sammenheng med diabetisk patofysiologi spiller en rolle i patogenesen av nyresykdom hos pasienter med diabetes.

Tidligere studier som undersøkte den diagnostiske nytten av genetisk testing iCKD found the overall diagnostic yield to be approximately 10 percent . Among patients with a clinical diagnosis of diabetic nephropathy, however, this was much lower (1.6 percent ). In contrast, we found that as many as 22 percent of DKD patients included in our study carry pathogenic or likely pathogenic in the kidney disease-related genes included on our gene panel. While the reason behind this discrepancy is unclear, it should be noted that nearly 70 percent of those found to have variants in our study had ESRD, suggesting that these variants may predispose diabetic patients to more severe kidney disease.

I tråd med data fra tidligere studier fremhever vår studie effektiviteten av genetisk testing for å identifisere den underliggende molekylære årsaken til sykdom hos pasienter med ulike former for NDKD. I tillegg til å tildele genetiske diagnoser som bekreftet flere NDKD-pasienters kliniske diagnoser, i en undergruppe av pasienter, var vi i stand til å identifisere sjeldne varianter som antydet at en re-evaluering av diagnosene deres er berettiget. For disse pasientene kan genetisk analyse ha hjulpet til å oppdage ukjente kliniske symptomer og bedre informert ledelsen av deres omsorg.

Vår studie har begrensninger som bør erkjennes. For det første inkluderte vår studie bare 206 pasienter. Til tross for sin beskjedne prøvestørrelse, er den den første som har undersøkt belastningen av sjeldne varianter i nyresykdomsrelaterte gener i DKD. Ikke bare fant vi at 22 prosent av disse DKD-pasientene bærer sjeldne varianter av disse genene, men for noen identifiserte vi en genetisk diagnose som tyder på at nyresykdommen deres sannsynligvis ikke var en konsekvens av deres diabetes, og derved fremhevet verdien av genetisk screening i å avdekke presise molekylære diagnoser. For det andre, selv om vi var i stand til å oppdage både kodende varianter og strukturelle omorganiseringer ved bruk av målrettet sekvensering, varianter i ikke-kodende regioner, som potensielt påvirker RNA-ekspresjon og/eller prosessering (f.eks. de som påvirker transkripsjonell undertrykkelse, eksonhopping og introninkludering) , ble ikke evaluert. Siden vår tilpassede fangstanalyse var begrenset til den kodende regionen og ekson-intron-grensene til genene som er inkludert på panelet vårt, kunne ikke varianter utenfor disse regionene, inkludert de i promoterregionene og andre ikke-kodende eller regulatoriske regioner, oppdages ved å bruke denne analyse. For det tredje, for å øke spesifisiteten, fulgte vi ACMG-AMP-standardene og retningslinjene for varianttolkning, og som sådan ble mange av variantene identifisert i vår studie merket som VUS-er og ikke korrelert med kliniske fenotyper. Siden VUS-er ikke fullt ut kan utelukkes som godartede, kan dette ha påvirket sensitiviteten til studien vår. Beregningsprediksjonsalgoritmer kombinert med støtte fra funksjonelle studier kan bidra til å bedre forstå patogenisiteten til VUS-er og prioritere disse for videre studier.

Målet vårt var å utnytte NGS-teknologi for å bedre forstå den genetiske grunnen til nyresykdom hos pasienter med diabetes. Selv om de fleste diabetespasienter inkludert i vår studie ikke ble funnet å ha patogene/sannsynlige patogene varianter i nyresykdomsrelaterte gener, ble det funnet at en ikke-triviell andel (mer enn 20 prosent) hadde varianter som vi mistenker bidrar til sykdommen deres. Våre funn tyder på at sjeldne varianter av gener som ikke tidligere er knyttet til DKD (f.eks. ciliopatiegener) kan bidra til DKD-følsomhet og at genetisk screening hos pasienter med DKD kan bidra til å gi en molekylær diagnose som kan oversettes til forbedret presisjonsdiagnostikk og hjelpe til med prognosen og langsiktig forvaltning av deresnyresykdom.

Tilleggsmateriale

Se nettversjonen på PubMed Central for tilleggsmateriell.

Anerkjennelser

Forfatterne anerkjenner støtte fra National Kidney Foundation (MGP) og Larry H. og Gail Miller Family Foundation Diabetes Initiative (MGP).

Finansieringskilder

Denne studien ble delvis finansiert av National Kidney Foundation of Utah og Idaho (MGP) og Larry H. and Gail Miller Family Foundation Diabetes Initiative (MGP).

Referanser

17. Karczewski KJ, Francioli LC, Tiao G, Cummings BB, Alföldi J, Wang Q, et al. Variasjon på tvers av 141 456 humane eksomer og genomer avslører spekteret av tap-av-funksjon intoleranse på tvers av humane proteinkodende gener. bioRxiv. 2019.

18. Li Q, Wang K. InterVar: Clinical Interpretation of Genetic Variants by the 2015 ACMG-AMP Guidelines. Am J Hum Genet. 2017;100(2):267–80. [PubMed: 28132688]

37. Zivna M, Hulkova H, Matignon M, Hodanova K, Vylet'al P, Kalbacova M, et al. Dominante reningenmutasjoner er assosiert med tidlig oppstått hyperurikemi, anemi og kronisk nyresvikt. Am J Hum Genet. 2009;85(2):204–13. [PubMed: 19664745]

52. Renkema KY, Stokman MF, Giles RH, Knoers NV. Neste generasjons sekvensering for forskning og diagnostikk innen nyresykdom. Nat Rev Nephrol. 2014;10(8):433–44. [PubMed: 24914583]

SPØR OM MER:david.deng@wecistanche.com