Effektiviteten av antioksidanter i kostholdsbiprodukter på indusert CYP-genekspresjon og histologisk endring hos smågriser, lever og nyre som fôres med aflatoksin B1 og okratoksin A
Feb 26, 2022
Abstrakt:Hensikten med denne studien var å undersøke potensialet til en biproduktblanding avledet fra druefrø- og tindvedoljeindustrien for å redusere den skadelige skaden produsert av ochratoksin A og aflatoksin B1 på lever- ognyrenivå hos smågris etter avvenning. Førti kryssoppdrettede TOPIGS-40 hybridgriser etter avvenning ble tildelt tre eksperimentelle grupper (E1, E2, E3) og en kontrollgruppe (C), og fôret med eksperimentelle dietter i 30 dager. Basaldietten ble servert som kontroll og inneholdt normalt fôrblanding til startgriser uten mykotoksiner. Eksperimentgruppene ble matet som følger: E1 – basal diett pluss en blanding (1:1) av to biprodukter (druefrø og tindvedmel); E2 - den basale dietten eksperimentelt forurenset med mykotoksiner (479 ppb OTA og 62 ppb AFB1); og E3 – basal diett som inneholder 5 prosent av blandingen (1:1) av druefrø- og tindvedmel og forurenset med blandingen av OTA og AFB1. Etter 4 uker ble dyrene slaktet, og det ble tatt vevsprøver fra lever og nyre for å utføre genuttrykk og histologisk analyse. Genekspresjonsanalysen viste at når avvente grisunger ble fôret med kontaminert fôr, ble uttrykket av de fleste analyserte gener nedregulert. Blant CYP450-familien var CYP1A2 genet med høyest nedregulering. I følge disse resultatene fant vi i leveren at mykotoksiner induserte histomorfologiske endringer i lever ognyreog hadde en effekt på ekspresjonsnivået til CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1 og CYP3A29, men vi oppdaget ikke viktige endringer i ekspresjonsnivået til CY4A24, MRP2 og GSTA1 gener.
Stikkord: smågriser; antioksidant effekt; fôr tilsetningsstoffer; mykotoksiner; CYPs genuttrykk;nyre; nyre
Introduksjon
Mykotoksiner er sekundære giftige metabolitter produsert av visse stammer av filamentøse sopp. Disse lavmolekylære forbindelsene (opptil 500 Da) kan forurense en rekke råvarer og forårsake økt risiko for menneskers og dyrs helse [1]. Antallet mykotoksiner karakterisert og med velkjente effekter er relativt lite på grunn av mangfoldet av metabolitter med toksisk potensiale generert av sopp [2-4]. De er klassifisert i fem grupper, med spesifikke kjemiske strukturer som forekommer ofte i fôr og mat: trichothecener, zearalenon, ochratoksiner, fumonisiner og aflatoksiner. De mykotoksinproduserende soppene som finnes i mat og fôr er delt inn i to grupper: de som invaderer før kornhøsting, kalt åkersopp, og de som vokser først etter høsting, kalt lagringssopp [5]. På europeisk nivå er det forskrifter og anbefalinger angående maksimalt akseptert nivå for seks typer mykotoksiner som vanligvis finnes i fôr til griser: aflatoksiner, fumonisiner, ochratoksiner, deoksynivalenol, T2-toksin og zearalenon [6-8]. Blant husdyrartene er griser svært følsomme for mykotoksiner på grunn av deres eksponering for kornbasert fôr [9]. Svinemetabolisme er ikke effektivt til å avgifte og skille ut mykotoksiner, noe som øker risikoen for mykotoksikose. Denne følsomheten varierer også med alder, konsentrasjon av mykotoksiner i fôr og varighet av eksponering. Leveren er organet som er mest påvirket av inntak av disse giftstoffene [10]. Videre øker disse giftstoffene permeabiliteten til den intestinale epitelbarrieren hos svin og fjærfe, noe som kan generere predisposisjon for nekrotisk enteritt [11] og reduksjon av medfødt immunitet.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKSJONEN
Aflatoksiner representerer de mest tallrike mykotoksinene som finnes i matvarer, oljefrø, korn, melk, jord, dyr og mennesker. Alle typer aflatoksiner er avledet fra sopparter som tilhører slekten Aspergillus og regnes som blant de mest skadelige mykotoksinene for dyr og mennesker [4, 10 – 17]. Som nevnt ovenfor, hos diende smågriser og voksende, ferdige og avlsgriser, er de viktigste biologiske effektene av aflatoksiner kreftfremkallende egenskaper, immunsuppresjon, mutagenisitet, teratogenisitet, redusert fôreffektivitet og dårlig vektøkning, nedsatt lever og endrede biokjemiske parametere i serum [19]. . Alvorlige effekter hos svin kan føre til akutt hepatitt, systemiske blødninger, nefrose og død [20], samt redusert motstand mot stress [21]. Noen forfattere har også vist at svin fôret med lave nivåer av aflatoksiner viste tegn på lungeødem, redusert fôrforbruk og kroppsvektøkning, og en reduksjon i de enzymatiske aktivitetene involvert i oksidativ dekarboksylering, samt totalt serumprotein, blodtrykk og totalt antall leukocytter [18, 22 – 24]. I denne sammenheng, i henhold til EU-kommisjonens direktiv 2003/100/EC, er det maksimale aksepterte nivået av aflatoksin B1 (AFB1) for griser satt til 0,02 mg/kg. Ochratoksiner er sekundære metabolitter produsert av sopparter som tilhører slektene Aspergillus og Penicillium. Divergerende meninger angående de genotoksiske eller ikke-gentoksiske mekanismene for toksisitet av ochratoksiner er publisert [25, 26]. In vitro og in vivo studier viste at guanin-OTA-spesifikke DNA-addukter vedvarte i mer enn 16 dager kl.nyrenivå, mens i lever og milt ble de fjernet etter 5 dager [27]. På grunn av dette ble deres viktigste giftige og kreftfremkallende effekter utøvd inyre[28].
De fleste metabolitter av ochratoksiner fra fase I og fase II avgiftning har lav toksisitet. I magen blir en del av ochratoksiner hydrolysert til ochratoksin av proteolytiske enzymer. En annen mulighet for deres hydrolyse er åpningen av laktonringen under alkaliske forhold i tarmen, noe som resulterer i en forbindelse med høy toksisitet. På grunn av den sterke bindingen til albumin er elimineringen av ochratoksiner ved glomerulær filtrering ubetydelig, med utskillelsen hovedsakelig gjennom tubulær sekresjon. Den tubulære resorpsjonen anses som delvis ansvarlig for den intracellulære akkumuleringen av ochratoksiner [29,30]. Generelt, hos husdyr absorberes ochratoksiner raskt etter inntak gjennom mage-tarmkanalen (mage og proksimal del av jejunum) på en passiv måte, som favoriseres av den høye affiniteten til binding av ochratoksiner til plasmaproteiner, og i en ikke-ionisert form. , som forklarer deres utholdenhet i kroppen. I svineserum binder ochratoksiner seg mer spesifikt til proteiner med en molekylmasse mindre enn 20 kDa, slik at de kan passere gjennom den glomerulære basalmembranen og utøve nefrotoksiske effekter. Ochratoksiner akkumuleres også i lever og muskler. Men,nyrerer hovedstedet for lagring av ochratoksiner, med deres reabsorpsjon ved de proksimale og distale tubuli som bidrar til kroppens utholdenhet og økt nefrotoksisitet [27,31]. På den annen side, når AFB1 er absorbert på tarmnivå, når den leveren hvor den transformeres av fase I metaboliserende enzymer ved hydroksylering, hydrering, demetylering og epoksidering. De tre første reaksjonene genererer ikke-toksiske metabolitter, mens den fjerde produserer AFB1-8,9-epoksid som danner addukter med DNA på N7-stedet til guanin [32]. Også AFB1 kan konjugeres med redusert glutation i en reaksjon katalysert av glutation-S-transferaser [33] og glukuronsyre [34]. Utskillelse av AFB1 skjer primært gjennom galleveiene, etterfulgt av urinveiene [35].
En av hovedvanskene man møter med å kontrollere mykotoksiner er at mer enn én type mykotoksin er tilstede i en batch med fôr eller korn samtidig. Dermed kan fôring av smågriser og griser med kontaminert fôr med flere typer mykotoksiner, selv om de er i minimumskonsentrasjoner, forårsake en rekke negative konsekvenser på grunn av deres synergistiske effekt [36-40]. I denne sammenheng kan det å redusere og eliminere de negative effektene av mykotoksiner som finnes i svinefôr redusere produksjonskostnadene og tapet i svineindustrien. Til dags dato er det utviklet en rekke strategier for å forhindre, redusere eller til og med eliminere mykotoksinforurensning fra dyrefôr ved hjelp av biologiske, kjemiske og fysiske avgiftningsmetoder. Disse metodene tillater nedbrytning av mykotoksiner og deres tilsvarende metabolitter og opprettholder næringsverdien til maten uten å introdusere andre stoffer med toksisk potensial i de biologiske systemene [6,14,41]. Biologisk dekontaminering av mykotoksiner ved bruk av konkurrerende hemming av andre soppstammer eller tilsetning av antioksidantforbindelser i dyrefôr for å redusere toksiske effekter av mykotoksiner og/eller hemme vekst av mykotoksinproduserende sopparter, representerer en god løsning. Den mest brukte metoden for å motvirke den negative effekten av mykotoksiner på husdyr er å tilsette "mykotoksinbindere" eller "mykotoksinmodifiserende midler", som er aluminosilikater med en porøs struktur som er i stand til å adsorbere og fange mykotoksiner [42-44]. De er svært effektive mot aflatoksiner og har begrenset aktivitet mot andre typer mykotoksin. Men fordi de er uspesifikke, binder de også vitaminer og sporstoffer, og genererer mangler [45-47]. Å tilsette noen planteavledede antioksidanter i fôr kan være en bedre løsning [48] for å redusere de skadelige effektene av mykotoksiner på dyrehelsen.
P450 cytokromer enzymer, hovedsakelig tilstede i leveren, tarmkanalen ognyre,spiller en viktig rolle i fase I biotransformasjon av fremmedfrekvente stoffer, spesielt de som tilhører familiene 1 og 3 [49]. Mykotoksiner kan være substrater, inhibitorer eller induktorer av disse metaboliserende enzymene. Endringer i den spesifikke aktiviteten og induserbarheten til cytokromer P450 vil til syvende og sist bestemme den relative endringen i metabolismen til et xenobiotikum. Mykotoksiner kan endre genuttrykket til disse proteinene, noe som fører til endret absorpsjon og biotransformasjon av næringsstoffer og andre substratmedisiner fra fôr. På grunn av dette var målet med denne studien å undersøke potensialet til en biproduktblanding avledet fra oljeindustrien Vitis vinifera (druefrø) og Hippophae rhamnoides (tindved) for å redusere den skadelige skaden produsert av den samtidige tilstedeværelsen av ochratoksin A (OTA) og aflatoksin B1 (AFB1) i fôr ved lever ognyrenivå hos smågris etter avvenning.
Resultater
DiettsammensetningDen kjemiske sammensetningen av biproduktmel viste at tindvedmel er rikere på protein (pluss 38,4 prosent), fett (pluss 66,6 prosent) og karbohydrater og lavere i aske enn druefrømel (tabell 1).
Den kjemiske analysen viste også en annen profil av de to biproduktene i fettsyrer, flavonoider, fenolsyrer og mineraler. Altså har tindvedmelet et høyere innhold av mettede fettsyrer (palmitinsyre og palmitolsyre), omega-9-syrer (cis-oljesyre) og omega-3-syrer ( -linolensyre) enn druekjernemelet . Derimot har druefrømelet et svært høyt innhold av omega-6-syrer (linolsyre) (67,35 prosent sammenlignet med 18,59 prosent i tindvedmel) (tabell 2).
Begge biproduktene inneholder flavonoider og fenolsyrer, bioaktive forbindelser kjent for sine antioksidant-, anti-inflammatoriske og immunmodulerende egenskaper [50, 51]. Dermed var den totale konsentrasjonen av polyfenoler 74,8 prosent høyere i druefrømel (133,84 mg GAE/L) enn i havtorn (76,57 mg GAE/L). Når det gjelder de forskjellige klassene av polyfenoler, inneholder druefrømel høyere konsentrasjon av katekin og vanillinsyre enn tindved, mens tindved er rikere på rutin, quercitrin, luteolin, p-kumarsyre og ferulsyre (tabell 3). Når det gjelder mineralsammensetningen, har tindvedmel et høyere innhold av K, Mg, Fe, Mn og Zn enn druefrømel. Derimot inneholdt druefrømel dobbelt så mye kobber som tindvedmel. Bemerkelsesverdig er den høye konsentrasjonen av jern fra tindvedmel (tabell 4).
Dyreprestasjoner
Eksponering av smågriser fra E2-gruppen for ogratoksin pluss aflatoksin B1-blanding hadde ingen negative effekter på kroppsvekt, vektøkning og fôropptak, da forskjellene ikke var signifikante sammenlignet med kontrollen. I motsetning til dette økte administrasjonen av dietten som inneholdt biproduktblandingen alene (E1) signifikant kroppsvekten til grisunger som ble fôret med denne dietten sammenlignet med kontroll (32,14 ± 1,63 vs. 27,09 ± 1,31) og til gruppe E2, som ble fôret med de forurensede diett (32,14 ± 1,63 vs. 28,72 ± 1,07). Det skal bemerkes at gruppen av smågriser som mottok forurenset fôr og blandingen av biprodukter hadde en tendens til å gå opp i vekt sammenlignet med gruppen av mykotoksinforgiftede smågriser, selv om forskjellen ikke var signifikant. Biokjemisk parameteranalyse, som karakteriserer den generelle tilstanden til dyrehelse og funksjonaliteten til leveren ognyrer, registrerte normalverdier for alder og vektkategori av avvente smågriser. Ingen signifikante forskjeller ble identifisert mellom gruppene for de fleste av dem (tabell 5). Mykotoksinblandingen økte imidlertid ALP- og gamma-GT-aktivitet sammenlignet med kontroll og reduserte aktivitet i kontrollnivået i gruppe E3 som mottok biproduktblandingen.
Histologi av lever og nyreLysmikroskopisk analyse av leverene fra E2-gruppen, matet med en basal diett kontaminert med en blanding av OTA og AFB1, viste fokale områder med nekrose, dilatasjon av sinusoid og inflammatorisk parenkymal infiltrasjon. Portalområdene avslørte mononukleær cellulær infiltrasjon og periportal fibrose. De fibrotiske perilobulære fibrotiske skilleveggene ble også lagt merke til (figur 1)
Mykotoksinadministrasjon forårsaket strukturelle endringer inyrersom påvirket både cortex og medulla. Atrofi av glomerulære tufter og endring av Bowmanns kapsel ble lagt merke til (figur 2). Tubulene viste nekrose av foring av epitelceller med inflammatoriske celler infiltrasjon i mellom. Fokale aggregater av inflammatoriske celler ble observert mellom glomeruli og tubuli i assosiasjon med fokale områder av overbelastning i blodårene, spesielt i medullærområdet. Tilsynelatende ble kollagenproliferasjonen hovedsakelig observert i områder med tubulær skade. Dessuten,nyreseksjoner fra E3-gruppene, gruppen matet med en basal diett inneholdende en blanding av druefrø- og tindvedmel og forurenset med blandingen av OTA og AFB1, avslørte mindre patomorfologiske endringer, nesten lik kontroll.
I leveren reduserte genuttrykket for CYP1A2 med henholdsvis 18 prosent for E2 og 44 prosent for E3, sammenlignet med E1-gruppen. CYP2A19-genuttrykket var umodifisert i gruppene E1 og E2, mens det i gruppe E3 sank med nesten 62 prosent. En signifikant økning på 29 prosent ble observert i CYP2E1-genekspresjonen i E1-gruppen matet med en basal diett supplert med en blanding av druefrø og havtornmel sammenlignet med E2-gruppen. I motsetning til dette nedregulerte administrasjonen av basal diett beriket med en blanding av druefrø- og havtornmel (E1-gruppen) CYP3A29-genuttrykket med 24 prosent sammenlignet med E2-gruppenivået. En annen kontrast ble observert i CYP4A24-genuttrykket, med en reduksjon på 33 prosent for E1-gruppen og 24 prosent nedgang for E3-gruppen, og en signifikant økning på 41 prosent i E2-gruppen matet med en basal diett supplert med en blanding av AFB1 og OTA, sammenlignet med kontrollnivået. Når det gjelder MRP2, var genekspresjonsmønsteret likt det for CYP4A24-genet, med en ubetydelig reduksjon på 35 prosent for E1-gruppen og 24 prosent reduksjon for E3-gruppen, og en signifikant økning på 28 prosent i E2-gruppen, sammenlignet med til kontrollnivået. På samme måte som CYP4A24-genuttrykket, viste GSTA1-genuttrykket en signifikant 14 prosent økning i E2-gruppen, en 9 prosent økning i E1-gruppen og en 30 prosent reduksjon for E3-gruppen. Det er klart at samtidig administrering av blandingen av druefrø- og havtornmel og OTA og AFB1 genererte en reduksjon av alle analyserte genuttrykk i leveren sammenlignet med kontroll. Når det gjelder ekspresjonsnivået til disse genene inyrer,sammenlignet med leverprøver ble ingen statistisk signifikante endringer observert (figur 4). Imidlertid kunne endringer i reguleringen av genekspresjonsnivå observeres.
Ved å analysere figur 4 kunne det legges merke til at blandingen av druefrø og havtornmel nedregulerte CYP1A2-genuttrykket og oppregulerte CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29 og CYP4A24 genuttrykk på en ubetydelig måte, mens MRP2 og GSTA1-genuttrykket forble umodifisert. . Også tilstedeværelsen av OTA og AFB1 i smågriser mater nedregulert CYP1A2 og CYP2A19 genuttrykk på en ubetydelig måte, mens MRP2 og GSTA1 var umodifisert. Samtidig administrering av blandingen av druefrø og tindvedmel og OTA og AFB1 bestemte tilbakeføringen av alle genekspresjonsnivåer til kontrollnivåer med unntak av GSTA1, som ga en viktig økning sammenlignet med E1-gruppen.
Diskusjon
Mykotoksiner som AFB1 og OTA er naturlige giftstoffer som forurenser et stort utvalg av planteprodukter. Som en konsekvens er AFB1, OTA og deres metabolitter til stede i mat og fôr, så vel som i produkter av animalsk opprinnelse [52]. De fleste av de toksikologiske studiene angående effekten av mykotoksiner har vurdert eksponeringen for en enkelt type mykotoksin uten å ta hensyn til kombinasjonen og interaksjonen mellom dem, henholdsvis de synergistiske eller antagonistiske effektene som ofte forekommer i naturen. Data om toksiske effekter av mykotoksinkombinasjoner er begrenset, så risikoen for eksponering for flere typer giftstoffer er fortsatt ukjent. Forekomsten av mykotoksiner som AFB1, DON, ZEA, OTA, FB1 og FB2 i korn, kornprodukter og kompletterings- og fullfôr til griser [16] er relatert til den geografiske plasseringen og klimaendringene, noe som øker risikoen forbundet med med mykotoksinforurensning under lagring og bearbeiding av fôrprodukter til griser [53]. Samkontaminering av korn og andre råvarer forekommer hyppigere i det virkelige liv enn enkelt mykotoksinkontaminering [7]. For eksempel er samtidig forekomst av aflatoksin B1 og ochratoksin A funnet i ulike mat- eller fôringredienser, som hvete [54], bygg [55], kornmel [56], krydder [57] osv. Andelen mellom AFB1 og OTA i fôr ble funnet å være ca. 1 til 6 [37]. Dessuten varierte det globale fôrinnholdet i AFB1 og OTA mellom henholdsvis ikke bestemt og 100 ppb og ikke bestemt og 211 ppb [58]. I denne sammenheng, for å etterligne feltforholdene, studerte vi effekten av disse mykotoksinene sammen og for å vurdere effektiviteten til biproduktblandingen for å motvirke effekten av mykotoksiner. De naturlige tilsetningsstoffene (druefrø og tindved-biprodukter) ble valgt basert på deres evne til å lindre mykotoksikose ved kosttilskudd [59,60].
I denne studien påvirket ikke eksponeringen av smågriser (E2-gruppen) for mykotoksinblandingen ytelsen til dyr (27,83 ± 1,1 vs. 27.09 ± 1,3 for kroppsvekt og 1,48 ± 0 .9 vs. 1.40 ± 0.8 for fôropptak) og biokjemiske parametere sammenlignet med kontroll. Tilsvarende har Balogh et al. [61] rapporterte at smågriser som ble fôret med omtrent 0,4 mg/kg OTA i startperioden (0–28 dager) og dyrker (29–49 dager) ikke registrerte signifikante endringer i produksjonsegenskapene og kliniske tegn på toksisitet hos dyrkeren. fase. I motsetning til dette ble det observert en signifikant reduksjon i kroppsvektøkning i startperioden når dyrene var mer følsomme. I denne studien hadde kosttilskuddet av biproduktblandingen alene en betydelig innflytelse på dyrenes ytelse (gruppe E1) og hadde en tendens til å øke grisungenes vekt når blandingen var assosiert med forurenset mat (gruppe E3).
Fra et toksikologisk synspunkt er OTA klassifisert av IARC (International Agency for Research on Cancer) i samme gruppe (2B) av kreftfremkallende stoffer for mennesker, med tilsvarende toksisitet med AFB1 [62]. Toksikokinetiske mønstre for absorpsjon, distribusjon og eliminering for disse mykotoksinene er for det meste fullstendig belyst. Til tross for nylig fremgang, er vår kunnskap om de toksikokinetiske biotransformasjonstrinnene ikke belyst i detalj. En rekke studier har vist at AFB1 og OTA metaboliseres av levermikrosomer fra mennesker, griser og rotter til flere epimerer [63]. Endringer i den spesifikke aktiviteten og induserbarheten til cytokromer P450 bestemmer til syvende og sist den relative endringen i metabolismen til ethvert xenobiotikum.
Det har blitt funnet at eksponering for AFB1 og OTA reduserte genuttrykket av CYP1A2, CYP2E1, CYP3A29 og MRP2 gener i griselever og resulterte i flere endringer i leverens histologi og ultrastruktur, inkludert fokale områder av nekrose, dilatasjon av sinusoid, inflammatorisk parenkym. infiltrasjon og periportal fibrose. Angående genekspresjonsnivået til CYP450-isoformer i grisernyre,ingen data var tilgjengelig i vitenskapelig litteratur. CYP1A2-, CYP2A19-, CYP2E1-, CYP3A29-, CYP4A24-, MRP2- og GSTA1-genene ble valgt for denne studien fordi de koder for proteiner med enzymatisk aktivitet eller transportørfunksjon som er involvert i fase I og fase II av biotransformasjon og avgiftning av xenobiotika for å danne elektrofile reaktive stoffer. metabolitter [64]. I følge disse resultatene ser det ut til at biproduktadministrasjonen bestemte en reduksjon i CYP1A2-genekspresjon og en økning i GSTA1-genekspresjon. Lignende resultater ble lagt merke til i HT-29 humane tykktarmskreftceller behandlet med Salicornia freitagii-ekstrakt, kjent for sin antioksidant og anti-inflammatoriske aktivitet. I dette tilfellet, på grunn av innholdet i bioaktive fenoler, skjedde en nedregulering av CYP1A2 mRNA og en oppregulering av GSTA1 mRNA [65]. I motsetning til våre resultater, var mRNA og proteinekspresjon av CYP1A2 økt i leveren til sikoriforede griser [66]. Disse forskjellige resultatene var sannsynligvis forårsaket av de forskjellige naturlige forbindelsene i sikori sammenlignet med biproduktene som ble brukt i denne studien, hovedsakelig klorogensyre, koffeinsyre og p-kumarsyre [67].
På den annen side interagerte OTA og AFB1 sannsynligvis med og aktiverte den aromatiske hydrokarbonreseptoren, noe som førte til dens nukleære translokasjon. Etter heterodimeriseringen interagerte OTA og AFB1 sannsynligvis med hydrokarbonreseptor nukleær translokator, heterodimeren, bundet til xenobiotiske-responsive elementer og transaktiverte gener som CYP1A1, CYP1A2 og GST [68]. Dette xenobiotiske-responsive elementet er delt mellom CYP1A1- og CYP1A2-gener [69], og de to enzymene kodifisert av dem presenterer overlappende substratspesifisitet [70]. I svinelever er kun CYP1A2-aktivitet tilstede, og dens relative mengde totalt påvist CYP450 er 4 prosent [71]. I den menneskelige leveren er AFB1 og OTA induktorer for CYP1A1, 1A2, 2B6, 2C9, 3A4 og 3A5 [72]. AFB1, så vel som OTA-eksponering, genererer mitokondriell dysfunksjon preget av en økning i ROS-produksjon [14] som kan øke TGF- 1-ekspresjon eller aktivere latent TGF- 1 [73]. Tatt i betraktning, det tidligere beviset på at TGF- 1 reduserte CYP1-ekspresjon hos mennesker og rotter, er det mulig at den samme mekanismen [74] skjedde under våre forhold. Effektene av den samtidige eksponeringen for både mykotoksiner og druefrø- og tindvedbiprodukter var sannsynligvis synergistiske, og uttrykket av CYP1A2 var lavere i E3 sammenlignet med E1, E2 og kontrollgruppen. CYP1A2 uttrykkes i lavere nivåer i ekstrahepatisk vev [75].
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFEILT
Denyreer et organ som mottar omtrent 25 prosent av hjerteutfall og renser metabolske rester og xenobiotika fra sirkulasjonssystemet. Under denne utslippsprosessen konsentreres giftige stoffer inyre[76]. I smågrisnyrer, var variasjonen av CYP1A2-genekspresjon lik ekspresjonsnivåene i leveren for E1 og E2. Interessant nok var uttrykket av dette genet i E3-gruppen på et høyere nivå enn kontrollgruppen. Dette kan muligens skyldes aktiveringen av ikke-kanonisk signalvei for AhR-transkripsjon inyreceller [77]. I griselever representerer de relative mengder av CYP2A19 og CYP2E1 henholdsvis 31 prosent og 13 prosent av total CYP450 [71]. Porcine CYP2A19- og CYP2E1-gener er ansvarlige for biotransformasjonen for endogene forbindelser (skatol, kjønnshormoner) så vel som eksogene forbindelser (matkomponenter). Begge typer forbindelser er sterkt uttrykt i leveren og mindre inyreog fettvev. CYP2A19-transkripsjon kontrolleres av CAR-transkripsjonsfaktoren [78]. Dens humane ortolog, CYP2A6, kontrolleres av CAR, PXR, glukokortikoidreseptor (GR), østrogenreseptor, HNF 4 og PGC-1 [79]. Dessuten styres den konstitutive leverekspresjonen av CYP2A6 i mus av et samspill mellom HNF 4, CCAAT-box/enhancer-bindende protein (C/EBP, C/EBP) og oktamer-transkripsjonsfaktor-1 (okt{{13} }) [80]. Tidligere ble det observert en positiv korrelasjon mellom mRNA- og proteinnivåer for CYP2A19-genet [81]. I motsetning til andre CYP 450-gener, spiller CYP2A19 en mindre viktig rolle i fremmedlegemenes metabolisme, men er involvert i cellenes reaksjon på stress, Nrf-2, og er også involvert i CYP2A19-transkripsjon [82]. CYP2A19-genet er sannsynligvis svært polymorft sammenlignet med CYP2A6-genet [83], og en omfattende interindividuell variasjon av produktets produkt kan forekomme. Tidligere studier avslørte at and P450-ortologer av pattedyret CYP2A6 og CYP3A4 er involvert i AFB1-bioaktivering til sin epoksidform [84]. I motsetning til disse resultatene, i den nåværende studien, ble ingen signifikante endringer av CYP2A19-genekspresjon lagt merke til i E1- og E2-gruppene, sannsynligvis på grunn av det høye ekspresjonsnivået av dette genet i smågrislever. Foreløpig er det vanskelig å forklare hvorfor samtidig eksponering av både mykotoksiner og blandingen av druefrø- og tindvedmel reduserte uttrykket av CYP2A19. Imidlertid reduserte denne reduksjonen i uttrykk risikoen for generering av toksiske metabolitter.
I grisnyre,uttrykket av CYP2A19 er lavere sammenlignet med det som finnes i leveren [79]. Sannsynligvis på grunn av dette lavere uttrykket, genererte dyreeksponering for blandingen av druefrø og tindvedmel en oppregulering av Nrf-2-indusert CYP2A19-genuttrykk på grunn av luteolin [85] og ferulinsyre [86] innhold . På den annen side er det bevis for at bare to transkripsjonsfaktorer, dvs. kylling ovalbumin oppstrøms promoter transkripsjonsfaktor (COUP-TF1) og hepatocytt nukleær faktor (HNF-1), er involvert i reguleringen av CYP2E1 transkripsjon hos griser [87]. CYP2E1, som andre xenobiotiske metaboliserende P450-er, er hovedsakelig lokalisert i membranen til det endoplasmatiske retikulum (ER) og kan induseres under en rekke metabolske eller ernæringsmessige forhold. ER-stress kan induseres av metabolsk stress, som er forårsaket av overbelastning av protein/lipidbiosyntese, og oksidativt stress, som kan utløse den evolusjonært konserverte komplekse homeostatiske signalveien kjent som den utfoldede proteinresponsen (UPR) [88].
Det er sannsynlig at nivået av CYP2E1 mRNA var omtrent det samme i E1- og kontrollgruppene på grunn av de antagonistiske virkningene av palmitinsyre [89], linolsyre og -linolensyre [90] som økte denne gentranskripsjonen og virkningene vanillinsyre og p-kumarsyrer som reduserte det [65]. Nylig ble det bevist at OTA-holdig fôr endret tarmmikrobiotaen i ender, noe som påvirker blindtarmens mikrobiota mangfold og sammensetning samt tarmbarrieren. Som et resultat kom gramnegative bakterieavledede lipopolysakkarider inn i blodet og leveren, og forårsaket leverbetennelse [91]. Ved immun-mediert leverskade ble uttrykket av CYP2E1 redusert [92]. Denne situasjonen kan oppstå i E2-gruppen. Det er sannsynlig at de kumulative effektene av de to mykotoksinene og diettbiproduktene reduserte uttrykket av CYP2E1 i leveren til E3-gruppen. Inyre,frie fettsyrer, som palmitat, oleat og linoleat, lagres i nefronet [93], og disse syrene økte sannsynligvis ekspresjonen av CYP2E1-genet inyrerav E1-gruppen sammenlignet med kontrollnivået. I følge Pfohl-Leszkowicz og Manderville [25] danner OTA addukt med DNA, og genererernyregentoksisitet og karsinogenese. Det er sannsynlig at høye nivåer av OTA stimulerte CYP2E1-genuttrykk inyrerav E2-gruppen sammenlignet med kontrollnivået. I E3-gruppen ser det ut til at samtidig administrering av de to mykotoksinene og diettbiprodukter hadde antagonistiske effekter, med uttrykket av CYP2E1-genet tilbake til kontrollnivået. Dessuten viste histologisk evaluering for E3-gruppen at biproduktblandingen avledet fra druefrø- og tindvedolje dempet den skadelige skaden produsert av aflatoksin B1 og ochratoksin A på lever- ognyrenivå hos smågris etter avvenning. CYP2E1, som andre xenobiotiske metaboliserende P450s, er hovedsakelig lokalisert i membranen til ER og kan induseres under en rekke metabolske eller ernæringsmessige forhold [89]. Reguleringen av CYP2E1-genet i E1-gruppen skyldtes sannsynligvis hydroksyleringen av kumarin-avledede forbindelser som ble katalysert av CYP2A-enzymer, som anses å være spesifikke indikatorer for tilstedeværelsen av CYP2-enzymer [94], med p-kumarsyren. syre som finnes i biprodukter av druefrø og tindved.
Når det gjelder griser, er svært lite kjent om tilstedeværelsen av CYP3As-enzymer inyrevev,og ingenting er kjent om deres induserbarhet [95]. Flere gener er identifisert i CYP3A-underfamilien til pattedyr (for eksempel fem hos rotter og fire hos mennesker), men uttrykket av disse genene inyrevevhar vært dårlig undersøkt [96]. Når det gjelder genuttrykk, Ayed-Boussema et al. (2012) [63] og Gonzalez-Arias et al. [97] beskrev en økning av ekspresjonsnivåer i alle cytokromer som ble analysert (CYP3A4, 2B6, 3A5 og 2C9) i en primær human hepatocyttkultur. Tidligere studier har rapportert ulike resultater angående effekten av AFB1 og OTA i primærdyrkede humane hepatocytter der økende konsentrasjoner av disse mykotoksinene klart induserte CYP3A4 og CYP2B6 mRNA-nivåer på en doseavhengig måte [63]. Derimot har det blitt funnet at i nærvær av OTA og AFB1 i leveren (Figur 3, gruppe E2), ble CYP3A29-uttrykksnivået redusert sammenlignet med kontrollnivået, kanskje på grunn av aktivering av AhR [98]. Disse dataene skiller seg fra dataene til Zepnik et al. [99], som rapporterte en økning av OTA-hydrolyse av mikrosomale enzymer fra rottelever, spesifikt for P450 3A1/2 og 3A4, noe som tyder på at dette genuttrykket er modulert på en artsavhengig måte. I noen tilfeller kan hemming av P450-enzymer av polyfenoler ha en kjemopreventiv effekt på grunn av potensiell aktivering av kreftfremkallende stoffer av P450-enzymer i løpet av deres naturlige metabolske aktivitet. Inhibering av xenobiotiske metaboliserende fase I-enzymer kan være et mål for de kjemo-forebyggende effektene av naturlig forekommende polyfenoler. Økningen av CYP4A24 observert i leveren kan være en fysiologisk respons i den uvanlige sammenhengen med avvikende lipidakkumulering og fravær av CYP2E1-aktivitet, på grunn av det faktum at CYP2E1 og CYP4A er induserbare hepatiske mikrosomale cytokromer P-450 involvert i hydroksylering av fett syrer, og begge kan sette i gang den auto-propagative prosessen med lipidperoksidasjon. De kan være komplementære, noe som fører til interaksjoner i reguleringen av de individuelle enzymene [100]. Det er derfor klart at CYP4A-proteiner er sentrale mellomledd i en adaptiv respons på forstyrrelse av hepatisk lipidmetabolisme [101]. Det reduserte CYP4A24-nivået inyrefører sannsynligvis til de toksiske effektene som genereres i leveren på grunn av det mykotoksin-kontaminerte kostholdet, noe som betyr at CYP4A24 regulerer hepatisk ER-stress [102,103].
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESMERTER
I denne studien økte tilsetningen av en blanding av druefrø- og tindvedmel-biprodukter uttrykksnivåene inyre,som ville forventes å favorisere eliminasjonsprosesser og opprettholdelse av balansen av intracellulære stoffer [104]. Dessuten ble OTA absorbert i tarmen hvor multimedikamentresistensproteinet 2 (MRP2-genet) spiller en viktig rolle, og fungerer som en fremmedfrekvent utadgående transportør for å redusere den orale biotilgjengeligheten og toksinbelastningen til organer og derved OTA-toksisitet. Når OTA når blodstrømmen, kan den nå andre organer som lever, og MRP2-transportøren er igjen en viktig primær aktiv transportør involvert i anionisk konjugat og xenobiotisk ekstrudering inn i det ekstracellulære rommet som bidrar til galledannelse og den påfølgende eliminering av toksinet [ 97, 105]. MRP2-transportøren er også til stede i de apikale membranene til enterocytter,nyre-proksimale tubuli, og andre celler [105]. OTA-toksisitet har blitt tilskrevet dens isokumarindel, og det er velkjent at OTA inaktiveres eller bioaktiveres av cytokrom P450-enzymer [29]. Tidligere var tilstedeværelsen av OTA i fôr knyttet til utviklingen av nefrotoksisitet, som hos rotter har vært assosiert mednyreadenomer ognyresvulster [97]. I denne studien ble det funnet en reduksjon av MRP2-ekspresjon i leveren, noe som indikerer en svekkelse av sekresjonen av mykotoksiner i E2-gruppen.
Hos rotter ble OTA observert å bli utskilt 15 prosent mindre i de proksimale tubulinyre,mens den proksimale tubulære transporten av aminosyrer ikke ble svekket [97, 106]. Derfor kan reduksjonen av MRP2 i leveren funnet i denne studien være mekanismen som mykotoksiner når høye prosenter av biotilgjengelighet in vivo. På denne måten vil AFB1- og OTA-eksponeringen av smågriser forstørres, noe som bidrar til levertoksisiteten. Tatt i betraktning det nefrotoksiske potensialet til OTA og AFB1, kan reduksjonen av MRP2-genproduktet også ha stor innvirkning på den proksimale tubuli, noe som fører til redusert kapasitet til å eliminere OTA [97]. Det er imidlertid behov for ytterligere studier på AFB1- og OTA-transportmekanismen for å støtte denne hypotesen. I fase II av metabolsk avgiftning konjugeres den opprinnelige fremmedfjernende forbindelsen eller de mellomliggende metabolittene som er modifisert under fase I for å være egnet for utskillelse. Glutation S-transferaser (GSTs) og UDP-glykurosyltranferaser (UGTs) bidrar til fase II-prosessering [107].
I nærvær av en blanding av druefrø- og havtornmel-biprodukter i grisefôr, økes GSTA1-ekspresjonsnivået i leveren betydelig, muligens av et antioksidant-responsivt element (ARE) og -NF-responsivt element (-NF-RE), henholdsvis, som i nærvær av fenoliske antioksidanter aktiverer GST-isoformene uten behov for arylhydrokarbon (Ah) reseptorer [108]. Overraskende nok, i studien til Ghadiri et al. (2019) [109], den AFB1-mediert mRNA-nedregulering av GSTA1 ble observert i kuens lever i nærvær av en antioksidant. Tidligere studier [110] viste at OTA og AFB1 konkurrerer om de samme CYP450-enzymene som representerer bioaktiveringsveien til AFB1, med mindre AFB{15}}DNA-addukter som produseres. På grunn av denne konkurransen kunne AFB1 sannsynligvis bli konjugert med redusert glutation i en reaksjon katalysert av GST-enzymer, med deres kodende gener oppregulert. AFB1 kan være involvert i andre typer fase II-reaksjoner, dvs. glukuronidering og sulfatering, mens OTA hovedsakelig er konjugert med redusert glutation [72]. I tillegg, som svar på samtidig administrering til grisene, økte fôret av to mykotoksiner (AFB1 og OTA) genereringen av biomarkørene for oksidativt stress. Derfor ble forsvarsmekanismer aktivert, og fremmet tilpasning og overlevelse som respons på oksidativt stress [111]. For eksempel kan ROS og oksidanter aktivere transkripsjonen av GST-isoformer gjennom ARE [108], som observert i både lever ognyrergjennom en økning i ekspresjonsnivået til GSTA1-genet.
Konklusjoner
Våre data avslørte eksistensen av forskjeller mellom smågrisernyreog lever angående reaksjonen mot både mykotoksiner og biprodukter brukt i denne studien. Generelt reduserte biproduktene med antioksidantvirkning ekspresjonen av det analyserte CYPs mRNA i leveren og økte dem inyre. I begge organer genererte samtidig eksponering av smågriser for OTA og AFB1 en økning eller en reduksjon av genuttrykk avhengig av gentypen. Inkluderingen av druefrø- og tindvedmel i dietten til OTA- og AFB-1-berusede griser reduserte CYP P450-genekspresjonen, noe som antyder en reduksjon av bioaktivering av disse mykotoksinene, noe som sannsynligvis resulterte i en redusert toksisitet i begge organer, da histologiske studier har avslørt. Disse funnene tyder på at avfall fra druefrø og tindved er en lovende kilde for å motvirke den skadelige effekten av ochratoksin A og aflatoksin B1. Selv om ytterligere arbeid er nødvendig for å avdekke mekanismene som biprodukter av druefrø og tindved påvirker AFB1- og OTA-biotransformasjonen, og dermed genereringen av giftige metabolitter, ser de beskyttende effektene ut til å være i det minste delvis mediert av forbedringen av antioksidantforsvaret i leveren ognyrenivå.
Materialer og metoder
Eksperimentell design og prøvesamlingFørti kryssoppdrettede TOPIGS-40 hybrid ( ♀ Large White × Hybrid (Large White × Pietrain) ×♂ Talent, hovedsakelig Duroc) smågriser etter avvenning med en gjennomsnittlig kroppsvekt på 9,11 ± 0.{{16 }}3 kg ble tildelt tre eksperimentelle grupper (E1, E2, E3) og en kontrollgruppe (C), plassert i binger (to replikater av fem griser per bås per behandling) og fôret med eksperimentelle dietter for 3{{19} } dager. Fôr og vann ble tilbudt ad libitum under forsøket. Basaldietten ble servert som en kontroll og inneholdt normalt fôrblanding for startgriser uten mykotoksin (mais 68,46 prosent, soyamel 19 prosent, maisgluten 4 prosent, melkeerstatning 5 prosent, L-lysin 0,3 prosent, DL-metionin 0,1 prosent, kalkstein 1,57 prosent, monokalsiumfosfat 0,35 prosent, salt 0,1 prosent, kolin-forblandinger 0,1 prosent og 1 prosent vitamin-mineral-forblandinger). Eksperimentgruppene ble matet som følger: E1 – basal diett pluss en blanding (1:1) av to biprodukter (druefrø og tindvedmel) i en prosentandel på 5 prosent ved å erstatte mais- og soyamel; E2 – den basale dietten som er kunstig forurenset med mykotoksiner (en blanding av 62 ppb aflatoksin B1- AFB1 og 479 ppb ochratoksin A-OTA); og E3 – basal diett som inneholder 5 prosent av blandingen (1:1) av druefrø- og tindvedmel og forurenset med blandingen av AFB1 og OTA. Blandingen av OTA- og AFB1-mykotoksiner ble vennlig levert av Dr. Boudra og Dr. Morgavi fra INR A, Center of Clermont Ferrand, og ble produsert ved dyrking av Aspergillus flavus og Aspergillus okeraktig på hvete som allerede beskrevet av Boudra et al. [112]. Det forurensede materialet som ble oppnådd ble inkorporert i diettene for E2- og E3-gruppene, noe som resulterte i en sluttkonsentrasjon på 479 ppb OTA og 62 ppb AFB1. Dyr fra alle forsøksgruppene hadde fri tilgang til behandlingsfôret og vann hver dag i forsøksperioden (30 dager). Druefrømelet og tindvedmelet ble levert av to lokale reklamefilmer, SC OLEOMET-SRL og BIOCATINA, Bucuresti, Romania. Etter 4 uker ble dyrene slaktet med godkjenning av den etiske komité ved National Research-Development Institute for Animal Nutrition and Biology, Balote s , ti, Romania (Etisk komité nr. 118/02.12.2019) og iht. Rumensk lov 206/2004 og EUs rådsdirektiv 98/58/EC for håndtering og beskyttelse av dyr brukt til forsøksformål. På slutten av forsøksperioden for denne studien ble produktive parametere, vekt og fôrforbruk målt. Lever ognyreprøver ble samlet fra fire dyr per gruppe og perfusert med iskald saltløsning for å fjerne blod. Fragmenter på ~50 mg fra høyre leverlapp ognyrecortex (tre fra hver) ble samlet i RNAlater Stabilization Reagent (Qiagen, Germantown, Maryland) og deretter lagret ved -80 ◦ C inntil RNA-isoleringstrinnet. På grunn av etiske årsaker, maksimering av bruken av hvert dyr, minimalisering av tap av dyr og statistisk analyse, ble antallet individer redusert så mye som vitenskapelig mulig. God vitenskap og god eksperimentell design bidrar til å redusere antall dyr som brukes i enhver forskningsstudie, slik at forskere kan samle data ved å bruke det minste antallet dyr som kreves [113].
FeedkarakteriseringFôrfôr ble analysert for basal kjemisk sammensetning (tørrstoff, råprotein, råfett, råfiber og aske) i henhold til International Standard Organizations metoder (SR ISO 6496/2001, Standardized Bulletin (2010). http://www. asro.ro (åpnet 13. februar 2021)). Bioaktive forbindelser fra biprodukter måltider, som polyfenoler, flerumettede fettsyrer (PUFA) og mineraler, ble bestemt ved Folin-Ciocalteu-reaksjon, HPLC-UV-Vis og gasskromatografi som beskrevet av forfatterne av [113, 114]. Antioksidantaktivitet ble bestemt ved DPPH-metoden som beskrevet tidligere av forfatterne av [115].
Analyse av plasmabiomarkørerPå dag 30 ble blodprøver tatt aseptisk fra fastende smågriser. Markører som gjenspeiler funksjonaliteten til leveren (aspartattransaminase-AST, alanintransaminase-ALT, gamma-glutamyltransferase-GGT, totalprotein, alkalisk fosfatase-AKL) og nyrene (albumin, kreatinin) ble bestemt etter blodsentrifugering ved bruk av en benktopp i klinisk kjemi analysator Horiba Medical—ABX Pentra 400, (Irvine, CA, USA).
LysmikroskopiundersøkelseLever ognyrebiopsier ble fiksert i 4 prosent fosfatbufret formaldehydløsning, dehydrert, klargjort og inkludert i parafinblokker. Seksjonene på 5 µm ble behandlet rutinemessig for henholdsvis hematoxylin-eosin og Gomori trichrome (Leica Biosystems, 38016SS1, Nussloch, Tyskland), i henhold til Leicas protokoll. Mikroskopiske snitt ble analysert med et Olympus BX43 mikroskop utstyrt med et digitalkamera Olympus XC30. De histopatologiske endringene i lever ognyreble gradert etter alvorlighetsgraden av lesjoner som tilhørende grad 1–4, som tidligere beskrevet [116]. For lever, grad 1: Normal aspekt; grad 2: Normale hepatocytter, lett utvidede sinusoider og overbelastning; grad 3: Vakuolerte hepatocytter, dilaterte sinusoider og overbelastning; moderat kollagenproliferasjon; grad 4: Nekrose, inflammatoriske infiltrater, kollagenproliferasjon. For nyre, grad 1: Normal aspekt; grad 2: Små tubulære/glomerulære skader, betennelse og kollagenproliferasjon; grad 3: Milde tubulære/glomerulære skader, betennelse og kollagenproliferasjon; grad 4: Markerte tubulære/glomerulære skader, inflammasjon og kollagenproliferasjon. En "middelvurderingsverdi" (MAV) ble beregnet som et gjennomsnitt av alle data per forsøksgruppe.
RNA-isolasjonIsoleringen av totalt RNA ble utført fra 10 mg vev ved å bruke RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen) etter produsentens protokoll. Dessuten inkluderte det DNase-fordøyelsestrinnet på kolonnen. Etter RNA-isolering ble det laget alikvoter for å forhindre nedbrytning indusert av fryse-tine-sykluser. Konsentrasjonen og renheten til totalt RNA ble bestemt ved bruk av NanoDrop 8000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).
RNA-integritetsnummer (RIN)RIN-verdiene til RNA-prøvene ble bestemt ved å bruke Agilent RNA 6000 NanoKit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) og Agilent 2100 Bioanalyzer ved å bruke produsentens protokoll. Prøver med RIN-verdier mindre enn 8 ble ikke inkludert i videre analyse, og isolasjonstrinnene ble gjentatt.
Omvendt transkripsjonFor cDNA-syntese ble 1000 ng totalt RNA utsatt for revers transkripsjon ved bruk av iScript cDNA-syntesesett (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). En 4 µL reaksjonsblanding og 1 µL revers transkriptase ble blandet med 1 µL RNA-prøver og fullført med RNase-fritt vann til et totalt volum på 20 µL. Den endelige konsentrasjonen av RNA var 1000 ng per reaksjon. Reaksjonen ble utført ved bruk av en Veriti 96-Well termisk syklus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med følgende program: En syklus på 25◦ C i 5 minutter, en syklus på 42◦ C i 30 min. og en syklus på 85 ◦ C i 5 min. Konsentrasjonen og renheten til cDNA-prøvene ble bestemt ved bruk av NanoDrop 8000 spektrofotometer (Thermo Scientific).
Primer designPå grunn av mangelen på data angående gener involvert i hepato-nefrotoksisiteten i mykotoksineksponeringen av avvente griser, ble primersekvenser (tabell 7) designet i silico ved bruk av Primer3Plus [59] og verifisert av BLAST-programmet [117]. De med høyest spesifisitet for målsekvensen ble valgt for å amplifisere generene CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 og GSTA1 og tre referansegener som koder for TATA-boksbindende protein, ribosomalt protein L4 og beta{ {19}}mikroglobulin i Sus scrofa. Glødingstemperaturene til primerne ble bestemt ved temperaturgradient PCR.
Sanntids PCRReal-Time PCR-reaksjonen ble utført på iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) ved bruk av iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad). I en 96-brønnplate, 1 µL av 1{{10}}0 ng/ µL cDNA, 12,5 µL iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad), 0,5 µL 20 pmol/µL foroverprimer, 0,5 µL 20 pmol/µL revers primer og 10,5 µL MilliQ-vann ble tilsatt. Det totale volumet var 25 µL. Amplifikasjonsprogrammet besto av 1 syklus på 95 ◦ C i 5 minutter, 45 sykluser på 95 ◦ C i 30 s 55/56 ◦ C i 30 s, 72 ◦ C i 45 s, og 85 sykluser på 55 ◦ C, med en økning av settpunkttemperaturen med 0,5 ◦ C per syklus i 10 s. Prøvene ble kjørt, og terskelsyklusverdiene (Ct) ble registrert. Det ble også utført smeltekurver.
DataanalyseCt-verdiene ble behandlet som angitt i "The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments" [ 118 ] ved bruk av OpenOffice Calc i henhold til 2- ∆∆ Ct-metoden beskrevet av Livak og Schmittgen (2001) ) [119]. Referansegenene (TBP, RPL4 og B2M) ble valgt for å bli stabilt uttrykt på tvers av ulike vevstyper og behandlinger på svineprøver [120, 121]. Den relative ekspresjonsverdien (2 − ∆∆Ct ) ble oppnådd ved normalisering, ved å trekke det aritmetiske gjennomsnittet av referansegenene fra hvert gen av interesse. Gjennomsnitt av tekniske replikater ble beregnet før statistisk analyse. Dataene er illustrert som gjennomsnittsverdier for gruppene (n=4) ± standard feilavvik for gjennomsnittet (STDEV). Alle data ble statistisk analysert ved å bruke en enveis ANOVA-metode utført med GraphPad Prism 3.03-programvare (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Post-hoc-sammenligninger mellom alle grupper ble kjørt ved bruk av Bonferroni-testen. Den statistiske signifikansen (p-verdi) ble presentert for alle gruppene i motsetning til kontrollgruppen (C).