Calpastatin forhindrer angiotensin II-mediert podocyttskade gjennom vedlikehold av autofagi
Mar 17, 2022
for mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com
Imane Bensaada1,3, Blaise Robin1,3, Joe¨lle Perez2, Yann Salemkour1, Anna Chipont1, Marine Camus1,Mathilde Lemoine1, Lea Guyonnet1, He´le`ne Lazareth1, Emmanuel Letavernier2, Carole He´nique1,Pierre-Louis Tharaux1og Olivia Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Frankrike; og2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Paris, Frankrike
Den sterke prediktive verdien av proteinuri i kroniske glomerulære patier er godt etablert, så vel som den patogene rollen til angiotensin II som fremmer progresjonen av glomerulær sykdom med en endret glomerulær fi-filtrasjonsbarriere, podocyttskade og arrdannelse av glomeruli. Her fant vi at kronisk angiotensin II-indusert hypertensjon hemmetautofagiutstrømning i mus glomeruli. Sletting av Atg5 (et gen som koder for et protein involvert autofagi) spesifikt i podocytten resulterte i akselerert dangio tensin II-indusert podocytopati, aksentuert albuminuri og glomerulosklerose. Dette indikerer at autofagi er en viktig beskyttelsesmekanisme i podocytten i denne tilstanden. Angiotensin-II-indusert calpain-aktivitet i podocytter hemmerautofagiutstrømning. Podocytter fra mus med transgen ekspresjon av den endogene calpain-hemmerenkalpastatinviste høyere podocyttautofagived baseline som var resistent mot angiotensin II-avhengig hemming. Dessuten vedvarende autofagi medkalpastatinbegrenset podocyttskade og albuminuri. Disse funnene tyder på at hypertensjon har patogene effekter på den glomerulære strukturen og funksjonen, delvis gjennom aktivering av calpains som fører til blokkering av podocyttautofagi. Disse funnene avdekker en original mekanisme der angiotensin II-mediert hypertensjon hemmer autofagi via kalsiumindusert rekruttering av calpain med patogene konsekvenser ved ubalanse vedkalpastatinaktivitet. Dermed forhindres en calpain-mediert reduksjon iautofagikan være en lovende ny terapeutisk strategi for nefropatier assosiert med høy renin-angiotensin-systemaktivitet.
NØKKELORD: angiotensin II;autofagi; kalpastatin; hypertensjon; podocytt
Oversettelseserklæring
Gitt den avgjørende rollen til autofagi i utviklingen avnyresykdommer, farmakologisk modulering avautofagikan være en lovende strategi for forebygging og behandling av flerenyresykdommer. Parallelt ble overaktivering av calpain-aktivitet i podocytter funnet å ha skadelige effekter på podocyttfunksjonen, mens dens skadelige virkningsmekanismer ikke ble identifisert. Her gir vi bevis på at calpain kobler den skadelige virkningen av angiotensin II til den skadelige blokkeringen avautofagii podocytter og antyder at kalpain-hemming kan være et lovende terapeutisk mål for podocyttsykdommer delvis gjennom vedlikehold av podocyttautofagi.
Klikk for åCistanche deserticola ma for kronisk nyresykdom
Hypertensjon er nest etter diabetes som en ledende årsak til progressiv kronisknyresykdom 1–3 og til og med beskjeden økning i blodtrykket er en uavhengig risikofaktor for nyresykdom i sluttstadiet.4 Et økende antall eksperimentelle studier har fremhevet betydningen av podocytter i utviklingen avnyreskade. Progressivt tap av podocytter og mikrovaskulære endringer vises tidlig med funksjonell nyrenedgang i eksperimentell hypertensiv nefropati.5 Hos pasienter ble urinutskillelse av levedyktige podocytter vist å være en sensitiv og spesifikk markør for preeklampsi,6,7 og pasienter med nefrosklerose hadde en signifikant lavere tetthet av glomerulære podocytter enn det gjordenyredonorer.8,9 Videre er den patogene rollen til angiotensin II (AngII) som fremmer progresjonen av glomerulær sykdom, godt etablert, ikke bare ved hypertensive tilstander, men også ved flere glomerulære sykdommer.10–21
Glomerulær hypertensjon resulterer i glomerulær kapillær strekking, endotelskade og forhøyet glomerulær proteinfiltrering som forårsaker glomerulær kollaps og glomerulosklerose. Det utøver også en direkte virkning på glomerulære strukturer, og forårsaker signalregulerende responser som tar sikte på å kompensere. Et aktivert systemisk og lokalt renin-angiotensin-aldosteron-system (RAAS) fremmer mesangial hyperplasi og syntese av vaskulære permeabilitetsfaktorer. Samtidig viser podocytter kalsiumsignalering22,23 og modifiserer formen etter AngII type 1 reseptor (AT1)-avhengig stimulering.24–28 Disse adaptive mekanismene blir maladaptive på lang sikt, og fører til slutt til glomerulosklerose. AT1 medierer fremtredende RAAS-engasjement for blodtrykk og salt- og vannhomeostase. Angiotensin-konverterende enzymhemmere og AT1-blokkere brukes klinisk til behandling av hypertensjon og hjertesvikt hos pasienter. Interessant nok viser begge blokkere også en beskyttende effekt pånyrefunksjon.
Autofagi ble vist å være avgjørende for opprettholdelse av cellulær homeostase, spesielt i postmitotiske celler29,30 og spesielt i podocytter.31–34Autofagier et lysosomal-assosiert nedbrytningssystem for langlivede cytoplasmatiske proteiner og dysfunksjonelle organeller35,36 og involverer sekvestrering av proteiner og organeller i autofagosomer. Dannelsen av autofagosomer er avhengig av induksjon av flere gener inkludert Map1lc3a/b, Beclin 1 og Tags. 37 Det er økende bevis for at dysregulering av den autofagiske banen er implisert i patogenesen av nyrealdring og flerenyresykdommer som akutt nyreskade, polycystisk nyresykdom, aldring og diabetisk nefropati.31,32,38–41
Regulering avautofagii podocytter, fysiologisk og fremfor alt i patologisk sammenheng, er ikke godt kjent. Vi har nylig demonstrert at podocyttautofagi er uavhengig av det mekanistiske målet for rapamycin (mTOR)-regulering under fysiologiske forhold, noe som gjør denne celletypen til et unntak.42 AT1-aktivering stimulerer proteinsyntese og proteinomsetning i cellene. Dermed begrunnet vi at aktivering av RAAS også kan påvirke stimulering av proteinomsetning og proteostase.
I denne studien fokuserte vi på rollen til AngII-signalering i podocyttautofagiregulering. Vi identifiserte de kalsiumaktiverte proteasene calpains som medierer en kronisk blokkerende effekt av AngII på podocyttautofagi. Videre fant vi at den endogene calpain-hemmerenkalpastatinvar i stand til å forhindre AngII-avhengig autofagi-hemming og podocyttskade under hypertensjon.
Disse funnene avdekker en original mekanisme der AngII-mediert hypertensjon hemmerautofagivia kalsiumindusert rekruttering av calpain med patogene konsekvenser ved ubalanse ved calpastatinaktivitet.
METODER
Dyr
Calpastatintransgene (CSTTg) mus ble vennlig levert av Dr. E. Letavernier.43 Mus med en podocyttspesifikk forstyrrelse av Atg5-genet (Nphs2.cre Atg5lox/lox) ble generert som tidligere beskrevet31 ved å krysse Nphs2.cre-mus44 med Atg5lox/lox mus45 på C57BL6/J-bakgrunnen. Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus og kontroll-kullmann, i alderen 10 til 12 uker, ble brukt i denne studien. Den hypertensive modellen ble indusert ved sc infusjon av AngII (Sigma-Aldrich, A9525) i en dose på 1 mg/kg/min i 4 til 6 uker via osmotiske minipumper (Alzet Corp, modell 2006). Pumper ble implantert fm på baksiden mellom skulderbladene og hoftene. Mus fikk salttilskudd (3 prosent NaCl) i mat. Atg5lox/lox (villtype [WT]) mus ble brukt som kontroller i alle studiene. For deoksykortikosteronacetat (DOCA) salt med nefronreduksjonsmodellen gjennomgikk voksne hannmus ensidig venstre nefrektomi. To uker etter nefrektomi fikk de DOC-pellets med 21-dagens utgivelse (Innovative Research of America) implantert sc. En andre pellet ble implantert 3 uker etter det første implantatet. Alle mus mottok 0,9 prosent NaCl i drikkevann ad libitum og ble drept etter 6 uker med DOC-administrasjon.46 Eksperimenter ble utført i henhold til de franske veterinærretningslinjene og de som er formulert av Det europeiske fellesskap for bruk på dyreforsøk (L358-86/ 609EEC) og ble godkjent av det franske forskningsdepartementet og den lokale forskningsetiske komiteen for universiteter (APAFIS-7646 og -22373).
Primært podocyttkultureksperiment
Differensierte primære podocytter ble dyrket som tidligere beskrevet.47,48 Kort fortalt ble den nylig isolerte nyrebarken blandet og fordøyd av kollagenase I (Gibco, 17100-017) i Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, 61870-044). Vev ble deretter ført gjennom 70 mm og 40 mm cellesiler (BD Falcon, 352340 og 352350). Glomeruli, som fester seg til 40 mm cellesilen, ble fjernet med fosfatbufret saltvann (PBS; Life Technologies, 10010023) þ 0,5 prosent bovint serumalbumin (Eurobio, HALALB07-65) injisert under trykk og ble deretter vasket to ganger i PBS. Nyisolerte glomeruli ble belagt i 6-brønnretter i Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) supplert med 10 prosent føtalt kalveserum og 1 prosent penicillin/streptomycin (Life Technologies, 15140122) for å slippe ut av podocytter og vokse. Podocyttberikelse ble verifisert ved Western blot-analyse som tidligere beskrevet31,48,49 (tilleggsfigur S1). Podocytter ble dyrket i fravær eller nærvær av bafilomycin A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) i 4 timer. For immunfluorescenseksperimenter ble primære podocytter belagt på 4 tallerkenetiketter (Dutcher, 055071). Podocytter ble deretter fiksert i paraformaldehyd 4 prosent i 10 minutter og behandlet for immunfluorescens.
Calpain aktivitetsanalyse
Intracellulær calpain-aktivitet ble bestemt i primære podocytter, som tidligere beskrevet.50–52 Totalt 100,000 celler ble dyrket i 24-brønnvevskulturskåler i Roswell Park Memorial Institute 1640 supplert med 10 prosent foster kalveserum og 1 prosent penicillin/streptomycin. Etter den angitte kulturperioden ble mediet erstattet med Krebs-Ringer HEPES bikarbonat (KRH)-løsning (pH 7,4) inneholdende 4 mM CaCl2, med eller uten 10 mM calpain-hemmer-1, og inkubert i 10 minutter før tilsetningen av 50 mM calpain-substrat N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metylkumarin (Sigma-Aldrich, S6510). Etter en 90- minutters inkubasjonsperiode ble calpain-aktiviteten bestemt som forskjellen mellom FL-fluorescens (målt ved 360 nm eksitasjon og 430 nm emisjon) med og uten calpain-hemmer-1.
Western blot
Primære podocytter ble ripet opp med 80 ml radioimmunutfellingsanalysebuffer som inneholdt fosfatase og proteasehemmer. Proteinkonsentrasjonen ble målt med BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Tjue mikrogram proteiner ble underkastet elektroforese på Criterion XT forhåndsstøpt gel (12 prosent Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Proteiner ble overført til polyvinylidendifluoridmembran (Thermo Fischer Scientific, 88518). Etter blokkering i 5 prosent melk i Tris Buffer Saline 0,1 prosent Tween (TBS-T), ble membraner inkubert med kanin polyklonal anti-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), kanin polyklonal anti-ATG5 (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), polyklonalt anti-Sequestosome 1 fra marsvin (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), kanin polyklonalt anti-calpain 1 domene IV (1:1000, Abcam, ), kanin polyklonal anti-calpain 2 aminoterminal ende av domene I (1:1000, Abcam, ab39165), mus monoklonal IgG1 anti-calpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), kanin anti-podocin (1:1000, Abcam, ab50339), marsvin-anti-nefrin (1:500, PROGEN, GP-N2), og rotte monoklonalt anti-tubulin (1:5000, Abcam,ab6160) antistoff. Etter vasking ble membraner inkubert med pepperrotperoksidase-koblet antistoff (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Deteksjonen av spesifikke signaler ble utført ved å bruke ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) på LAS 4000-enhet (Fuji). Densitometrianalyse med ImageJ-programvare (National Institutes of Health) ble brukt for kvantifisering.
Blodtrykksmålinger og fysiologiske vurderinger
Det systoliske blodtrykket til mus ble registrert ved bruk av halemansjettmetoden (Visitech Systems Inc., BP-2000). Ti målinger fra hver mus ble tatt, og deretter ble en middelverdi bestemt. Systolisk blodtrykk ble målt ved baseline (12 ukers alder) og deretter ukentlig til slutten av behandlingsperioden. Alle mus ble plassert i metabolske bur med fri tilgang til vann for en 6-times urinsamling. Konsentrasjoner av kreatinin i urin og plasmaurea ble analysert spektrofotometrisk ved å bruke en kolorimetrisk metode (Olympus, AU400). Urinalbuminutskillelse ble målt ved bruk av en spesifikk enzymkoblet immunosorbentanalyse for kvantitativ bestemmelse av albumin i museurin (Crystal Chem, 80630).
Histologi
Nyrerble høstet og fiksert i 4 prosent PBS-bufret formalin. Parafininnstøpte seksjoner (3- mm tykke) ble farget av Masson'strichrome for å evaluere nyremorfologi. Unormaliteter i nyrene ble gradert på grunnlag av tilstedeværelsen og alvorlighetsgraden av komponentavvik, inkludert glomerulosklerose, mesangial ekspansjon, tubulær atrofi eller gips og fibrose. Andelen sklerotisk glomeruli ble evaluert ved en blindundersøkelse av minst 50glomeruli pr.nyreseksjon.
Immunfluorescensfarging av nyreseksjoner og primære podocytter
Faste primære podocytter ble blokkert i TBS-T 3 prosent bovint serumalbumin og inkubert over natten ved 4 grader med primære antistoffer marsvin anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) og kanin anti -grønt FL fluorescerende protein (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Etter TBS-T skylling, FL fluorofor-konjugerte sekundære antistoffer esel anti-marsvin IgG AF594-konjugert antistoff (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) og esel anti-kanin IgG AF488-konjugert antistoff ( Invitrogen, A21206) ble brukt. Bildene ble tatt med et Zeiss 2 ft fluorescerende mikroskop, et AxioCam HRccamera og Axiovision 4.3-programvare.
For formalinfiksert parafininnstøpt (FFPE)nyrer, seksjoner (3 mm) ble avparafinisert og hydrert og antigenutvinning ble utført i oppvarmet sitratbuffer (pH 6). Snitt ble deretter permeabilisert med Triton 0,1 prosent (Euromedex) og blokkert i TBS-T 3 prosent bovint serumalbumin før antistoffinkubering over natten ved 4 C. Vi brukte geite-anti-nefrin (1:100, PROGEN, GP) -N2), marsvin anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), kanin anti-GFP(1:1000, Abcam, ab290), geit anti-Podocalyxin (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556), og kanin anti-Wilms tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192) antistoff. Sekundære antistoffer var Alexa488- og Alexa 568-konjugerte antistoffer fra Invitrogen. Kjerner ble farget i blått ved bruk av Hoechst. Objektglass ble montert ved bruk av et fluorescerende monteringsmedium (Dako, S3023). Mikrofotografier ble tatt med et Zeiss Axiophot fotomikroskop og Axiovision-programvare. Halvautomatiske kvantifiseringer på Fiji ble brukt for kvantifisering av nefrinpositive og PODXLþ områder per glomerulær seksjon på minst 30 glomeruli per mus. Podocytentall ble regnet som antall WT1þ-kjerner per glomerulær seksjon på minst 30 glomeruli per mus.
Transmisjonselektronmikroskopi prosedyre
Små biter av nyrebarken (1 mm3) ble fiksert i 3 prosent glutaraldehydkvalitet (Electron Microscopy Sciences) i 1 til 30 dager og vasket tre ganger i PBS. Prøver ble postfiksert i 1 prosent osmiumtetroksid 0,1 M (elektronmikroskopivitenskap) i 0,1 M PBS (pH 7,4) og vasket i vann. Prøver ble dehydrert i alkoholkvaliteter og 100 prosent propylenoksid (Electron Microscopy Science). Harpiksinfiltrering ble utført som følger: Bland Epikote 812 og propylenoksid i forholdet 1:1 i 30 minutter etterfulgt av blanding Epikote 812 og propylenoksid i forholdet 1:2 for romtemperatur over natten. Prøver ble innebygd i 4 mm gelatinkapsler i 100 prosent Epikote 812 og polymerisert i en ovn oppvarmet til 60 C. Ultratynne seksjoner ble kuttet med en UFC7 ultramikrotom (Leica MicrosystemsGmbH) og avsatt på Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science). De ble motfarget med uranylacetat 7 prosent (LFG Distribution) og Reynolds blycitrat (LFG). Prøver ble undersøkt i JEM1011 transmisjonselektronmikroskop (JEOL) med Orius SC1000 CCD-kameraet (Gatan), operert med Digital Micrograph-programvare (Gatan) for anskaffelse.
Cistanche-nyresykdom
Kvantitativ polymerasekjedereaksjonsgruppe
Nyisolerte glomeruli ble frosset i QIAzol Lysis-reagens (Qiagen) ved -80 grad . Total RNA-ekstraksjon ved bruk av den fenolbaserte metoden ble behandlet i henhold til produsentens anbefalinger. cDNA-er ble syntetisert ved bruk av RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401), og sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR) ble utført ved bruk av en Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) med RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . De kvantitative PCR-platene ble kjørt på en Applied Biosystems StepOnePlus-syklus. Hver array inneholder kvalitetskontroll for revers transkripsjonseffektivitet og genomisk DNA-kontaminering. Kvantitativ PCR-analyse ble utført ved hjelp av 2-DDCT-metoden ved hjelp av GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) og uttrykt som Log2-fold endring i genuttrykk.
I silico proteomisk analyse
In silico-prediksjon av calpain-spaltningsstedet ble gjort med DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) og CaMPDB (http:// calpain.org/) nettverktøy. Museproteinaminosyresekvens ble hentet fra Uniprot (https://www.uniprot.org). Resultatene gjenopptas i tilleggstabellene S1 og S2.
statistiske analyser
Alle grafer representerer individuelle verdier og gjennomsnitt±SEM. Statistiske analyser ble utført ved bruk av GraphPad Prism-programvare, versjon 9. Sammenligning mellom de 2 gruppene ble utført ved hjelp av en parametrisk Student t-test når prøvene besto Anderson-Darling og D'Agostino normalitetstester og F-test for varianslikhet. Ellers ble en ikke-parametrisk Mann-Whitney-test brukt. Sammenligning mellom flere grupper ble utført ved å bruke 1-veis eller 2-veis analyse av varians etterfulgt av en multippel sammenligningstest med Simaks korreksjon. Verdiene av P < 0.05="" ble="" ansett="" som="" signifikante.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
Figur 1|Angiotensin II (AngII) D høysaltdiett (HSD)-indusert hypertensjon hemmer glomerulærautofagi. (a–c) Immunfluorescens av Podocalyxin (PODXL; rød) og P62 (grønn) i glomeruli (a,a0) fra villtype (WT) mus, (b,b0) fra WT-mus etter 6 uker med AngII þ HSD, og (c,c0) fra Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus som viser akkumulering av P62 i podocytter under hypertensjon og i podocyttspesifikk ATG{{1{{12 }}}}mangelfulle mus. Pilspissene indikerer P62þ prikker i WT i (a0 ). Kjerner ble motfarget med Hoechst (blå). Figurunderdeler med primtall indikerer høyere forstørrelse. Stolper=50 mm. (d) Assosiert kvantifisering av P62þ-området uttrykt som prosentandelen av det glomerulære området. n=4 WT-mus og n=5 WT med AngII þ HSD, og Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus. Verdier presenteres som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. Mann-Whitney-test: *P=0.0159. For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen på www.nyre-international.org.
RESULTATER
AngII D høysalt diett-indusert hypertensjon hemmet podocyttautofagi
Podocytter presenterer et høyt nivå avautofagiin vivo, som vist ved sterkt GFP-uttrykk i transgene mus med GFP-fusjon til LC3 (GFP-LC3-mus), en nøkkelmarkør for autofagi (tilleggsfigur S2A). Autofagi er en dynamisk prosess med konstant dannelse av autofagosomer og nedbrytning av autofagolysosomer. Blokkering av autofagosomal nedbrytning med klorokin resulterte i akkumulering av GFPþ-prikker, noe som indikerer høy autofagisk utstrømning i podocytter (tilleggsfigurer S2A og B). Bekreftelse på at GFPþ-prikker var autofagosomer ble vist ved dobbel immuno-FL-fluorescens for GFP og SQSTM1/P62, et chaperoneprotein nedbrutt avautofagi(Supplerende figur S2C og D). Igjen induserte klorokinbehandling akkumulering av GFPþ P62þ prikker, noe som demonstrerer viktig autofagisk effluks i podocytter. Til slutt ble høy autofagisk effluks bevart in vitro som vist ved GFP- og P62-ekspresjon i primære podocytter isolert fra GFP-LC3-mus og sterk akkumulering av GFPþ- og P62þ-prikker under bafilomycin A1-behandling, en annen blokkering av autofagosomal nedbrytning (tilleggsfigur S2E–H) .
Kapasiteten til hypertensjon til å modulere autofagiske podocyttresponser ble deretter vurdert i mus infundert med AngII med en høysaltdiett (HSD) i 6 uker og i ikke-hypertensive kontroller. Som vist i figur 1 induserte AngII þ HSD P62-akkumulering i glomeruli med sterk akkumulering i podocytter, noe som tyder på at AngII þ HSD var ansvarlig for podocyttautofagiblokade (Figur 1a–d). Interessant nok var P62-akkumulering i podocytter lik den som ble observert hos mus med mangel på podocyttautofagi (Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus). I en annen modell for hypertensjon, DOC-saltmodellen, observerte vi også progressiv P62-akkumulering i podocytter langs sykdomsforløpet (tilleggsfigur S3).
Sletting av Atg5 spesifikt i podocytter resulterer i økt albuminuri, tap av podocytter og glomerulær skade i AngII D HSD-modellen
Vi undersøkte så omautofagiblokade kun i podocytter (Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus) påvirker glomerulær skade i AngII þ HSD-modellen. Vi bekreftet først at Nphs2. cre Atg5lox/lox mus hadde normalt blodtrykk, normaltnyrefunksjon, og ingen glomerulære histologiske lesjoner før 10 måneders alder, som tidligere rapportert (Supplerende figur S4).32 Deretter Atg5lox/lox (WT) og Nphs2. cre Atg5lox/lox-mus ble infundert med AngII med HSD i 6 uker. Det er viktig at det systoliske blodtrykket var likt i de to gruppene etter AngII-infusjon i løpet av studien (Figur 2a), selv om halemansjettmetoden som ble brukt til å måle blodtrykket kanskje ikke har evnen til å løse små blodtrykksforskjeller. AngII-infusjon med HSD økte markant urinalbumin-til-kreatinin-forholdet i WT-mus, og denne effekten ble ytterligere signifikant økt i Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus (Figur 2b). Hypertensive Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus viste også signifikant økt glomerulær sklerose sammenlignet med WT-kullkamerater (Figur 2c–e). I samsvar med den målte proteinurien var proteinholdige avstøpninger og tubulær dilatasjon betydelig mer utbredt hos mus med podocyttmangel i ATG5 (figur 2f–h).
Figur 2|Sletting av Atg5 spesifikt i podocytter resulterer i en betydelig økning i albuminuri,nyreskade og tap av podocytter etter 6 uker med angiotensin II (AngII) infusjon D høysaltdiett (HSD). (a) Systolisk blodtrykk i Atg5lox/lox og Nphs2.cre Atg5lox/lox mus i løpet av 36 dager med AngII þ HSD. n=9 mus per genotype. Verdier presenteres som gjennomsnitt ± SEM. Toveis variansanalyse (ANOVA): ns. I (b–m), n=10 mus per genotype. I (b,g,h,k) presenteres verdier som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. (b) AngII þ HSD (forts.)
Figur 2|(fortsatt) resulterte i en dramatisk økning av albuminuri i Nphs2. cre Atg5lox/lox-mus sammenlignet med Atg5lox/lox-kontrollmus. Toveis ANOVA: genotype, P=0.013; tid, P=0.0018. (c–f) Representative bilder av Massons trikrom-fargede deler av glomeruli fra Atg5lox/lox-kontroll og Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus etter 6 uker med AngII þ HSD. Stolper=50 mm i (c,d). Stolper=100 mm i (e,f). (g,h) Sammenligning (g) av andelen sklerotisk glomeruli og (h) av antall rørformede avstøpninger per mikroskopisk felt. Mann-Whitney-test: **P=0.0026 tommer (h), ***P=0.0003 tommer (g). (i,j) Representative immunofluorescensbilder av uttrykket av Wilms Tumor 1 (WT1; rød) og Podocalyxin (PODXL; grønn) i glomeruli fra Atg5lox/lox-kontroll og Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus etter AngII þ HSD i 6 uker. Kjerner ble farget med Hoechst (blå). Stolper=50 mm. (k) Kvantifisering av antall WT1þ-celler per glomerulær seksjon. Mann-Whitney-test: **P=0.0029 tommer (l,m). Representative immunfluorescensbilder av ekspresjonen av CD44 (grønn) i glomeruli fra Atg5lox/lox-kontroll og Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus etter AngII þ HSD i 6 uker. Kjerner ble farget med Hoechst (blå). Stolper=50 mm. (n,o) Representative transmisjonselektronmikroskopifotografier av snitt av glomeruli fra Atg5lox/lox-kontroll og Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus etter AngII þ HSD i 6 uker, som viser podocyttfotprosessutsletting (pilspisser) ved hypertensive Nphs2. cre Atg5lox/lox mus. Stolper=1 mm. n=3 mus per genotype. For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen på www.kidney-international.org.
Figur 3|Calpain uttrykk og aktivitet i podocytter. (a) Western blot-analyse av ekspresjonen av calpain-1, calpain-2 og calpain-4 i primære podocytter. Tubulin-uttrykk fungerer som normalisering. (b) Calpain-aktivitet ble målt på primære podocytter behandlet eller ikke behandlet med angiotensin II (AngII; 100 nM) i 24 timer med eller uten kalpeptin (10 mM). n=5 uavhengige eksperimenter. Verdier presenteres som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. Enveis variansanalyse (ANOVA): behandling, P=0.0035. Sidaks multiple sammenligningstest: *P=0.0128 for AngII versus baseline, ##P=0.0056 for AngII þ calpeptin versus AngII. (c) Calpain-aktivitet ble målt på primære podocytter fra villtype (WT) ellerkalpastatintransgene (CSTTg) mus behandlet eller ikke behandlet med AngII (100 nM) i 24 timer. n=7 uavhengige eksperimenter. Verdier presenteres som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. Toveis ANOVA paret for behandling: genotype, P=0.0483. Sidaks multiple sammenligningstest: ***P=0.0009 for WT AngII versus baseline, *P=0.0420 for CSTTg AngII versus baseline, #P=0}.0424 for WT versus CSTTg AngII. For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen på www.nyre-international.org.
Podocyttantall per glomerulus ble signifikant redusert i Nphs2. cre Atg5lox/lox-mus behandlet med AngII þ HSD (Figur 2i–k). Podocyttskade i Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus med AngII-infusjon þ HSD utviklet seg til og med til fokal og segmentell glomerulosklerose som vist ved ekspresjon av parietal epitelcelle (PEC) aktiveringsmarkør CD44 i glomeruli (Figur 2l og m). Elektronmikroskopi-analyse identifiserte betydelige endringer assosiert med ATG5-mangel ved kronisk AngII-infusjon med HSD, inkludert utsletting av fotprosesser ved hypertensive Nphs2. cre Atg5lox/lox mus. Derimot ble det funnet få ultrastrukturelle defekter i podocytter fra WT-mus selv etter 10 uker med AngII-infusjon med HSD (figur 2n og o), noe som indikerer at den autofagiske aktiviteten til podocytter er nødvendig for deres motstand mot AngII þ HSD-indusert skade. Til sammen indikerte resultatene våre at i AngII þ HSD-modellen,autofagihemming forverrer podocyttskade og tap og induserer påfølgende fokal og segmentell glomerulosklerose.
AngII D HSD aktiverer calpain-aktivitet i podocytter som bidrar til autofagi-blokkering
Ettersom calpain-aktivitet ble funnet (i) å bli aktivert av AngII i flere celletyper og (ii) å spalte flereautofagi-relaterte proteiner,53 lurte vi på om AngII þ HSD-mediert autofagiblokade kunne tilskrives økt AngII-indusert calpainaktivitet. Vi fant først at primære podocytter uttrykte de 3 allestedsnærværende formene av calpains (figur 3a). Vi viste deretter at AngII stimulerte calpain-aktivitet i primære podocytter. Denne økningen i calpain-aktivitet ble blokkert av en selektiv calpain-hemmer (figur 3b). Vi brukte en knock-in mus med ekstrakalpastatintransgenekspresjon (som fører til redusert calpain-aktivitet)43 for å vurdere rollen til calpains i AngII þ HSD-mediertnyreskade og autofagiblokade. Primære podocytter fra CSTTg-mus viste redusert calpain-aktivitet som respons på AngII sammenlignet med podocytter fra kontrollmus (figur 3c). Og dermed,kalpastatinoverekspresjon i podocytter reduserte AngII-mediert calpain-aktivering.
Vi vurderte deretterautofaginivåer i podocytter fra CSTTg-mus. Vi genererte CSTTg-mus med GFP-LC3-transgenet. LC3-GFP-reporter tillot telling av autofagosomer som GFPþ/P62þ-punkter. P62 vil akkumuleres i aggregater i celler når autofagisk utstrømning blokkeres. Ved basaltilstanden telte vi færre GFPþ P62þ-punkter (figur 4a, b og e) og mindre P62-akkumulering (figur 4c, d og f) i podocytter av CSTTg GFP-LC3-mus enn i podocytter fra normale GFP-LC3-mus , noe som tyder på økt autofagisk utstrømning i podocytter fra mus med høy kalpastatinoverflod.
Figur 4|Evaluering av autofagisk effluks i podocytter avkalpastatintransgene (CSTTg) mus. (a,b) Representative immunofluorescensbilder av uttrykket av grønt FL-fluorescerende protein (GFP) (grønt) og P62 (rødt) i glomeruli fra 12-ukegamle GFP-LC3- og CSTTg GFP-LC3-mus. Pilspissene indikerer GFPþ P62þ autofagosomer. (c,d) Representative immunfluorescensbilder av ekspresjonen av P62 (grønn) og Podocalyxin (PODXL; rød) i glomeruli fra 12-uke gamle GFP-LC3- og CSTTg GFP-LC3-mus. Figurunderdeler med primtall indikerer høyere forstørrelse. Kjerner ble farget med Hoechst (blå). Stolper=50 mm. (e) Kvantifisering av antall LC3þ P62þ prikker per podocytt. Mann-Whitney-test: **P= 0.0065. (f) Kvantifisering av P62þ-areal per glomerulær seksjon. Mann-Whitney-test: *P=0.0420. I (e,f), n=5 GFP-LC3-mus og n=8 CSTTg GFP-LC3-mus. Verdier presenteres som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen på www.nyre-international.org.
Autofagisk utstrømning kan overvåkes ved måling av konverteringen av den cytoplasmatiske formen av LC3, LC3-I, til den autofagosomal spaltede og fosfatidyletanolamin-koblede formen av LC3, LC3-II, på Western blot . Podocytter fra CSTTg-mus viste økt LC3-I til LC3-II-konvertering og redusert P62-ekspresjon, både i nærvær og i fravær av bafilomycin A1 (Figur 5a og b), noe som indikerer økt autofagisk effluks i podocytter med calpastatin overekspresjon. Til slutt var akkumuleringen av GFPþ P62þ prikker i podocytter etter klorokinadministrasjon viktigere i CSTTg GFP-LC3 mus enn i GFP-LC3 mus, og bekrefter dermed atkalpastatinoverekspresjon induserer autofagisk effluks i podocytter in vivo (figur 5c–e). Totalt sett tyder våre data på at AngII stimulerer calpain-aktivitet i podocytter, detautofagihemmes av calpain i podocytter, og at hemming av den endogene calpain-aktiviteten ved calpastatin-overekspresjon er tilstrekkelig til å stimulere autofagisk effluks i podocytter.
CSTTg-mus er beskyttet mot AngII D HSD-indusert podocyttskade
CSTTg-mus viste ingennyreendring til minst 12 måneders alder (tilleggsfigur S5). Vi analyserte podocyttskade i CSTTg-mus under AngII þ HSD-behandling. Selv om WT-mus utviklet mild glomerulosklerose og podocyttskade etter 4 uker med hypertensjon, som vist ved unormal ekspresjon av podocalyxin og nephrin, presenterte CSTTg-mus færre sklerotiske glomerulære lesjoner (figur 6a og b) og bevart podocalyxin og nefrinekspresjon 6c (figur 6c) . Slike forskjeller i podocytt-fenotype ble observert på et stadium der tettheten av podocyttkjerner ikke var forskjellig mellom WT og hypertensive CSTTg-mus (Figur 6i–k).
Figur 5|Blokkering av autofagosomal nedbrytning bekreftet økt autofagisk utstrømning av podocytter ikalpastatintransgene (CSTTg) mus. (a) Western blot-analyse av ekspresjonen av LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 og ATG5 i primære podocytter fra villtype (WT) eller CSTTg-mus. Tubulin-uttrykk fungerer som normalisering. Podocytter ble behandlet eller ikke behandlet med bafilomycin A1 (BafA1; 100 nM) i 4 timer før kulturstans. (b) Kvantifisering av LC{{10}}II/tubulin- og P62/tubulin-forhold. n=10 WT-mus og n=8 CSTTg-mus. Verdier presenteres som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. Toveis variansanalyse paret for behandling: for LC3-II/tubulin: genotype, P=0.{{30}}008; behandling, P < 0,0001;="" for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" behandling,="" p="">< 0,0001.="" sidaks="" multiple="" sammenligningstest:="" for="" lc3-ii/tubulin:="" ***p="">< 0,0001="" for="" wt="" pluss="" bafa1="" versus="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" for="" csttg="" pluss="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" for="" wt="" þ="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1;="" for="" p62/tubulin:="" ***p="">< 0,0001="" for="" wt="" pluss="" bafa1="" versus="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" for="" csttg="" pluss="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1.="" (c,d)="" representative="" immunofluorescensbilder="" av="" uttrykket="" av="" grønt="" fl-fluorescerende="" protein="" (gfp;="" grønt)="" og="" p62="" (rødt)="" i="" glomeruli="" fra="" 12-="" uke="" gamle="" gfp-lc3-="" og="" csttg="" gfp-lc3-mus.="" figurunderdeler="" med="" primtall="" indikerer="" høyere="" forstørrelse.="" kjerner="" ble="" farget="" med="" hoechst="" (blå).="" stolper="50" mm.="" mus="" ble="" behandlet="" med="" klorokin="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" timer="" før="" avliving.="" pilspissene="" indikerer="" gfpþ="" p62þ="" autofagosomer.="" (e)="" kvantifisering="" av="" antall="" lc3þ="" p62þ="" prikker="" per="" podocytt.="" n="5" mus="" per="" genotype.="" verdier="" presenteres="" som="" individuelle="" plott="" og="">±SEM. Ikke-paret t-test med lik SD: *P=0.0302. For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen på www.nyre-international.org.
Figur 6 |Calpastatinoverekspresjon forhindrer angiotensin II (AngII) D høysaltdiett (HSD)-mediert podocyttskade. (a,b) Representative bilder av Massons trikrom-fargede deler av glomeruli fra villtype (WT) og calpastatin transgene (CSTTg) mus etter 6 uker med AngII þ HSD. Stolper=50 mm. (c,d,f,g) Representative immunofluorescensbilder av ekspresjonen av (c,d) Podocalyxin (PODXL) og (f,g) nephrin (NPHS1) i WT- og CSTTg-mus etter 6 uker med AngII þ HSD og (e ,h) tilhørende kvantifiseringer. Stolper=50 mm. (i,j) Representative immunofluorescensbilder av uttrykket av Wilms Tumor 1 (WT1; grønn) og PODXL (rød) i glomeruli fra WT- og CSTTg-mus etter 6 uker med AngII þ HSD og (k) assosiert kvantifisering av antall WT1þ celler per glomerulær seksjon. Kjerner ble farget med Hoechst (blå). Stolper=50 mm. I (e,h,k) presenteres verdier som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. n=9 WT-mus og n=7 CSTTg-mus. Ikke-paret t-test med lik SD: **P=0.0095 in (e), *P=0.0249 in (h), P=0.7891 in (k). For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen på www.nyre-international.org.
Tilsvarende, etter 6 uker med hypertensjon, presenterte GFP-LC3- og CSTTg GFP-LC3-mus podocyttskade, men lesjoner var mer fremtredende i GFP-LC3-mus (figur 7). Urinalbumin-til-kreatinin-forholdet var høyere i GFP-LC3-mus etter 4 uker med AngII þ HSD (Figur 7a). Podocyttnummeret var ikke forskjellig mellom de to genotypene, men nefrinekspresjonen var signifikant mer redusert i GFP-LC3 (kontroll) mus (figur 7b–e). Korrelerer medkalpastatin-mediert beskyttelse, ultrastrukturanalysen viste mild og fokal podocyttfotprosessutsletting i GFP-LC3-mus behandlet med AngII þ HSD med bedre bevaring av fotprosessutslettingen i CSTTg-mus, selv om den globale kvantifiseringen av antall fotprosesser per glomerulær kjeller membran (GBM) lengde var ikke statistisk forskjellig, mest sannsynlig fordi podocyttskade er fokal og segmentell i vår modell (figur 7f–h). Merk at makrofager og T-lymfocyttinfiltrasjon inyrervar ikke forskjellige mellom gruppene (tilleggsfigur S6). Til sammen viste disse resultatene detkalpastatinforhindret AngII þ HSD-indusert podocyttskade.
Calpastatin-overekspresjon gjenoppretter autofagisk effluks i podocytter fra mus etter AngII D HSD-behandling
Til slutt lurte vi på omkalpastatin-mediert glomerulær beskyttelse i AngII þ HSD-modellen impliserte autofagivedlikehold i podocytter. Interessant nok ble AngII þ HSD-indusert P62-akkumulering i podocytter forhindret i CSTTg- og GFP-LC3 CSTTg-mus (figur 8a–d), noe som indikerer at calpastatin forhindret blokkering av podocyttautofagi. Merk at antallet GFPþ P62þ prikkermerking av autofagosomer var likt i podocytter fra hypertensive GFP-LC3 og GFP-LC3 CSTTg mus, noe som tyder på at AngII þ HSD induserte en nedgang i podocytt autofagisk effluks i stedet for en fullstendig arrestasjon (Figur 8e– g).
In silico-prediksjon av calpain-spaltningsstedet i podocyttproteiner
Vi brukte flere in silico-verktøy for å forutsi potensielle calpain-mål i podocytter (tilleggstabeller S1 og S2). Tre online databaser ble sammenlignet: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 og DeepCalpain.56 I silico-analyse identifiserte flere podocyttproteiner, nefrin og podocin blant dem, som kunne spaltes av kalpainer. Og dermed,kalpastatin-mediert glomerulær beskyttelse kan være knyttet til en reduksjon av calpains enzymaktivitet, noe som fører til redusert nedbrytning av enkelte podocyttproteiner.
Videre minst 3autofagi-relaterte proteiner er direkte mål for calpains. ATG5 spaltes av kalpainer, noe som fører til en forstyrrelse i ATG12-ATG5-kompleksdannelsen.57,58 Administrering av kalpainhemmere in vivo forhindret også spaltning av autofagiproteinet Beclin-1.59 In silicoanalyse av det antatte spaltningsstedet på autofagi-relaterte proteiner støtter hypotesen om at calpain kan regulere autofagi gjennom enzymatisk spaltning av autofagiproteiner.
Cistanche-nyrefunksjon
mRNA-ekspresjon av endoplasmatisk retikulum (ER) og oksidative stressmarkører i glomeruli fra mus behandlet med AngII pluss HSD
Vi evaluerte endoplasmatisk retikulum (ER) stress og oksidativt stress ved kvantitativ PCR i glomeruli under AngII þ HSD behandling (tabell 1). Ved baseline observerte vi ingen endring i mRNA-ekspresjon av analyserte gener i glomeruli fra WT- og Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus (tilleggsfigur S7). Etter 6 uker med hypertensjon, glomeruli fra Nphs2. cre Atg5lox/lox-mus viste forskjellig mRNA-profil av gener fra ER-stress- og oksidativt stress-veier med økt ekspresjon av Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 og Hsp90b1 sammenlignet med WT glomeruli, og antyder dermed atautofagiuttømming i podocytter favoriserte AngII þ HSD-indusert ER-stress og oksidativt stress. Omvendt presenterte glomeruli fra CSTTg-mus nedregulering av flere gener av ER-stress- og oksidativt stress-veier, samt redusert ekspresjon av noen pro-apoptotiske gener (figur 9).
Til sammen indikerer disse resultatene detkalpastatinoverekspresjon kan forhindre glomerulær skade ved å redusere AngII þ HSD-indusert ER og oksidativt stress.
DISKUSJON
I denne studien demonstrerte vi at i AngII þ HSD-indusert hypertensjon, er podocyttautofagi markant nedregulert. Videre var mus med podocyttspesifikk sletting av Atg5 mer utsatt for AngII þ HSD-indusert glomerulosklerose og podocytt-tap, og viste dermed atautofagii podocytter forhindrer utviklingen av hypertensiv nefropati, og fremhever den kritiske rollen til autofagi i AngII þ HSD-indusert podocyttskade. Lite er kjent om de ekstracellulære stimuli som regulerer cellulær autofagi, og disse resultatene kaster lys over den patofysiologiske reguleringen av podocyttautofagi av AngII.
I de fleste humane glomerulopatier er utsletting av podocyttfotprosessen et kjennetegn på glomerulær skade som fører til proteinuri. Autofagi vil sannsynligvis spille en viktig rolle for å opprettholde podocyttfunksjonen fordi disse terminalt differensierte cellene viser høye forekomster avautofagiselv i fravær av stress. En tidligere studie viste at AngII fremmer autofagi gjennom generering av reaktive oksygenarter i en betinget udødeliggjort murin podocyttcellelinje.60 Produksjon av reaktive oksygenarter er faktisk en generell induser av autofagi i mange celletyper, og årsakene til slike uoverensstemmelser med funnene våre er uklar. I motsetning til denne sistnevnte studien brukte vi murine primære dyrkede podocytter som beholdt podocin- og nefrinuttrykk og in vivo-tilnærminger og ikke murine cellelinjer. Vi bekrefter tidligere rapporter om at postmitotiske podocytter viser et uvanlig høyt nivå av konstitutivautofagi. Måling av den økte mengden LC3-II etter AngII-stimulering i nærvær eller fravær av lysosomale inhibitorer er nødvendig for å avgjøre om autofagisk utstrømning er økt eller blokkert. Tidligere studier har neglisjert dette fenomenet.60
Figur 7 |Calpastatinoverekspresjon forhindrer angiotensin II (AngII) D høysaltdiett (HSD) -mediert podocyttskade i grønt FL fluorescerende protein (GFP) -LC3 mus. (a) AngII þ HSD resulterte i en dramatisk økning av albuminuri i GFP-LC3 mus sammenlignet med CSTTg (calpastatin transgene) GFP-LC3 mus. n=8 til 13 mus per genotype. Verdier presenteres som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. Toveis variansanalyse: genotype, P=0.0429; tid, P=0.0165. Sidaks multiple sammenligningstest: *P=0.0453 for GFP-LC3 versus CSTTg GFP-LC3 mus på dag 28. (b,c) Representative immunfluorescensbilder av uttrykket av Wilms tumor 1 (WT1; grønn) og nefrin (NPHS1) (rød) i glomeruli fra 18-uke gamle GFP-LC3- og CSTTg GFP-LC3-mus etter 6 uker med AngII-infusjon þ HSD. Kjerner ble farget med Hoechst (blå). Stolper=50 mm. Kvantifisering av (d) NPHS1þ areal per glomerulær seksjon og (e) antall WT1þ celler per glomerulær seksjon i 18-uke gamle GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 mus etter 6 uker med AngII infusjon þ HSD. n=19 GFP-LC3-mus og n=25 CSTTg GFP-LC3-mus. Verdier presenteres som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. Ikke-paret t-test med lik SD: **P=0.0010 in (d), P= 0.1158 in (e). (f,g) Transmisjonselektronmikroskopibilder av glomeruli fra GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 mus etter 6 uker med AngII þ HSD. Pilspissene indikerer utsletting av fotprosessen. Stolper=1 mm. (h) Kvantifisering av antall fotprosesser per mikrometer glomerulær basalmembran (GBM). n=3 mus per genotype. Verdier presenteres som individuelle plott og gjennomsnittlig SEM. Hvert plott representerer gjennomsnittlig antall podocytter per mikrometer GBM på 1 kontinuerlig lengde av GBM. Ikke-paret t-test med lik SD: P=0.7512. For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen på www.nyre-international.org.
Her brukte vi en hypertensiv modell basert på AngII perfusjon og HSD. Podocytter viser AT1-reseptorer og er eksponert for fritt filtrerte peptider som AngII.13,16,26,61–65. Det antas at de observerte renobeskyttende effektene av RAAS-hemming kan skyldes – i det minste delvis – en blokkade av denne podocytten. spesifikke RAAS. Likeledes bekreftet in vivo-studier effekten av AngII på podocyttskade og podocyttspesifikk genmålretting av AT1 viste at aktivering av AT1-reseptorer i glomerulus ved eksperimentell lupusnefritt er tilstrekkelig til å akselererenyreskade i fravær av hypertensjon.66,67 Calpain-mediertautofagidysregulering i vår modell kan være knyttet til direkte AngII-AT1-signalering på podocytter eller å være en konsekvens av hypertensjon. Vi kan gi et tidlig svar på dette spørsmålet. Faktisk, i DOC-saltmodellen fant vi også P62-akkumulering i podocytter fra hypertensive mus (tilleggsfigur S3). Dette antyder at autofagiblokkering forekommer i podocytter i denne modellen, som antas å være uavhengig av AngII.68 Ytterligere studier som evaluerer podocyttskade knyttet til calpain-aktivitet og autofagisk utstrømning hos mus som mangler AT1 i podocytter selektivt ville være nødvendig for å avgrense om slik regulering av podocyttautofagi avhenger av direkte eller indirekte effekter av AngII.
Figur 8 |Calpastatinoverekspresjon forhindrer angiotensin II (AngII) D høysalt diett (HSD)-indusertautofaginedregulering i podocytter. (a,b) Representative immunfluorescensbilder av uttrykket av P62 (grønn) og Podocalyxin (PODXL; rød) i glomeruli fra grønt FL fluorescerende protein (GFP) – LC3 og CSTTg (kalpastatintransgene) GFP-LC3-mus etter 6 uker med AngII þ HSD. Figurunderdeler med primtall indikerer høyere forstørrelse. Kjerner ble farget med Hoechst (blå). Stolper=50 mm. (c,d) Kvantifisering av P62þ-areal per glomerulær seksjon. n=9 villtypemus (WT) og n=7 CSTTg-mus i (c), og n=16 GFP-LC3-mus og n=16 CSTTg GFP-LC3-mus i (d). Verdier presenteres som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. Mann-Whitney-test: **P=0.0033 in (c), **P=0.0011 in (d). (e,f) Representative immunofluorescensbilder av uttrykket av GFP (grønn) og P62 (rød) i glomeruli fra GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 mus etter 6 uker med AngII þ HSD. Figurunderdeler med primtall indikerer høyere forstørrelse. Pilspissene indikerer GFPþ P62þ autofagosomer. (g) Kvantifisering av antall LC3þ P62þ prikker per podocytt. n=11 GFP-LC3-mus og n=16 CSTTg GFP-LC3-mus. Verdier presenteres som individuelle plott og gjennomsnitt±SEM. Ikke-paret t-test med lik SD: P=0.1014. For å optimalisere visningen av dette bildet, se nettversjonen av denne artikkelen på www.nyre-international.org.
Tabell 1|Custom RT2 Profiler PCR Array
Calpain-1 og calpain-2 er allestedsnærværende pro-inflammatoriske proteaser, hvis aktivitet kontrolleres avkalpastatin, deres spesifikke hemmer. Faktisk hemmer calpastatin selektivt calpains og ingen andre proteaser til dags dato. Calpain-aktivering har nylig blitt koblet tilnyreskade i flere patologiske sammenhenger.69,70 Kalsiumkanaltransportørens transient reseptorpotensialkanal C6 ble funnet å aktivere calpain-1 i podocytter via Ca2þ/calcineurin-aktivering. Nyrene til pasienter med fokal og segmentell glomerulosklerose hadde økt transient reseptorpotensialkanal C6-ekspresjon, økt calpain- og calcineurin-aktivitet og redusert ekspresjon av calpain-targettalin-1, som er kritisk for podocyttcytoskjelettstabilitet.71 Transient reseptorpotensialkanal C6 binder seg også direkte til calpain-1 og calpain-2. Denne interaksjonen er avgjørende for reguleringen av talin{11}}-spalting og kontroll av motiliteten til podocytter.72
Transgene mus som overuttrykkerkalpastatiner beskyttet mot vaskulær remodellering og AngII-avhengig betennelse73; mot betennelse i modeller av glomerulonefritt,43 sepsis,74 eller allograftavstøtning75; og mot aldersrelatert betennelse.76 Podocyttskade hos disse musene er ikke undersøkt. Peltier et al. viste at overuttrykk avkalpastatinforhindret AngII-avhengig perivaskulær betennelse i nyrer.43 Dermed kunne nyrebeskyttelse hos CSTTg-mus formidles, i det minste delvis, av en anti-inflammatorisk mekanisme. Vi evaluerer makrofager og lymfocyttinfiltrasjon i modellen vår og fant ingen signifikant forskjell inyrebetennelse mellom CSTTg og kontrollmus når man analyserer globalnyreleukocyttinfiltrasjon (tilleggsfigur S6).
Calpain var nylig involvert i autofagiregulering (anmeldt nylig i Weber et al.53) med interessante og biobeskyttende egenskaper ved calpainhemming i diabetisk sammenheng gjennom gjenoppretting avautofagi.77 Her rapporterte vi at calpain hemming gjennomkalpastatinoverekspresjon (i) forhindret podocyttskade under hypertensjon og (ii) gjenopprettet autofagi i podocytter, og fremhever dermed en ny, skadelig rolle av calpain-aktivering under hypertensjon gjennom hemming avautofagi.
Nesten alle ATG-proteiner ble vist å bli spaltet av calpains in vitro. 78 Her postulerte vi detautofagivedlikehold hos hypertensive CSTTg-mus ble mediert av kalpain-hemming. For å støtte hypotesen vår viste vi at podocytter fra CSTTg har en redusert calpain-aktivitet når de utfordres med AngII in vitro (figur 3c). Vi fant økt ATG5-proteinnivå i podocytter fra CSTTg-mus, noe som tyder på at calpastatin-overuttrykk forhindret calpain-mediert ATG5-spaltning i denne sammenhengen (Figur 5a). I motsetning ble det vist detkalpastatin-mediert calpain-hemming kan være uavhengig av hemmingen av deres proteaseaktivitet79; dermed kunne vi ikke utelukke regulering av autofagi av calpastatin uavhengig av calpains enzymaktivitet.
Oppsummert avslørte disse funnene en tidligere ukjent rollekalpastatini reguleringen av podocyttautofagiog ga ledetråd for undersøkelsen av nye terapeutiske strategier for å forbedre podocyttoverlevelsen under hypertensive nefropatier.
FORMIDLING
Alle forfatterne erklærte ingen konkurrerende interesser.
TAKK
Dette arbeidet ble støttet av Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) og Université de Paris. IB ble støttet av et stipendiat fra Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie. OL ble finansiert gjennom en European Foundation for the Study of Diabetes (EFSD)-pris støttet av EFSD/Novo Nordisk Program for DiabetesResearch in Europe og et stipend fra Société Francophone duDiabète (SFD). BR og CH ble finansiert av Starting Grant 107037 fra European Research Council and the European Union (P-LT). YS ble støttet av et stipendiatstipend fra Fondation de France.
Vi takker Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac og ERIU970-teamet (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Frankrike) for hjelp med dyrepleie og håndtering, Nicolas Sorhaindo for biokjemiske målinger (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat , Paris, Frankrike), og Alain Schmitt og Jean-Marc Masse for transmisjonselektronmikroskopi (Institut Cochin, Paris, Frankrike). Vi takker Morgane Le Gall (Cochin proteomiske anlegg 3P5, Paris, Frankrike) for hjelp i silicoanalyse. Vi erkjenner administrativ støtte fra Véronique Oberweis, Bruno Pillard og Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Frankrike).
TILLEGGSMATERIALE
Tilleggsfil (PDF)
Figur S1. Primær podocyttkultur uttrykker podocyttmarkører. Western blot-analyse av uttrykket av podocyttmarkørene NPHS1 og NPHS2 i primær podocyttkultur fra WT- og CSTTg-mus. Tubulin (TUBA) fungerer som en lastekontroll. Representant for n=4 mus per genotype.
Figur S2. Det høye basale nivået av podocyttautofagi. (A, B) Representative immunfluorescensbilder av uttrykket av GFP (grønn) og NPHS1 (rød) i glomeruli fra GFP-LC3-mus behandlet eller ikke med CQ (80mg/kg) 4 timer før avliving. Pilspisser viser GFPþ autofagosomer. (C,D) Representative immunfluorescensbilder av uttrykket av GFP (grønn) og P62 (rød) i glomeruli fra GFP-LC3-mus behandlet eller ikke med CQ (80 mg/kg) 4 timer før avliving. Pilspisser viser GFPþ P62þ autofagosomer. (A–D) (0 ) representerer høyere forstørrelse. Kjerner ble farget med Hoechst (blå). Bar=50 mm. N=4 mus per tilstand (E–H) Representative immunfluorescensbilder av ekspresjonen av GFP (grønn) og P62 (rød) i primære podocytter fra GFP-LC3-mus behandlet (F, H) eller ikke (E, G) ) med Bafifilomycin A1 (100 nM) i 4 timer. N=5 mus per tilstand.
Figur S3. P62 akkumuleres i podocytter i DOC-saltmodellen for hypertensjon. (A–C) Representative immunfluorescensbilder av uttrykket av P62 (grønn) og PODXL (rød) i glomeruli fra WT-mus etter 2 til 6 uker med DOC-saltmodell. (0 ) representerer høyere forstørrelse. Kjerner ble farget med Hoechst (blå). Bar ¼ 50 mm. (D) Kvantifisering av P62-areal per podocyttareal (prosent). N=5–6 mus per tilstand. Enveis variansanalyse: tid P=0.0059, Sidaks multiple sammenligningstest: D42 versus D14 **P=0.0055, D28 versus D14 P=0.8590.
Figur S4. Podocyttautofagier uunnværlig for utvikling av podocytter. (A) systolisk blodtrykk, (B) urinalbumin-til-kreatinin-forhold, og (C) blodurea-nitrogennivåer i Atg5lox/lox og Nphs2.cre Atg5lox/lox-mus. N=5–6 mus per genotype. Verdier presenteres som individuelle tomter og virkemidler±SEM. Mann-Whitney test: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) og P=0.6623 (C). (D–E) Representative bilder av Massons trikrom-fargede deler av glomeruli fra Atg5lox/lox og Nphs2.cre Atg5lox/lox mus. (F–G) Representative immunfluorescensbilder av uttrykket av PODXL (grønn) og WT1 (rød) i Atg5lox/lox og Nphs2.cre Atg5lox/lox mus. Kjerner ble farget med Hoechst (blå). (D–G) Bar=50 mm. N ¼ 6 mus per genotype. (H–I) Representative mikrofotografier av transmisjonselektronmikroskopiske snitt av glomeruli fra Atg5lox/lox og Nphs2.cre Atg5lox/lox mus. Bar=1 mm. N=3 mus per genotype.
Figur S5.Calpastatinoveruttrykk påvirker ikkenyrefunksjon ved baseline. (A) blodureanitrogen og (B) plasmaalbuminnivåer i 12-ukegamle GFP-LC3- og CSTTg GFP-LC3-mus. N=5 GFP-LC3 og N=6 CSTTg GFP-LC3. Verdier presenteres som individuelle tomter og virkemidler±SEM. Mann-Whitney test: P=0.6623 (A) og P=0.9307 (B). (C, D) Representative bilder av Massons trikrom-fargede deler av glomeruli fra GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 mus. (E–H) Representative immunfluorescensbilder av uttrykket av PODXL (E, F) og NPHS1 (G, H) i GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 mus. (C–H) Bar=50 mm. (I, J) Assosiert kvantifisering av PODXL- og NPHS1-areal per glomerulær seksjon. N=5 GFP-LC3 og N=6 CSTTg GFP-LC3. Verdier presenteres som individuelle tomter og virkemidler±SEM. Mann-Whitney test: P=0.1898 (A) og P=0.8413 (B).
Cistanche-nyrefunksjon
Figur S6.Calpastatinoverekspresjon påvirker ikke global nyrebetennelse. Representativ immunhistokjemi av uttrykket av F4/80 (A, B) og CD3 (D–E) i GFP-LC3 og CSTTg GFP-LC3 mus etter 6 uker med Angiotensin II þHSD. Bar=200 mm. (C, F) Tilhørende kvantifisering av F4/80 og CD3 areal prnyreseksjon. N=7 CSTTg GFP-LC3- og N=8 GFP-LC3-mus. Verdier presenteres som individuelle plott og betyr SEM. Mann-Whitney test: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).
Figur S7. Podocyttautofagideficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
Tabell S1. In silico forebygging av calpain-spaltningssteder. Calpain-spaltningssteder ble forutsagt i podocytt-relaterte og autofagi-relaterte proteiner med GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP://calpain.org) og DeepCalpain Predict (http://deepcalpain. cancerbio. info/help.php). Tilleggsfil (Excel)
Tilleggstabell S2. Den fullstendige filen av in silico prevision of calpain cleavage sites. Calpain-spaltningssteder ble spådd i podocytt-relaterte ogautofagi-relaterte proteiner med GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) og DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Prediksjonsspaltningssteder gjenopptas for hvert protein for GPS-CCD og DeepCalpain Predict.
REFERANSER
1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA, et al. Forekomst av kroniskenyresykdom i USA. JAMA. 2007;298:2038–2047.
2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C, et al. Hvem bør målrettes for CKD-screening? Effekten av diabetes, hypertensjon og hjerte- og karsykdommer. Am J Kidney Dis. 2009;53:S71–S77.
3. Chang TI, Li S, Chen SC, et al. Risikofaktorer for ESRD hos individer med bevart estimert GFR med og uten albuminuri: resultater fra Kidney Early Evaluation Program (KEEP). Am J Kidney Dis. 2013;61:S4–S11.
4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J, et al. Forhøyet blodtrykk og risiko for nyresykdom i sluttstadiet hos personer uten nyresykdom ved baseline. Arch Intern Med. 2005;165:923–928.
5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S, et al. Podocyttskade ligger til grunn for glomerulopatien til Dahl salthypertensive rotter og reverseres av aldosteronblokker. Hypertensjon. 2006;47:1084–1093.
6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST, et al. Urin podocyttutskillelse som markør for svangerskapsforgiftning. Am J Obstet Gynecol. 2007;196, 320.e321–e327.
7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, et al. Podocyturi går foran proteinuri og kliniske trekk ved preeklampsi: en langsgående prospektiv studie. Hypertensjon. 2013;61:1289–1296.
8. Wang G, Lai FM, Kwan BC, et al. Podocyttap ved human hypertensiv nefrosklerose. Am J Hypertens. 2009;22:300–306.
9. Wang G, Kwan BC, Lai FM, et al. Intrarenal ekspresjon av miRNA hos pasienter med hypertensiv nefrosklerose. Am J Hypertens. 2010;23:78–84.
10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, et al. Kroniske proteinuriske nefropatier: utfall og respons på behandling i en potensiell kohort på 352 pasienter med forskjellige mønstre av nyreskade. Am J Kidney Dis. 2000;35:1155–1165.
11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP, et al. Angiotensin II-avhengig vedvarende podocytttap fra destabiliserte glomeruli forårsaker progresjon av sluttstadietnyresykdom. Nyre Int. 2012;81:40–55.
12. Tuncdemir M, Ozturk M. Effektene av angiotensin-II-reseptorblokkere på podocyttskade og glomerulær apoptose i en rottemodell av eksperimentell streptozotocin-indusert diabetisk nefropati. Acta Histochem. 2011;113:826–832.
13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG, et al. Angiotensin II bidrar til podocyttskade ved å øke TRPC6-ekspresjonen via en NFAT-mediert positiv tilbakemeldingssignalvei. Am J Pathol. 2011;179:1719–1732.
14. EUCLID-studiegruppen. Randomisert placebokontrollert studie av lisinopril hos normotensive pasienter med insulinavhengig diabetes og normoalbuminuri eller mikroalbuminuri. Lancet. 1997;349:1787-1792.
15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH, et al. Proteinuri, et mål for renobeskyttelse hos pasienter med type 2 diabetisk nefropati: leksjoner fra RENTAL. Nyre Int. 2004;65:2309–2320.
16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Endringer i glomerulær perm-selektivitet indusert av angiotensin II innebærer podocyttdysfunksjon og omorganisering av spaltediafragmaprotein. Semin Nephrol. 2004;24:131–140.
17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Karakterisering av angiotensin II reseptor subtyper i podocytter. J Lab Clin Med. 2003;142:313–321.
18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, et al. Proteinuri og uttrykket av podocyttspaltens diafragmaprotein, nefrin, ved diabetisk nefropati: effekter av angiotensin-konverterende enzymhemming. Diabetologia. 2002;45:1572–1576.
19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, et al. Effekter av angiotensin-konverterende enzymhemmer, angiotensin II-reseptorantagonist og kalsiumantagonist på urinpodocytter hos pasienter med IgA nefropati. Am J Nephrol. 2000;20:373–379.
20. Henger A, Huber T, Fischer KG, et al. Angiotensin II øker den cytosoliske kalsiumaktiviteten i rottepodocytter i kultur. Nyre Int. 1997;52: 687-693.
21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C, et al. Langsiktige gunstige effekter av angiotensin-konverterende enzymhemming hos pasienter med nefrotisk proteinuri. Am J Kidney Dis. 1992;20:240–248.
22. Nitschke R, Henger A, Ricken S, et al. Angiotensin II øker den intracellulære kalsiumaktiviteten i podocytter i den intakte glomerulus.NyreInt. 2000;57:41–49.
23. Gloy J, Henger A, Fischer KG, et al. Angiotensin II modulerer cellulære funksjoner til podocytter. Nyre Int Suppl. 1998;67:S168–S170.
24. Miceli I, Burt D, Taraba E, et al. Stretch reduserer nefrinekspresjon via en angiotensin II-AT(1)-avhengig mekanisme i humane podocytter: effekt av rosiglitazon. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;298:F381–F390.
25. Endlich N, Endlich K. Strekk, spenning og adhesjon—adaptive mekanismer for aktincytoskjelettet i podocytter. Eur J Cell Biol. 2006;85:229–234.
26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K, et al. Aktivering av et lokalt vevsangiotensinsystem i podocytter ved hjelp av en mekanisk belastning. Nyre Int. 2004;65:30–39.
27. Riser BL, Cortes P, Heilig C, et al. Syklisk strekkkraft oppregulerer selektivt transformerende vekstfaktor-beta-isoformer i dyrkede mesangiale rotteceller. Am J Pathol. 1996;148:1915–1923.
28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Podocyttskade er et kritisk skritt i utviklingen av glomerulosklerose hos den hypertensive rotten med uni nephrectomized-desoxycorticosterone. Virchows Arkiv. 1994;425:181–193.
29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J, et al. Tap av autofagi reduserer bukspyttkjertelens beta-cellemasse og funksjon med resulterende hyperglykemi. Cell Metab. 2008;8:318–324.
30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M, et al.Autofagier viktig i holme-homeostase og kompenserende økning av beta-cellemasse som respons på et fettrikt kosthold. Cell Metab. 2008;8:325–332.
31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C, et al. Endotelcelle- og podocyttautofagi beskytter synergistisk mot diabetes-indusert glomerulosklerose. Autofagi. 2015;11:1130–1145.
32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C, et al. Autofagi påvirker følsomheten for glomerulær sykdom og opprettholder podocytthomeostase hos aldrende mus. J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.
33. Sato S, Kitamura H, Adachi A, et al. To typer autofagi i podocyttene i nyrebiopsiprøver: en ultrastrukturell studie. J Submicrosc Cytol Pathol. 2006;38:167–174.
34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I, et al. MAP-LC3, en lovende autofagosomal markør, behandles under differensiering og utvinning av podocytter fra PAN nefrose. FASEB J. 2003;17:1165–1167.
35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al.Autofagibekjemper sykdom gjennom cellulær selvfordøyelse. Natur. 2008;451:1069–1075.
36. Yang L, Li P, Fu S, et al. Defekt leverautofagi ved fedme fremmer ER-stress og forårsaker insulinresistens. Cell Metab. 2010;11:467–478.
37. Xie Z, Klionsky DJ. Autophagosomdannelse: kjernemaskineri og tilpasninger. Nat Cell Biol. 2007;9:1102–1109.
38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Næringsføling, autofagi og diabetisk nefropati. Diabetes. 2012;61:23–29.
39. Kume S, Uzu T, Maegawa H, et al. Autofagi: et nytt terapeutisk mål fornyresykdommer. Clin Exp Nephrol. 2012;16:827–832.
40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. Fremvoksende rolleautofagii nyrefunksjon, sykdommer og aldring. Autofagi. 2012;8:1009–1031.
41. Weide T, Huber TB. Implikasjoner av autofagi for glomerulær aldring og sykdom. Cell Tissue Res. 2011;343:467–473.
42. Bork T, Liang W, Yamahara K, et al. Podocytter opprettholder høye basale nivåer av autofagi uavhengig av mtor-signalering. Autofagi. 2020;16:1932–1948.
43. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Calpain-aktivering og sekresjon fremmer glomerulær skade ved eksperimentell glomerulonefritt: bevis frakalpastatin-transgene mus. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–3423.
44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A, et al. Podocytt-spesifikk uttrykk for Cre-rekombinase i transgene mus. Genesis. 2003;35:39–42.
45. Hara T, Nakamura K, Matsui M, et al. Undertrykkelse av basal autofagi i nevrale celler forårsaker nevrodegenerativ sykdom hos mus. Natur. 2006;441: 885–889.
46. Lazareth H, Henique C, Lenoir O, et al. Tetraspanin CD9 kontrollerer migrasjon og spredning av parietale epitelceller og glomerulær sykdomsprogresjon. Nat Commun. 2019;10:3303.
47. Bollee G, Flamant M, Schordan S, et al. Epidermal vekstfaktorreseptor fremmer glomerulær skade og nyresvikt ved raskt progressiv halvmåneglomerulonefritt. Nat Med. 2011;17:1242–1250.
48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A, et al. Direkte virkning av endotelin-1 på podocytter fremmer diabetisk glomerulosklerose. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1050–1062.
49. Henique C, Bollee G, Lenoir O, et al. Nukleær faktor erytroid 2-relatert faktor 2 driver podocyttspesifikk ekspresjon av peroksisomproliferatoraktivert reseptor g som er avgjørende for resistens mot halvmåne GN. J Am Soc Nephrol. 2016;27:172–188.
50. Perez J, Dansou B, Herve R, et al. Calpains frigjort av T-lymfocytter spalter TLR2 for å kontrollere IL-17-ekspresjon. J Immunol. 2016;196:168–181.
51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S, et al. Calpain/kalpastatinsystemet har motsatte roller i vekst og metastatisk spredning av melanom. PLoS One. 2013;8:e60469.
52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D, et al. Calpains bidrar til vaskulær reparasjon i den raskt progressive formen for glomerulonefritt: potensiell rolle av eksternalisering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:335–342.
53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E, et al. Å drepe to sinte fugler i en smekk:autofagiaktivering ved å hemme calpains i nevrodegenerative sykdommer og utover. Biomed Res Int. 2019;2019:4741252.
54. Liu Z, Cao J, Gao X, et al. GPS-CCD: et nytt beregningsprogram for prediksjon av calpain-spaltningssteder. PLoS One. 2011;6:e19001.
55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y, et al. CaMPDB: en ressurs for calpain og modulerende proteolyse. Genom Inform. 2010;22:202–213.
56. Liu ZX, Yu K, Dong J, et al. Nøyaktig prediksjon av calpain-spaltningssteder og deres avvik forårsaket av mutasjoner i kreft. Front Genet. 2019; 10: 715.
57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I, et al. Calpain-mediert spaltning av Atg5 bytter autofagi til apoptose. Nat Cell Biol. 2006;8:1124–1132.
58. Xia HG, Zhang L, Chen G, et al. Kontroll av basal autofagi ved calpain1-mediert spalting av ATG5.Autofagi. 2010;6:61–66.
59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A, et al. Calpain-mediert spalting av Beclin-1 og autofagi deregulering etter retinal iskemisk skade in vivo. Celledød Dis. 2011;2:e144.
60. Yadav A, Vallabu S, Arora S, et al. ANG II promotererautofagii podocytter. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299:C488–C496.
61. Flannery PJ, Spurney RF. Transaktivering av den epidermale vekstfaktorreseptoren av angiotensin II i glomerulære podocytter. Nephron Exp Nephrol. 2006;103:e109–e118.
62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM, et al. Immunhistokjemisk lokalisering av ANG II AT1-reseptor i voksen rottenyreved bruk av et monoklonalt antistoff. Am J Physiol. 1997;273:F170–F177.
63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, et al. Funksjonelt uttrykk av renin-angiotensin-systemet i humane podocytter. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;290:F710–F719.
64. Pavenstadt H. Franz Volhard-prisen 2000: angiotensin II-signalering i podocytten. Nyre Blood Press Res. 2000;23:156–158.
65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. Renin-angiotensin-aldosteronsystemet i podocytter. Semin Nephrol. 2012;32:377–384.
66. Jia J, Ding G, Zhu J, et al. Angiotensin II-infusjon induserer endringer i nefrinekspresjon og podocyttapoptose. Am J Nephrol. 2008;28:500– 507.
67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P, et al. Glomerulære type 1 angiotensinreseptorer forsterker nyreskade og betennelse ved murin autoimmun nefritt. J Clin Invest. 2009;119:943–953.
68. Song K, Stuart D, Abraham N, et al. Innsamling av kanalrenin medierer ikke DOCA-salt hypertensjon eller nyreskade. PLoS One. 2016;11: e0159872.
69. Liu Z, Ji J, Zheng D, et al. Beskyttende rolle av endotelial calpain knockout i lipopolysakkarid-indusert akuttnyreskade via demping av p38-iNOS-banen og NO/ROS-produksjon. Exp Mol Med. 2020;52:702– 712.
70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Calpain-10-aktivitet ligger til grunn for angiotensin II-indusert aldosteronproduksjon i en adrenal glome rulosa-cellemodell. Endokrinologi. 2015;156:2138–2149.
71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Den kalsiumavhengige proteasen calpain-1 kobler TRPC6-aktivitet til podocyttskade. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–2109.
72. Farmer LK, Rollason R, Whitcomb DJ, et al. TRPC6 binder seg til og aktiverer calpain, uavhengig av dets kanalaktivitet, og regulerer podocyttcytoskjelett, celleadhesjon og motilitet. J Am Soc Nephrol. 2019;30: 1910–1924.
73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A, et al. Målretting mot calpain/calpastatin-systemet som en ny strategi for å forhindre kardiovaskulær ombygging ved angiotensin II-indusert hypertensjon. Circ Res. 2008;102:720–728.
74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.Calpastatinkontrollerer polymikrobiell sepsis ved å begrense frigjøring av prokoagulerende mikropartikler. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.
75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M, et al. Kritisk rolle for calpain/calpastatin-balansen ved akutt allograftavstøtning. Eur J Immunol. 2011;41: 473–484.
76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S, et al. Spesifikk calpain-hemming beskytternyremot betennelse. Sci Rep. 2017;7:8016.
77. Ong SB, Lee WH, Shao NY, et al. Calpain-hemming gjenopprettesautofagiog forhindrer mitokondriell fragmentering i en human iPSC-modell av diabetisk endo liopatien. Stamcelle rep. 2019;12:597–610.
78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. In vitro-spaltingen av de høye proteinene ved celledødsproteaser. Autofagi. 2010;6:1042–1056.
79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M, et al. Differensiell regulering av calpain-calpastatin-komplekset av L-domenet tilkalpastatin. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.