De avgjørende rollene til TRPM6 i den sirkadiske reguleringen av blodtrykk
Mar 19, 2022
Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Betydningen av den renale ionekanalen TRPM6 i døgnutskillelsen av renin for å øke blodtrykket
Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto og Hiroaki Miki
Blodtrykkhar et daglig mønster, med høyere verdier i den aktive perioden. Forhøyelsen ved begynnelsen av den aktive perioden øker risikoen for dødelige kardiovaskulære hendelser betydelig. Reninsekresjon stimulert av renale sympatiske nevroner anses som essensiell for denne prosessen; dens reguleringsmekanisme er imidlertid stort sett ukjent. Her viser vi viktigheten avforbigående reseptorpotensial melastatin-relatert 6 (TRPM6), en Mg2 pluss-permeabel kationkanal, for å øke reninsekresjonen i den aktive perioden.TRPM6ekspresjonen er betydelig redusert i den distale kronglete tubulen til mus med hypotensive Cnnm2-mangel. Vi genererer nyrespesifikkeTRPM6-mangelfulle mus og observere en nedgang iblodtrykkog en forsvinning av dens døgnvariasjon. Konsekvent økes ikke reninsekresjonen i den aktive perioden. Videre oppheves reninsekresjon etter farmakologisk aktivering av -adrenoreseptor, målet for neuronal stimulering, og reseptorekspresjonen reduseres i renin-utskillende celler. Disse resultatene indikerer de avgjørende rollene tilTRPM6 i døgnreguleringen avblodtrykk.
Omtrent én milliard mennesker over hele verden anslås å ha hypertensjon, noe som øker risikoen for ulike sykdommer betydelig, inkludert potensielt dødelige sykdommer, som iskemisk hjertesykdom og hjerneslag. Disse hypertensjonsrelaterte fatale hendelsene er kjent for å forekomme ofte tidlig om morgenen, i begynnelsen av den aktive perioden nårblodpressstiger kraftig. Reninsekresjon utløst av nyre sympatiske nevroner anses å spille en avgjørende rolle i detteblodtrykkhøyde, men dens reguleringsmekanisme er ikke godt forstått².
Det er allment akseptert at noen kostholdsmineraler, spesielt natrium og kalium, spiller viktige roller i kontrollen avblodpress. Magnesium er et viktig essensielt element involvert i en rekke biologiske aktiviteter. Epidemiologiske studier har vist et signifikant omvendt forhold mellom magnesiumnivåer i kosten og risikoen for hypertensjon3-6. Dessuten er urinutskillelse av magnesium, som antas å være i omtrentlig likevekt med intestinal magnesiumabsorpsjon, omvendt korrelert med risikoen for hypertensjon. Disse funnene tyder på en nær sammenheng mellom organismal magnesiumhomeostase ogblodtrykkregulering, som fremhever betydningen av Mg2 pluss-kanaler og/eller transportører i reguleringen avblodtrykk.
En stor mengde magnesium blir stadig reabsorbert i nyrene. Mesteparten av magnesium i det glomerulære filtratet blir reabsorbert i den tykke stigende delen av Henles løkke, men det siste trinnet med reabsorpsjon skjer ved distale convoluted tubuli (DCT)8. Den sistnevnte prosessen er tett regulert for å justere mengden av reabsorpsjon til et nivå som er passende for å opprettholde magnesiumhomeostase. Genomiske analyser av medfødte sykdommer med symptomer på hypomagnesemi har avslørt flere nøkkelmolekyler involvert i denne prosessenTRPM6, kodingforbigående reseptorpotensial melastatin-relatert 6(TRPM6), som er mutert hos pasienter med recessiv hypomagnesemi med sekundær hypokalsemi2,10.TRPM6danner en Mg2 pluss -permeabel ionekanal lokalisert til den apikale membranen til DCT-celler og medierer Mg2 pluss inntak fra det tubulære lumen1. Et annet nøkkelmolekyl er cyclin M2 (CNNM2), og Mg2 pluss transportør lokalisert til den basolaterale membranen til DCT-celler12,13. Cnnm2-mutasjoner forårsaker familiær dominant hypomagnesemi, som er preget av defekter i magnesiumreabsorpsjon i nyre2. Mus med Cnmm{11}}mangel viser lignende symptomer på hypomagnesemi med magnesiumsvinn i nyrene4. Den nøyaktige molekylære rollen til CNNM2 er fortsatt kontroversiell, men flere bevis tyder på at den medierer Mg2 pluss efflux fra DCT-celler gjennom den basolaterale membranen5, og bidrar dermed til magnesiumreabsorpsjon. Ytterligere analyser av Cnnm2-mangelfulle mus har avslørt at disse musene også har betydelig lavereblodpressenn kontrollmus4. Men de mekanistiske detaljene og involvering av andre Mg2 pluss kanaler/transportører i detteblodpressregulering er fortsatt ukjent.
Renal DCT er også kjent for å spille en kritisk rolle iblodpressregulering fordi det betydelig reabsorberer natrium og regulerer kroppsvæskevolumet6. En rekke kationkanaler/transportører, som Na-Cl co-transporter (NCC), epitelial natriumkanal (ENaC), og Na pluss /H pluss exchanger 2(NHE2), uttrykkes ved DCT apikale membran og noen av disse proteinene medierer Na pluss inntak i DCT-celler fra det tubulære lumen. Intracellulært Na pluss ekstruderes deretter fra cellene gjennom den basolaterale membranen med Na pluss /K pluss -ATPase for å oppnå reabsorpsjon. Bortsett fra direkte involvering i å regulere kroppsvæskevolumet, er DCT lokalisert ved siden av macula densa, som kontrollerer sekresjonen av renin, et hormon med hovedrollen i orkestreringblodtrykkforskrift17,18. Ved å registrere Cl-nivåer i urinen, stimulerer macula densa-celler nærliggende juxta-glomerulære (JG) celler til å skille ut renin.
I dette arbeidet utfører vi transkriptomanalyser med nyrene til mus med hypotensive Cnnm2-mangel. Vi finner en betydelig nedgang iTrpm6, som ber oss om å generere nyrespesifikkeTrpm6- mangelfulle mus. Uventet avslører analyser av denne musestammen en fenotype som er kvalitativt forskjellig fra den til Cnnm2-mangel: tap av døgnvariasjon avblodpress. Vi finner også at denne fenotypen er forårsaket av nedsatt sekresjon av renin, enblodtrykk- økende hormon hvor blodnivået normalt er forhøyet i den aktive fasen.
cistanche kroppsbygging
Resultater
Nedregulering avTRPM6 (forbigående reseptorpotensial melastatin-relatert 6)uttrykk i Cnnm2-mangelfulle mus. Å utforske den molekylære mekanismen tilblodtrykkreduksjon i mus med Cnnm2-mangel, utførte vi DNA-mikroarray-analyser for å undersøke endringer i genuttrykk i nyrene til Cnnm2f/il; Seks2-Cre-mus, mangler begge Cnnm2-allelene i nyren4. Blant de differensielt uttrykte genene (tabell 1) valgte vi å analysere Pvalb ogTrpm6, som begge er uttrykt i DCT919. Kvantitative PCR (qPCR) analyser avslørte detTrpm6uttrykk ble tilsvarende redusert i nyrene til begge Cnnm2fi; Seks2-Cre og Cnnm2 pluss / mus. Siden både Cnnm2 pluss /A og Cnnm2fi/; Seks2-Cre-mus var hypotensive4, analyserte viTRPM6 uttrykke mer detaljert. Immunoblotting-analyser av nyrelysater bekreftet en signifikant reduksjon påTRPM6på proteinnivå av Cnnm2-mangel, mens nivåene av NCC og fosforylert NCC (aktiv form) ikke ble markert påvirket, ble CNNM2-ekspresjon bekreftet ved påfølgende immunutfellings- og immunblotting-analyser). Nedgangen påTRPM6i nyrene til Cnnm2f/i; Seks2-Cre-mus ble også bekreftet ved immunfluorescensanalyser.
Vi undersøkte ogsåTRPM6uttrykk hos mus som mangler CNNM4, som også viser symptomer på hypomagnesemi20, men som har forhøyetblodtrykk4. Immunblotting og immunfluorescensanalyser indikerte detTRPM6uttrykk forsterkes i DCT-celler fra Cnnm4-mangelfulle mus, noe som tyder på atTRPM6uttrykk er nært knyttet tilblodtrykkverdier, men det er ikke direkte knyttet til magnesiumnivået i blodet.
Regulering avTRPM6uttrykk ved intracellulær Mg2 pluss i DCT-celler. For å karakterisere den molekylære mekanismen tilTRPM6 nedregulering i Cnnm2-mangelfulle mus, brukte vi en DCT-avledet cellelinje MDCT21, som uttrykker dominant Cnnm2 og moderat Cnnm3 og Cnnm4 blant Cnnm-familiegener. Siden CNNM2 og CNNM4 har sterk Mg2 pluss effluksaktivitet mens CNNM3 ikke har Mg2 pluss effluksaktivitet15, utførte vi småinterfererende RNA(siRNA)-mediert knockdown av enten Cnnm2, Cnnm4 eller begge deler. Cnnm2 knockdown økte intracellulære Mg pluss nivåer ([Mg pluss]), og samtidig knockdown av Cnnm4 førte til en liten økning av gjennomsnittlig [Mg2]; verdi, som ikke var statistisk signifikant. Vi undersøkte deretterTrpm6uttrykk ved qPCR og fant en signifikant reduksjon etter Cnnm2 knockdown og en mye større reduksjon etter dobbel knockdown av Cnnm2 og Cnnm4. Derfor,Trpm6uttrykk ser ut til å være negativt regulert av intracellulære Mg2 pluss-nivåer, noe som er i samsvar med de tidligere rapportene23. For direkte å undersøke viktigheten av Mg2 pluss dyrket vi MDCT-celler i media med forskjellige konsentrasjoner av Mg2 pluss 0,1h, og reduserte den ekstracellulære Mg2 pluss-konsentrasjonen førte til reduksjonen i intracellulært Mg2 pluss-nivå og økningen avTrpm6uttrykk, noe som antyder en undertrykkende rolle av Mg2 pluss. I tilfelle av dobbel knockdown (Cnnm2/Cnnm4) MDCT-celler,Trpm6uttrykk ble undertrykt med synkende Mg2 pluss
pluss konsentrasjoner ned til 0,2 mm, men ytterligere reduksjoner kansellerte den undertrykkende effekten; både intracellulær Mg2 pluss ogTrpm6nivåene var ikke signifikant forskjellig fra kontroll siRNA-transfekterte celler i både 0.1 og 0.02 mM forhold. Disse resultatene indikerer en Mg2 pluss-avhengig reguleringsmekanisme avTrpm6uttrykk, som forklarerTrpm6nedregulering i nyrene til Cnnm2-mangelfulle mus.
Betinget avbrudd avTrpm6 (forbigående reseptorpotensial melastatin-relatert 6)i nyren. Deretter hadde vi som mål å generereTrpm6-mangelfulle mus å undersøke viktigheten av videreTRPM6i reguleringen avblodtrykk. Vi brukte en embryonal stamcelle (ES) klon som bar en rekombinantTrpm6allel (Trpm6-) som inneholder en spleiseakseptorsekvens, som tvinger for tidlig mRNA-spleising og resulterer i et mRNA avkortet etter ekson 6. Kimære heterozygote mus ble oppnådd ved blastocystinjeksjon av ES-cellene og rekombinasjon ble bekreftet ved PCR. Vi krysset disseTrpm6pluss /- mus, men neiTrpm6-/--av_våren ble oppnådd. Dette resultatet stemmer overens med tidligere rapporter som viser embryonal dødelighet iTrpm6-mangelfulle mus24,25
Derfor utførte vi en nyrespesifikk betinget forstyrrelse avTrpm6ved å bruke Six2-Cre, som muliggjør effektiv og spesifikk ekspresjon av GFP-fusionert Cre-rekombinase i den embryonale nyren.Trpm6fl/, seks2-Cre-mus(nyrespesifikkeTrpm6-mangelfulle mus) ble født med forventet mendelsk forhold. For å bestemme uttrykket forTRPM6, utførte vi immunoblotting-analyser ved å bruke en anti-TRPM6antistoff.TRPM6proteinnivået ble sterkt redusert i nyrene tilTrpm6fl/fl, seks2-Cre-mus, men ingen signifikante endringer ble observert i andre organer. Immunfluorescensfargingsanalyser viste heller ingen uttrykk forTRPM6i NCC-positive DCT-celler. Vi observerte ingen signifikantTRPM6-positivt signal i mer enn 100 slike klynger av NCC-positive celler, noe som tyder på detTRPM6ekspresjon er nesten fullstendig undertrykt i DCT-celler av Trpmfi/; Seks2-Cre-mus. Disse resultatene bekrefter vellykket generering av nyrespesifikkeTrpm6- mangelfulle mus.
Vi undersøkte først effekten av nyrespesifikkTrpm6-mangel på magnesiumhomeostase. Vi opprettholdt mus i metabolske bur og samlet urin- og serumprøver, som deretter ble utsatt for kolorimetrisk kvantifisering av magnesiumnivåer ved bruk av Xylidyl Blue-I. Serummagnesiumnivået var betydelig lavere iTrpm6l/l; Seks2-Cre-mus sammenlignet med de som har kontrollTrpm6pluss / pluss ; Seks2-Cre-mus, mens magnesiumnivåene i urinen var høyere. Vi utførte også induktivt koblet plasmaemisjonsspektroskopi (ICP-ES) analyser for å måle flere viktige metallelementer i serumet og fant at bare magnesiumnivåer ble signifikant påvirket i Trpmd/; Seks2-Cre-mus. Disse resultatene indikerer tydelig at mus med nyrespesifikke Trpm-6-mangel har hypomagnesemi med renal magnesiumsvinn, som observert i nyrespesifikke musel med Cnnm2-mangel4.
Mangel på døgnvariasjon avblodpressog reninaktivitet. Deretter utsatte viTrpm6i/l; Seks2-Cre mus tilblodpressmålinger ved hjelp av radiotelemetri. Systolisk og diastoliskblodtrykkverdiene var begge betydelig lavere iTrpm6l/; Seks2-Cre-mus enn i kontrollmus. Det er bemerkelsesverdig at den vanlige døgnvariasjonen avblodtrykk, med høye verdier under den mørke perioden og lave verdier under lysperioden hos mus, ble ikke observert iTrpm6f/l; Seks2-Cre-mus. For å undersøke om døgnrytmen fortsetter normalt, brukte vi radiotelemetri for å måle lokomotivaktiviteten til mus og bekreftet en veldig tydelig døgnvariasjon iTrpm6l/; Seks{{0}}Cre-mus. Vi undersøkte også blodnivåer av vasopressin (AVP) og mRNA-nivåer av to klokkegener Bmall og Per2 i hjernen og nyrene; alle er kjent for å vise typiske døgnvariasjoner27,28. Vi analyserte på seks forskjellige tidspunkter (ved 0,4,8 zeitgeber-tider (ZT) for lysperioden og ved 12,16,20 ZT for mørkeperioden). Kontrollmus viser tydelige døgnmønstre for uttrykket deres som tidligere rapportert28, og igjen fant vi ingen signifikante abnormiteter iTrpm6/il; Seks2-Cre-mus. Vi sjekket også uttrykksnivået til Trpm7, som koder for en Mg2 pluss -permeabel kanal nært relatert tilTRPM6, i nyrene. Uttrykksmønstrene var veldig like i beggeTrpm6pluss / pluss ; Seks2-Cre og Trpm6f/; Seks2-Cre-mus, og viste ikke klare døgnmønstre. Samlet konkluderer vi med at døgnrytmen fortsetter normalt iTrpm6Jeg; Seks2-Cre-mus. Det har vært vurdert detblodpressforhøyelse i løpet av den aktive perioden (mørkeperioden for mus og lysperioden for mennesker) hos både mennesker og mus oppstår som respons på en økning i reninsekresjon i blodet2. Vi målte reninaktivitet i blodprøver samlet på de seks forskjellige tidspunktene beskrevet ovenfor. En tydelig økning i blodreninaktivitet ble observert i de mørke periodene i prøver fra kontrollmus, men ingen signifikant økning ble observert i prøver fra de avTrpm6/lSix2-Cre mus. Vi målte også blodnivået av noradrenalin, hvis frigjøring er kjent for å stimuleres av aktivering av renin-angiotensin-systemet29,30. Som forventet forsvant også døgnvariasjonen deres innTrpm6, Seks2-Cre mus. I mellomtiden var proteinnivået til blodangiotensinogen (AGT), et annet hastighetsbegrensende molekyl for aktivering av renin-angiotensin-systemet i mus31, upåvirket avTrpm6 mangel. Resultatene tyder på at den nedsatte døgnvariasjonen av renin er viktig for tap av døgnvariasjon avblodpressavTrpm6-mangel.
Nærheten tilTRPM6-uttrykker celler til renin-utskillende celler. Renin uttrykkes i og skilles ut fra JG-celler i nyrene17,18. JG-celler er i direkte kontakt med macula densa, som er lokalisert ved siden av DCT og stimulerer reninsekresjon fra JG-celler som respons på reduksjon av Cl-nivåer i urin18. Immunfluorescensfarging for renin og nevronal nitrogenoksidsyntase (nNOS), en macula densa-markør, viste ingen abnormiteter i verken mønsteret eller intensiteten til positive signaler observert nær glomeruli iTrpm6f/; Seks2-Cre-mus. Derfor ser det ikke ut til at celler som er direkte involvert i reninsekresjon og dens regulering er markant påvirket avTrpm6mangel. SomTRPM6er co-uttrykt med NCC i DCT, undersøkte vi deretter det romlige forholdet mellomTRPM6/NCC-uttrykkende celler (DCT) og macula densa- eller JG-cellene. Konfokale bilder av sagittale DCT-seksjoner viste nesten en fullstendig overlapping avTRPM6og NCC-signaler gjennom hele DCT. Vi farget deretter for nNOS og NCC, og fant at områdene som er positive for nNOS og NCC er koblet sammen, uten noen signaloverlapping. I tillegg ble dobbeltfarging for renin ogTRPM6/NCC avslørte at noenTRPM6/NCC-uttrykkende celler er i nærheten av renin-uttrykkende JG-celler, noe som tyder på atTRPM6/NCC-uttrykkende celler, så vel som macula densa, kan ha en betydelig innvirkning på reninsekresjon.
Nedsatt reninsekresjon vedTrpm6 (forbigående reseptorpotensial melastatin-relatert 6)mangel. Generelt spiller det autonome nervesystemet en avgjørende rolle i å orkestrere progresjonen av døgnrytmen. Reninsekresjon fra JG-celler i løpet av den aktive perioden antas å bli stimulert av noradrenalin utskilt fra nyre-sympatiske nevroner32. For å direkte undersøke effekten av slik stimulering på reninsekresjon, forberedte vi nyreskiver og stimulerte dem med isoproterenol, en -adrenoreceptor(AR) agonist. Resultatene viste en veldig klar reduksjon i renin-positivt signal som ble igjen i skiven etter isoproterenolstimulering i 30 minutter. Kvantitative analyser viste at prosentandelen glomeruli omgitt av renin-positivt signal sank fra omtrent 80 prosent til 30 prosent etter isoproterenolstimulering, noe som indikerer forekomsten av massiv reninsekresjon. Imidlertid observerte vi ikke en signifikant effekt av isoproterenolstimulering på reninsignal i nyreskiver fraTrpm6/1; Seks2-Cre-mus. For å bekrefte resultatet målte vi også blodreninaktiviteten etter isoproterenoladministrasjon. Resultatene viser at signifikant økning av blodreninaktivitet bare ble observert hos kontrollmus, mens økningen i hjertefrekvensen ofte ble observert i begge stammer. Disse resultatene antyder at renin-utskillende JG-celler ikke kan reagere på stimulering fra nyresympatiske nevroner, i samsvar med forsvinningen av døgnøkningen iblodpressog reninaktivitet iTrpm6l/fl; Seks2-Cre-mus.
JG-celler kan også stimuleres til å utskille renin som respons på prostaglandiner, blant hvilke prostaglandin E2(PGE2) anses som mest betydningsfull siden det utskilles fysiologisk av macula densa-celler når Cl-nivåer i urinen synker17,18. Dessuten er det også kjent at PGE, behandling av nyreskiver kan stimulere reninsekresjon effektivt33. Stimulering av JG-celler med PGE2 og isoproterenol aktiverer vanligvis cAMP-produksjon, som til slutt forårsaker reninsekresjon. Derfor testet vi også effekten av PGE, og den membranpermeable cAMP-analogen, dibutylyl-cAMP(db-cAMP). PGE2 og db-cAMP stimulerte reninsekresjon i nyreskiver fra Trpmdi/A, Six2- Cre mus, og kontrollmus. Dette indikerer detTrpm6 mangel opphever ikke det generelle maskineriet som er involvert i å registrere eksterne signaler, videresende intracellulære signaler og utføre reninsekresjon, men det påvirker spesifikt responsen på -AR.
Redusert -AR-uttrykk i JG-celler medTrpm6 (forbigående reseptorpotensial melastatin-relatert 6)mangel. Nedsatt -AR-reseptorresponseinTrpm6l/l; Seks 2-Cre-mus førte til at vi undersøkte statusen til -AR-reseptoruttrykket, og derfor utførte vi immunfluorescens av 1-AR, hoved-AR-subtypen uttrykt i JG-celler34. Som rapportert tidligere34, fant vi det båndlignende fargemønsteret i nyreseksjoner av både kontrollmus og Trpmdi/l, Six2-Cre-mus. Det er kjent at 1-AR er sterkt uttrykt i både blodårer og JG-celler34, og konsekvent var de 1-AR-positive cellene på slutten av den båndlignende fargingen i kontrollmusenyre også positive for reninfarging (vist med en pilspiss). I kontrast er fargingen av Trpm6l/fl; Seks2-Cre-musenyre viste et mindre antall 1-AR/renin-dobbeltpositive celler, noe som tyder på at 1-AR-uttrykk ble redusert i JG-celler. For å bekrefte dette funnet, isolerte vi JG-celler ved å bruke Percoll-densitetsgradientsentrifugeringsmetoden i henhold til forrige rapport35. Immunoblotting-analyser avdekket at renin-positive JG-celler er anriket i bånd 3-fraksjonen, som er i samsvar med rapporten deres35, og 1-AR-ekspresjon i denne bånd 3-fraksjonen var spesifikt mye lavere i Trpmdi/1; Seks2-Cre-mus. Sammen fant vi detTrpm6mangel reduserer ekspresjonsnivået av 1-AR i JG-celler, noe som stemmer overens med den svekkede reninsekresjonen.
Effekten av den kunstige intervensjonen på døgnrytmenblodpressvariasjon. I det siste settet med eksperimenter testet vi effekten av ulike intervensjoner på døgnrytmenblodpressvariasjon. For å bekrefte viktigheten av renin, administrerte vi en klinisk tilgjengelig reninhemmer aliskiren36 til villtype mus. SomTrpm6ablasjon, administrering av aliskiren ved kirurgisk implantering av en osmotisk minipumpe undertrykte døgnet betydeligblodpressvariasjon. Deretter utførte vi nyre-denerveringsoperasjoner, siden aktivering av -AR på JG-celler gjennom det sympatiske nervesystemet er hovedveien for å stimulere reninsekresjon på en cirkadisk måte2. Igjen fant vi ut at intervensjonen undertrykteblodpressvariasjon. Disse resultatene er i samsvar med vår modell om at defekter i -AR-respons og reninsekresjon er ansvarlig for tap avblodtrykkvariasjon i Trpmdl/l; Seks2-Cre-mus.
Vi testet også effekten av å øke magnesiuminnholdet i kosten. For dette formålet ble villtypemus matet med en høy-Mg diett som inneholdt 0,6 prosent (normalt kosthold:0,3 prosent magnesium) i 1 måned. Som forventet viste disse musene forhøyede Mg-nivåer i blodet. Vi sjekket deretter uttrykksnivået tilTRPM6ved DCT; den reduserte drastisk ved å spise en høy-Mg diett, og omfanget av reduserteTRPM6uttrykket var større enn renal Cnnm2-ablasjon. Da vi målteblodtrykki disse musene fant vi at mus matet en høy-Mg diett viste betydelig mindreblodpressvariasjon ennTrpm6-mangelfulle mus, noe som stemmer overens med vår oppfatning om at nyreTRPM6er viktig for døgnrytmenblodtrykkvariasjon.
Tabell 1 Gener som ble opp- eller nedregulert i nyrene til Cnnm2flfl/flfl; Seks2-Cre-mus.
Diskusjon
I denne studien viste vi viktigheten avTRPM6 (forbigående reseptorpotensial melastatin-relatert 6)i reguleringen avblodtrykk. Spesielt viser vi nesten fullstendig forsvinning av døgnvariasjonen avblodtrykki nyrespesifikkeTrpm6- mangelfulle mus. Vi fant også at sekresjon av renin, et nøkkelhormon som styrer blodtrykket, ble alvorlig opphevet iTrpm6-mangelfulle mus, som er i samsvar med det observerteblodtrykkfenotype. Flere rapporter har vist at TRPM7, en annen Mg2 pluss -permeabel kanal som ligner mye påTRPM6, påvirker også blodtrykket37,38. TRPM7 forhindrer økningen avblodtrykkved administrering av angiotensin II ved å undertrykke responsen fra vaskulære endotelceller på angiotensin II37. Tvert imot ble det nylig rapportert at TRPM7 også letter heving avblodtrykkved leptinadministrasjon ved å mediere Mg2 pluss tilstrømning inn i carotiskroppscellene38. Dermed rollen til TRPM7 iblodtrykkreguleringen er tvetydig. Men siden ekspresjonsnivået av TRPM7 i nyrene ikke ble påvirket av nyreneTrpm6ablasjon (Supplerende Fig. 5), ser det ut til at TRPM7 ikke er direkte involvert i fenotypene observert i denne studien.
Som observert hos Cnnm2-mangelfulle mus,blodtrykkverdiene ble redusert iTrpm6-mangelfulle mus(fig.2)14. Det skal imidlertid bemerkes at det var en klar forskjell mellom disse musene. Cnnm2-avbrudd generelt redusertblodtrykk, men døgnvariasjon var fortsatt tydelig observerbar. Derimot forsvant denne variasjonen innTrpm6- mangelfulle mus. En slik kvalitativ forskjell stemmer også overens med vår observasjon at den cirkadiske variasjonen av renin ble bevart i mus med Cnnm2-mangel (Supplerende Fig.9). Det skal bemerkes at både CNNM2 ogTRPM6antas å være viktig for renal Mg2 pluss reabsorpsjon ved å mediere den vektorielle Mg2 pluss-transporten gjennom DCT, og mus med mangel på begge genene viste faktisk identisk renal Mg2 pluss-svinn-fenotype (fig. 1 og ref. 39). Den kvalitative forskjellen påblodtrykkfenotype mellom Cnnm2-ogTrpm6-mangelfulle mus tyder på at Mg2 pluss transport i DCT, den felles funksjonen til de to molekylene, ikke er direkte involvert i døgnvariasjonen avblodtrykkog reninsekresjon, noe som tyder på at CNNMs2-uavhengige rolleTRPM6ligger til grunn for disse spennende fenotypene.
Flere mekanismer virker for å stimulere reninsekresjon fra JG-celler for å opprettholdeblodtrykk. Blant dem anses input fra nyre-sympatiske nevroner å spille hovedrollen i forsterkningblodtrykkunder den aktive perioden med cirkadisk variasjon32. Disse nevronene skiller ut noradrenalin, som binder seg til og aktiverer -AR på JG-celler for å stimulere cAMP-produksjonen, noe som til slutt fører til reninsekresjon1732. I våre eksperimenter bruker nyreskiver hentet fraTrpm6-deficiente mus, stimulering med isoproterenol, en -AR-agonist, viste ingen effekt på reninsekresjon, mens stimulering med PGE2 eller db-cAMP effektivt økte reninsekresjonen (fig. 4). PGE2 skilles ut av macula densa som respons på lave nivåer av urin-Cl- og det aktiverer EP2- og EP4-reseptorer på JG-celler, som i likhet med -AR-aktivering til slutt stimulerer cAMP-produksjon40. Derfor antyder disse resultatene at -AR-signalering er selektivt opphevet i JG-celler avTrpm6-mangelfulle mus, uten å påvirke den nedstrøms cAMP-medierte signalveien. Konsekvent avslørte immunfluorescens av musenyreseksjoner og immunblotting av isolerte JG-celler at -AR-ekspresjon ble betydelig redusert i JG-cellene tilTrpm6-mangelfulle mus (fig. 5). Slik redusert -AR-ekspresjon skulle gjøre JG-celler ute av stand til å utskille renin som respons på sympatisk nervestimulering i løpet av den aktive perioden, og dermed eliminere døgnvariasjon av reninnivå i blodet ogblodtrykk. Det bør bemerkes at det er en studie med 1/ 2-AR knockout-mus, som viste redusert døgnrytmeblodtrykkvariasjon somTrpm6-mangelfulle mus41. De tilskrev det til den reduserte lokomotoriske aktiviteten, men det er fortsatt mulig at redusert døgnvariasjon av reninaktivitet bidrar til redusert døgnvariasjon avblodtrykke. Alternativt kan den uvanlige bakgrunnen til musene deres (blandet bakgrunn av C57BL6/J, 129 og VFB; vi brukte ren C57BL6/bakgrunn) maskere effekten av -AR påblodtrykkvariasjon; genetisk bakgrunn er kritisk for døgnkontinuerligblodtrykkvariasjon42.
cistanche kroppsbygging
Hvordan tapet avTRPM6 (forbigående reseptorpotensial melastatin-relatert 6)i DCT-celler fører til at den reduserte -AR-ekspresjonen i JG-celler har forblitt unnvikende. Eksperimenter med andre typer celler har vist at -AR-ekspresjon reguleres av forskjellige molekyler som er kjent for å mediere intercellulær signalering: Tilsetning av glukokortikoider til kulturmediet til vas deferens-avledet cellelinje DDT1 MF-2 øker -AR-ekspresjon43. Det ble også rapportert at nitrogenoksid (NO) undertrykte -AR-nedbrytning i hjerteceller gjennom S-nitrosylering av GRK24. Blant disse molekylene er det verdt å merke seg at NO utskilles fra renale macula densa-celler, og stimulerer JG-celler på en parakrin måte for å øke reninsekresjonen45. Mens uttrykket av nNOS, det NO-produserende enzymet i nyrene, er begrenset til macula densa-celler, er de i direkte kontakt med DCT-celler, det neste segmentet av nyretubulel6. Dermed er det mulig detTrpm6-mangel i DCT-celler fører til redusert -AR-ekspresjon i JG-celler ved å påvirke produksjonen eller frigjøringen av NO fra de tilstøtende macula densa-cellene.
Det er kjent at JG-celler også kommuniserer med andre celler ved å danne gap-junctions med omkringliggende celler, slik som mesangiale celler, og mottar Ca2 pluss for å undertrykke reninsekresjon7. Selv om JG-celler og DCT-celler ikke kommer i direkte kontakt med hverandre, er de fortsatt tett plassert (ref. 46 og Fig. 3), og det er mulig at disse cellene bruker gap-junctional kommunikasjon gjennom intervenerende celler, slik som mesangiale celler; alle tre celletypene uttrykker angivelig Cx3747,48, en connexin-isoform som oligomeriserer og utgjør gap-junctions. Ytterligere analyse kan identifisere molekylet og ruten som er ansvarlig for den intercellulære signaleringen mellom DCT- og JG-celler, noe som er viktig for å avsløre den generelle mekanismen til forstyrret døgnrytmeblodtrykkvariasjon etterTrpm6-mangel.
ITrpm6- Mangelfulle mus forsvant døgnvariasjonen av blodnivåer av ikke bare renin, men også noradrenalin. Aktivering av renin-angiotensin-systemet stimulerer frigjøringen av noradrenalin til blodet29,30, og derfor virker det rimelig at effekten avTrpm6 (forbigående reseptorpotensial melastatin-relatert 6)ablasjon av renin- og noradrenalinnivåer i blodet var lik. Siden noradrenalin også virker på -AR av JG-celler for å fremme reninsekresjon, antas de to molekylene å utgjøre en positiv tilbakemeldingssløyfe, som stimulerer hverandres sekresjon. Det bør imidlertid bemerkes at resultatene av isoproterenoladministrasjonsforsøk eksplisitt viser defekten i reninsekresjon (fig.4), og det ser derfor ut til å være den primære årsaken til tapet av døgnvariasjonen av både renin og noradrenalin.
Så langt har en rekke effektive legemidler blitt utviklet og brukt til å behandle hypertensive pasienter. Imidlertid viser et betydelig antall pasienter motstand mot konvensjonelle behandlinger som bruker en kombinasjon av viktige antihypertensiva med forskjellige funksjonelle mekanismer4. Kirurgisk denervering av nyre-sympatiske nevroner ved bruk av endovaskulære katetre har blitt utført på prøvebasis for å behandle slik resistent hypertensjon50. Dens praktiske effektivitet til å forbedreblodtrykkkontroll har vært kontroversiell51,52, men nylig publiserte studier har vist en betydelig reduksjon iblodtrykksammenlignet med falske kontroller53,54. Det er også blandede resultater på effekten av renal denervering på døgnvariasjon avblodtrykk. Noen rapporter viste at omfanget avblodtrykkreduksjon ved renal denervering var større under de aktive periodene53, men andre rapporterte ingen endring i døgnvariasjon avblodtrykk55,56. I analysen ved bruk av laboratoriedyr, undertrykte våre nyre-denerveringsoperasjoner mot mus den cirkadiske variasjonen avblodtrykk(Fig. 6). Lignende operasjoner ble også utført mot rotter, men selv kontroll villtype rotter viser nesten ingen døgnrytmeblodtrykkvariasjon i utgangspunktet57,58, noe som gjør det vanskelig å vurdere effekten av operasjonen. Flere studier er nødvendig for å klargjøre virkningen av nyredenervering på døgnrytmenblodtrykkvariasjon, som også vil hjelpe oss å forstå den mer detaljerte mekanismen tilblodtrykkdysregulering avTrpm6-mangel.
Telemetriske målinger avblodtrykk, hjertefrekvens og bevegelsesaktivitet. Telemetriske målinger avblodtrykkble utført som følger4.Blodtrykktransdusere (TAl1PA-C10, Data Sciences International) ble kirurgisk satt inn i venstre felles halspulsåre hos 2- til 3-måned gamle mus under anestesi (ved intraperitoneal administrering av 0,3 mg/ kg medetomidin, 4 mg/kg midazolam og 5 mg/kg butorfanol). Etter 3 uker med restitusjon, systolisk og diastoliskblodtrykkverdiene ble registrert med en 2-min planlagt prøvetaking hvert 60. minutt ved å bruke Dataquest ART-programvare (Data Sciences International). Registreringer ble oppnådd i minst fem påfølgende dager, og gjennomsnittene av målinger tatt på samme tid hver dag ble bestemt for hver mus og brukt for ytterligere statistiske analyser, bortsett fra Supplerende Fig. 4. Basert på Nakamori et al.68, renal denervering ble utført 2 uker før innsettingblodtrykktransdusere som følger. Nyrene ble eksponert ved abdominalt snitt og bindevev rundt nyrekarene ble dissekert. Deretter ble nyrekarene nedsenket i 95 prosent etanol i 2 minutter og deretter i PBS i 2 minutter. Sham-operasjon ble utført ved bruk av ekvivalent prosedyre uten neddykking i etanol. Aliskiren ble administrert 25 mg/kg/dag ved subkutant innbygging av en osmotisk pumpe (1004, ALZET), og registrering ble startet fra dagen etter pumpeinnføring. For magnesiumtilskudd ble mus matet med en magnesiumanriket diett som inneholdt 0,6 prosent magnesium (CLEA Japan) i 1 måned førblodtrykkmål.
Hjertefrekvensen ble målt med det samme radiotelemetrisystemet, bortsett fra at registreringen ble utført med en 30-s planlagt prøvetaking hvert minutt, og en enkelt måling ble brukt for videre analyse.
Bevegelsesaktiviteter ble vurdert ved å bruke det samme radiotelemetrisystemet, ved å overvåke endringene i signalstyrke fra transduseren på grunn av dyrets bevegelse. I dette tilfellet ble transdusere kirurgisk satt inn i det subkutane rommet i høyre flanke. Opptakene ble utført med samme tidsintervaller som beskrevet ovenfor.
cistanche kroppsbygging
Referanser
1. Giles, TDC Circadian rytme avblodtrykkog forholdet til kardiovaskulære hendelser.J. Hypertens. 24, S11-S16 (2006).
2. Smolensky, MH, Portaluppi, F. & Hermida, RC inBlodtrykkMonitoring in Cardiovascular Medicine and Therapeutics, 3rd EDT.(eds White, WB)Part II, Ch.6, 105-128(Springer,2016).
3. Witteman, JC et al. En prospektiv studie av ernæringsfaktorer og hypertensjon blant amerikanske kvinner. Opplag 80,1320-1327(1989).
4. Ascherio, A. et al. En prospektiv studie av ernæringsfaktorer og hypertensjon blant amerikanske menn. Opplag 86,1475-1484(1992).
5. Ascherio, A. et al. Prospektiv studie av ernæringsfaktorer,blodtrykk, og hypertensjon blant amerikanske kvinner. Hypertension 27,1065-1072(1996).
Merk:ovenstående er ikke en fullstendig referanseliste