Den epigenetiske regulatoren BRD4 er involvert i kadmium-utløst inflammatorisk respons i rottenyre

for mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong et al

Cistanche tubulosa forhindrer nyresykdom, klikk her for å fåprodukter og Cistanche DHT

ABSTRAKT

Kadmium (Cd) har blitt beskrevet som en potensiell inflammatorisk induser mens økende bevis viser at upassende betennelse er en medvirkende faktor tilnyreskade. Derfor er forskning på Cd-utløst inflammatorisk respons av stor betydning for å belyse mekanismen for Cd-indusert nefrotoksisitet. Bromodomeinneholdig 4(BRD4) er en viktig epigenetisk regulator involvert i utviklingen av mange inflammatoriske sykdommer, men dens regulerende roller i Cd-utløstinflammatorisksvar gjenstår å avklare. Her fant vi behandling med Cd hos Sprague-Dawley rotter (2 mg/kg kroppsvekt, ip, 5 dager på rad) og hos rotternyrecellelinje (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 timer) induserte transkripsjon av inflammatoriske cytokiner, som kunne reduseres av JQ1 (BRD4-hemmer, 25 mg/kg kroppsvekt, ip , 3 påfølgende dager in vivo; 0,5 μM, 12 timer in vitro) eller BRD4 lite forstyrrende RNA (siRNA, in vitro), noe som tyder på at BRD4 deltar i Cd-utløst inflammatorisk respons. Deretter avklarte vår studie rollene til BRD4 i Cd-utløst inflammatorisk respons. Inhiberingen av BRD4 reduserte Cd-fremmede NF-KB-kjernetranslokasjon og aktivering in vivo og in vitro. Cd økte acetyleringsnivået til RelA K310 og forbedret BRD4-binding til acetylert NF-KB RelA in vivo og in vitro, som ble opphevet ved å hemme BRD4. Oppsummert antyder vår studie at BRD4 er involvert i Cd-utløst transkripsjon av inflammatoriske cytokiner ved å mediere aktiveringen av NF-KB-signalveien og øke seg selv bindingen til acetylert NF-KB RelA hos rotternyre,derfor kan BRD4 være et potensielt terapeutisk mål for Cd-induserte nyresykdommer.

Nøkkelord: BRD4KadmiumInflammatorisk nyrecytokiner NF-KB JQ1

1. Introduksjon

Kadmium (Cd) er en tungmetallforurensning med høy toksisitet og lang halveringstid. Med utviklingen av industriell produksjon har den økte trusselen fra Cd-forurensning mot miljøsikkerhet og menneskers helse vakt bekymring (Wang et al., 2020; Horiguchi og Oguma, 2016). Etter at det er absorbert av kroppen, induserer Cd multiorganskader ognyreer hovedmålorganet (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Tidligere har vi systematisk verifisert at autofagi-hemming, oksidativt stress og apoptose synergistisk bidrar til Cd-forårsaket nefrotoksisitet hos rotter (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Betennelse er en fysiologisk respons som fungerer som en defensiv reaksjon mot infeksjon eller skade, men Cd-induserte ukontrollerte og upassende inflammatoriske responser kan forårsake skade som å skade normalt vev hos forbipasserende og fremme autoimmune sykdommer (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et al. al., 2020). Cd-utløst inflammatorisk respons forverret kardiovaskulære sykdommer og leverskade, noe som tyder på at betennelse kan spille viktige roller i Cd-mediertnyrepatologiske prosesser (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetikk refererer til arvelige modifikasjoner i genuttrykk basert på ikke-DNA-sekvensendringer, og reversibiliteten til disse modifikasjonene muliggjør oppdagelsen av nye terapeutiske mål (Vendetti og Rudin, 2013). Bromodomene og ekstra-terminale domene (BET)-familien inkluderer bromodome-inneholdende 2 (BRD2), BRD3, BRD4 og bromodomein-testisspesifikke (BRDT), som karakteriseres av to bromodener og binder til acetylerte lysiner av histoner og ikke-histon ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee og Bohmann, 2018). BET-proteiner fungerer som den transkripsjonelle ko-aktivatoren til mange gener, og regulerer dermed cellesyklus, inflammatorisk respons, oksidativt stress og andre fysiologiske prosesser i forskjellige patologiske modeller (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 er et spesielt godt studert medlem av BET-proteinfamilien, og akkumulerende undersøkelser har rapportert det som et nytt epigenetisk mål for å regulere variertnyresykdommer, inkludert kronisk nefritis, diabetisk nefropati og eksperimentell nyreskade (Zeng og Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). BRD4 har blitt bekreftet å delta i den nukleære faktor-κB (NF-κB)-avhengige transkripsjonsprosessen for å regulere inflammatoriske responser i mange sykdommer (Xu og Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 kan rekrutteres av acetylert RelA (NF-KB-underenhet, et proteinkodende gen) ved lysin 310 (RelA-K310ac) via bromodenene, og aktiverer dermed cyclin-avhengig kinase 9 (CDK9) og fosforylerer RNA-polymerase II for å fremme transkripsjon av NF-KB-målgener (Hajmirza et al., 2018). Nylige studier tyder på at BRD4-hemmere kan være et potensielt terapeutisk alternativ for inflammatoriske sykdommer. I rotteryggmargsskademodeller svekket hemming av BRD4 den inflammatoriske responsen og fremmet funksjonell utvinning av mikroglia (Dey et al., 2019). Hemming av BRD4 opphevet også eksperimentell nyrebetennelse i murine modeller av unilateral ureteral obstruksjon, anti-membran basal GN og infusjon av angiotensin II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

I lys av de potensielle pro-inflammatoriske effektene av Cd og de regulatoriske effektene av BRD4 på betennelse, antok vi at BRD4 er involvert i Cd-utløst inflammatorisk respons. Som forventet medierer BRD4 transkripsjonsprosessen av inflammatoriske cytokiner i Cd-eksponerte rottenyremodeller. Vår studie avslører en potensiell mekanisme i den Cd-utløste inflammatoriske responsen og gir ny innsikt i behandlingen av Cd-indusert nefrotoksisitet.

2. Materialer og metoder

2.1. Kjemikalier og antistoffer

Kadmiumklorid (CdCl2, vannfri, 439800) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). (pluss)-JQ1 (HY-13030) ble hentet fra MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA). Et kjernefysisk proteinekstraksjonssett ble kjøpt fra Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Kina, P0027). Et effektivt kjemiluminescenssett (ECL, 32209) og bicinchoninsyreproteinanalysereagens (BCA, 23225) ble oppnådd fra Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, USA). Primære antistoffer mot følgende proteiner ble brukt: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) ble kjøpt fra Proteintech Group (Wuhan, Kina); -aktin (3700 s), Histone H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), normal kanin-IgG (IgG, 4394) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); BRD4 (ab128874), K (lysin) acetyltransferase 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (acetyl K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488–konjugert (konjugert esel3ab) 1500bit esel3 anti-rab 1 fra Abcam (Cambridge, Storbritannia). Andre antistoffer: Goat Anti-Mouse IgG (H plus L) (115-035-003) og Goat Anti-Rabbit IgG (H plus L) (111-035-003) ble kjøpt fra Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA ).

2.2. Dyr og forsøk

Tjuefire Sprague-Dawley-rotter (hann, 6 uker gamle, 110–120 g) ble kjøpt fra Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, Kina). Rottene fikk fri tilgang til mat og vann i et miljøkontrollert rom (24 ± 5 ​​grader, 12 timer lys/mørke syklus). De eksperimentelle prosedyrene gjaldt for EUs rådsdirektiv 2010/63/EU for dyreforsøk, og alle prosedyrer ble godkjent av Yangzhou University Animal Care and Use Committee. Etter én uke med akklimatisering ble rottene tilfeldig delt inn i fire grupper: (1) Kontrollgruppe: injisert intraperitonealt med det tilsvarende løsningsmiddelet (fysiologisk saltvann eller 2-hydroksypropyl- -cyklodekstrinløsning). (2) Cd-gruppe: CdCl2 (2 mg/kg kroppsvekt, oppløst i fysiologisk saltvann) injisert intraperitonealt i 5 påfølgende dager for å etablere Cd-rusmodellen. (3) Cd pluss JQ1-gruppe: CdCl2 (2 mg/kg kroppsvekt) injisert intraperitonealt i 5 påfølgende dager for å etablere Cd-rusmodellen, og JQ1 (25 mg/kg kroppsvekt, oppløst i 2-hydroksypropyl{{ 25}}cyklodekstrinløsning) injisert intraperitonealt på dag 6–8. (4) JQ1-gruppe: JQ1 (25 mg/kg kroppsvekt) injisert intraperitonealt på dag 6–8. Statistikk over Cd-innhold i rotteserum og nyrevev ble oppført i tabell S1, noe som gjenspeiler den vellykkede etableringen av Cd-eksponerte rottemodeller.

Etter 8 dagers behandling ble rottene drept ved cervikal dislokasjon under dyp anestesi etter 12 timers faste. Nyrevevet ble dissekert og 1 g vev av hver nyre ble raskt lagret ved -80 ◦C for å følge western blot og kvantitativ PCR (qPCR) analyse. Den gjenværende mengden vev ble raskt fiksert i 4 prosent paraformaldehyd (PFA) for immunhistokjemisk (IHC) farging.

2.3. Cellekultur og behandling

Rottenyrecellelinjen (NRK{{0}}E) ble hentet fra Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. NRK-52E-celler ble dyrket med Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Gibco, 12800-017) som inneholdt 5 prosent føtalt bovint serum (FBS, Gibco, 10437-028), penicillin og streptomycin (1 00 U/mL) i en fuktet tilstand med 5 prosent CO2 og 95 prosent luft ved 37 grader . CdCl2 (ultraprent vann-oppløst) og JQ1 (dimetylsulfoksid-oppløst) ble separat lagret ved 4 grader og -20 grader, og fortynnet i arbeidsløsninger før bruk. Den eksperimentelle designen var som følger: (1) Celler ble behandlet med 0, 2,5, 5, 10 μM Cd i 12 timer, eller 5 μM Cd i 0, 6, 12, 24 timer for å utføre de påfølgende analysene. (2) Celler ble behandlet med 5 μM Cd og/eller 0,5 μM JQ1 i 12 timer for å utføre de påfølgende analysene. (3) Celler ble transfektert med siBRD4 og/eller behandlet med 5 μM Cd i ytterligere 12 timer for å utføre de påfølgende analysene.

2.4. Liten forstyrrende RNA-transfeksjon

Vi transfekterte 20 nM BRD4 lite interfererende RNA (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) inn i NRK-52E-cellene med Lipofectamine RNAiMAX transfeksjonsreagens (Thermo Fisher Scientific, Kat. nr. 13778150) i 24 timer i henhold til produktmanualene. Følgende sense siRNA-er ble brukt:

siBRD4, med en målsekvens på 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (siRNA negativ kontroll), med en målsekvens på 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Nyrevevsprøver og NRK-52E-celler ble lysert i RIPA-buffer som inneholdt proteasehemmere for å trekke ut totalt protein. Kjerneproteinet ble tilberedt fra ferske vev og celler på forhånd og lagret ved -80 grader. Proteinprøver (20–30 ug per prøve) ble separert ved SDS-PAGE-elektroforese, og deretter overført til polyvinylidenfluoridmembranene (Millipore, ISEQ00010). Membranene ble blokkert med 5 prosent skummet melk i 90 minutter, og inkubert 12 timer ved 4 grader med følgende primære antistoffer: -aktin (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Deretter ble membranene vasket med TBST og inkubert med tilsvarende sekundære antistoffer (1:10000) i 90 minutter ved romtemperatur (RT). Membranene ble inkubert med elektrokjemiluminescens (ECL, ThermoFisher Scientific) og bestemt på Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Frankrike), og den optiske tettheten ble analysert ved bruk av ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).

2.6. Immunofluorescens (IF) farging

NRK{{0}}E-celler sådd i en 24-brønnplate ble dyrket til omtrent 60 prosent sammenløp. Cellene ble behandlet med 5 μM Cd og/eller 0,5 μM JQ1 i 12 timer, deretter fiksert med PFA (4 prosent, 10 min), permeabilisert med Triton X- 100 (0,1 prosent, 15 min), blokkert med BSA (2 prosent, 90 min) ved RT, og inkubert med primært antistoff (NF-KB p65, 1:50 fortynning) over natten ved 4 grader. Etter å ha blitt vasket med PBS tre ganger, ble cellene inkubert med sekundært antistoff (1:500 fortynning) i 90 minutter, og med DAPI i 5 minutter ved romtemperatur, deretter ble cellene observert under et konfokalt mikroskop. NF-KB kjernefysisk translokasjon ble analysert i tre uavhengige studier.

2.7. qPCR

Det totale RNA fra nyrevev og NRK-52E-celler ble ekstrahert med RNAiso Plus-sett (Takara Bio, Shiga, Japan). 1 ug total RNA ble brukt til å syntetisere 1. kjede cDNA i henhold til produsentens manual (Roche, Basel, Sveits). 2 μL komplementært DNA (cDNA) per brønn ble tatt for å detektere de relative mRNA-nivåene ved bruk av et LightCycler® 96 Real-Time PCR System (Roche). Beregn de relative mRNA-nivåene i henhold til ligning 2-△△CT. Primerne ble oppført i tabell S2. -aktin var et rottereferansegen.

2.8. Samimmunutfelling (Co-IP)

Nyrevevet og NRK-52E-cellene ble lysert i fersk klargjort cellelysebuffer (20 mM HEPES–KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 prosent Triton X{{8} }) som inneholder PMSF. Protein G-kuler (100 μL per prøve, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ble blandet med 2 ug BRD4, RelA-K310ac eller IgG-antistoff per prøve, og rotert i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter ble de totale proteinlysatene inkubert med perler-antistoffkompleks over natten ved 4 grader. Etter å ha blitt vasket med cellelysebuffer tre ganger, ble immunutfellingene resuspendert med 1 × SDS PAGE prøvebuffer for å konfigurere prøvene. Målproteinene ble påvist ved bruk av western blotting med anti-BRD4 og anti-RelA K310ac primære antistoffer.

2.9. Statistisk analyse

Alle data ble oppnådd fra minst tre uavhengige eksperimenter og uttrykt som gjennomsnitt ± SEM med mindre annet er nevnt. Eksperimentelle grupper ble sammenlignet med uparet tosidet Students t-test eller enveis variansanalyse (ANOVA) ved bruk av SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Signifikansen ble satt til p <>

3. Resultater

3.1. Cd induserer ekspresjonen av inflammatoriske cytokiner in vivo og in vitro

Som en miljøforurensning har Cd vist seg å forårsake nyreskade ved å regulere en rekke biologiske prosesser (Wang et al., 2019c). I denne studien ble endringene i transkripsjonsnivåene til inflammatoriske cytokiner undersøkt etter Cd-eksponering for å undersøke om betennelse er involvert i Cd-indusert nefrotoksisitet. Data viste at Cd-eksponering signifikant økte interleukin (IL)-1 og tumornekrosefaktor (TNF)-proteinnivåer i NRK-52E-celler (fig. 1A-B) og rottenyrevev (fig. 1C) -D). I mellomtiden, som vist i fig. 1E-F, økte Cd-eksponering transkripsjonsnivåene av inflammatoriske cytokiner (IL-1, IL-6, TNF- og (Monocytt kjemoattraktant protein-1) MCP -1) in vivo og in vitro. Disse funnene tyder på at Cd induserer ekspresjonen av inflammatoriske cytokiner i rottenyrer.

3.2. BRD4 deltar i den Cd-induserte transkripsjonsprosessen av inflammatoriske cytokiner

BRD4 er en nylig beskrevet epigenetisk regulator som binder seg til acetylerte histoner eller ikke-histoner for å regulere betennelsesprosesser i mange sykdommer. Her ble BRD4-hemmer JQ1 og BRD4-siRNA brukt for å undersøke rollen til BRD4 på Cd-utløst inflammatorisk respons. Data viste at Cd-forhøyede IL-1- og TNF-proteinnivåer ble nedregulert ved JQ1-behandling in vivo og in vitro (Fig. 2A-D) og ved BRD4-knockdown in vitro (Fig. S1A-B). I mellomtiden hemmet JQ1-behandling signifikant Cd-forsterkede transkripsjonsnivåer av IL-1, IL-6, TNF- og MCP-1 i NRK-52E-celler (fig. 2E) og rottenyrevev (fig. 2F). Dessuten reduserte BRD4-knockdown signifikant Cd-økte transkripsjonsnivåer av inflammatoriske cytokiner i NRK-52E-celler (Fig. S1C). Samlet antyder disse funnene at BRD4 er en kritisk regulator av Cd-utløst inflammatorisk respons i rottenyrer.

3.3. BRD4-ekspresjonsnivåer forblir uendret etter Cd-eksponering

Deretter ble endringer i ekspresjonsnivåene til BRD4 oppdaget etter Cd-eksponering. NRK-52E-celler ble behandlet med Cd under en konsentrasjonsgradient, og rotter ble injisert intraperitonealt med Cd i 5 dager for å belyse effekten av Cd på BRD4-ekspresjon i nyrene in vivo og in vitro. Resultatene viste at BRD4-proteinnivåene var uendret i både de Cd-eksponerte NRK-52E-cellene (Fig. 3A-B) og rottenyrevev (Fig. 3C-D). BRD4 mRNA-nivåer var også uendret etter Cd-eksponering (fig. 3E-F). Disse resultatene indikerer at BRD4 medierer Cd-utløst inflammatorisk respons ikke er avhengig av endringer i ekspresjonsnivå.

3.4. BRD4 regulerer Cd-promotert NF-KB kjernefysisk translokasjon

Rollene til BRD4 i Cd-utløst inflammatorisk respons ble utforsket i vår studie. Endring av NF-KB-signalveien er nært knyttet til transkripsjonen av inflammatoriske cytokiner (Chi et al., 2021). Vår studie fant at BRD4 er involvert i Cd-regulert kjernefysisk translokasjon og aktivering av NF-KB. Først ble den subcellulære lokaliseringen av NF-KB bestemt ved IF-farging og IHC-farging. Data i fig. 4A og D viste at JQ1 hemmer Cd-fremmede NF-KB-kjernetranslokasjon i NRK-52E-celler og rottenyrevev. I mellomtiden viste Western blot-resultater at JQ1 signifikant reduserte Cd-økte nukleære proteinnivåer av NF-KB in vivo (fig. 4B-C) og in vitro (fig. 4E-F). Tilsvarende hemmet BRD4-knockdown også signifikant Cd-promotert NF-KB-kjernetranslokasjon (Fig. S2A) og reduserte Cd-økte nukleære proteinnivåer av NF-KB (Fig. S2B-C) i NRK-52E-celler. Samlet sett kan hemming av BRD4 redusere Cd-promotert NF-KB-kjernetranslokasjon, noe som antyder at BRD4 medierer aktiveringen av NF-KB-signalveien i nyrene etter Cd-eksponering.

3.5. Cd øker RelA K310 acetyleringsnivåer

Studier har bekreftet at BRD4 binder seg til acetylert RelA K310 gjennom sine bromdomener for å regulere NF-κB-avhengig transkripsjon (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). Dermed ble acetyleringsnivået til RelA K310 og ekspresjonen av to enzymer påvist. Data viste at RelA-K310ac- og acetylase Ep300-proteinnivåene ble redusert kontinuerlig med den økte konsentrasjonen av Cd, mens deacetylase Sirt1-proteinnivået gradvis økte i NRK-52E-celler (fig. 5A-B) og rottenyrevev (fig. 5C-D). Ep300 og Sirt1 mRNA-nivåer viste også de samme trendene (fig. 5E-F). Disse resultatene tyder på at Cd fremmer acetyleringsnivået til RelA K310, og dermed kan BRD4 være involvert i Cd-utløst inflammatorisk cytokintranskripsjon i nyrene.

3.6. Cd øker BRD4-bindingen til RelA-K310ac for å forbedre transkripsjonsfunksjonen

Binding til acetyleringssteder er grunnlaget for transkripsjonsreguleringen av BRD4 (Huang et al., 2009). For å verifisere om Cd regulerer BRD4-funksjonen ved å øke BRD4-bindingen til RelA-K310ac, ble interaksjonen mellom RelA-K310ac og BRD4 oppdaget via Co-IP. Data i fig. 6A viste at Cd signifikant forbedret interaksjonen mellom RelA-K310ac og BRD4 i NRK-52E-celler, som ble lindret av JQ1-behandling eller BRD4-knockdown. Den samme trenden ble også observert i rottenyrevev (fig. 6B). Disse resultatene viser at Cd øker bindingen av BRD4 til RelA-K310ac, noe som fremmer NF-KB-avhengig transkripsjon og deretter bidrar til den Cd-utløste inflammatoriske responsen.

4. Diskusjon

Cd har blitt rapportert som en potensiell utløser av betennelse på grunn av dens høye toksisitet, mens den nøyaktige mekanismen fortsatt ikke er fullt ut forstått (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Studien vår bekreftet at Cd induserer inflammatorisk cytokinekspresjon i rotte nyreceller, og fant at BRD4, et epigenetisk mål som har kritiske funksjoner i en rekke cellulære prosesser inkludert betennelse, bidrar til Cd-utløst inflammatorisk respons. Ytterligere eksperimenter indikerte at BRD4 er involvert i Cd-promotert NF-KB-signalveiaktivering. Cd økte også acetyleringsnivået til RelA K310, og økte dermed BRD4-bindingen til acetylert NF-KB RelA for å fremme NF-KB-avhengig inflammatorisk cytokintranskripsjon.

Betennelse er en av de naturlige forsvarsmekanismene mot eksogene kjemikalier, mens den ukontrollerte og upassende inflammatoriske responsen kan skade normalt vev og indusere autoimmune sykdommer (Jian et al., 2018). Cd-økte biologiske markører for betennelse var ofte assosiert med ulike sykdommer. Studier har vist at Cd-indusert betennelse er involvert i aterogenese (Tinkov et al., 2018). Dessuten fremmet Cd uttrykket av inflammatoriske cytokiner, som bidro til lunge- og testikkelvevsskade og induserer hepatotoksisitet (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Disse skadelige effektene er i samsvar med resultatene våre, at den inflammatoriske responsen er involvert i Cd-indusert nyreskade. Økende forskning har fokusert på forekomstmekanismene for Cd-indusert betennelse. Som et godt studert BET-proteinfamiliemedlem spiller BRD4 en kritisk rolle i mange biologiske prosesser inkludert betennelse. Her ble JQ1 (en hemmer av BRD4) og siRNA brukt til å deregulere den funksjonelle aktiviteten til BRD4 og fant at inhiberingen av BRD4 reduserte Cd-indusert transkripsjon av inflammatoriske cytokiner i rottenyrer, noe som tyder på at BRD4 deltar i den Cd-utløste inflammatoriske responsen . Det antas generelt at dysregulering av BRD4-ekspresjon er en avgjørende hendelse i forekomsten av inflammatorisk respons. Ved ryggmargsskade, patologisk hjertehypertrofi og andre betennelsesassosierte sykdommer bidro det forstyrrede BRD4-uttrykket til uttrykket av inflammatoriske cytokiner (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Imidlertid hadde Cd ingen effekt på ekspresjonsnivåene til BRD4 under de nåværende eksperimentelle forholdene, noe som førte til at vi vurderte om BRD4 medierer den Cd-utløste inflammatoriske responsen gjennom andre veier.

NF-KB er en viktig regulatorisk faktor i inflammatoriske prosesser og er ansvarlig for å kontrollere uttrykket av mange inflammatoriske mediatorer (Lawrence, 2009). Studier har blitt rapportert at BRD4 er involvert i reguleringen av NF-KB-signalveien. Huang et al. (2017) foreslo at BRD4 regulerte IKK-mediert NF-KB-aktivering gjennom p38- og JNK-MAPK-veiene. Wang et al. (2019a) fant at BRD4 knockdown eller JQ1-behandling blokkerte lipopolysakkarid (LPS)-aktivert NF-KB-signalvei i mikroglia. Meng et al. (2014) viste at JQ1-behandling blokkerte ekspresjonen av de inflammatoriske cytokinene ved å hemme aktiveringen av NF-KB i LPS-behandlede RAW 264.7-celler. Disse rapportene indikerte at BRD4 medierer aktiveringen av NF-KB i mange betennelsesmodeller mens hemming av BRD4 er en effektiv terapeutisk tilnærming til anti-inflammasjon. I den nåværende studien blokkerte inhiberingen av BRD4 den nukleære translokasjonen av NF-kB i Cd-eksponert rottenyrevev og NRK-52E-celler, noe som tyder på at BRD4 medierer den Cd-aktiverte NF-KB-signalveien.

Vanligvis, etter at NF-KB ble aktivert av ulike stimuli og translokert inn i kjernen, binder BRD4 seg til acetylert NF-KB RelA på K310-stedet, noe som øker stabiliteten og transkripsjonsaktiviteten i kjernen (Hajmirza et al., 2018). Acetyleringsnivået til RelA K310 påvirker således den regulatoriske funksjonen til BRD4 på den inflammatoriske responsen. I hippocampale nevroner medierte deacetylase Sirt1 RelA K310-deacetylering for å regulere BACE1-ekspresjon, noe som bidro til produksjonen av neuronal amyloid (Flores-Leon et al., 2019). I glioblastomceller nedregulerte fotodynamisk terapistress deacetylasen Sirt1 og aktiverte acetylasen Ep300, noe som økte RelA-K310ac-nivåene og førte til økt produksjon av det pro-overlevelse nitrogenoksidet (Fahey et al., 2019). Vår studie fant at Cd fremmer acetyleringsnivået til RelA K310 ved å øke Ep300-ekspresjonen og redusere Sirt1-ekspresjonen, noe som indikerer at Cd påvirker den regulatoriske funksjonen BRD4 ved å øke acetyleringsnivåene til RelA K310.

Spesielt viste resultatene våre at JQ1-behandling var mer effektiv enn BRD4-knockdown for å lindre Cd-utløst inflammatorisk respons. JQ1 har en høy bindingsaffinitet med BRD4 og kan nesten fullstendig blokkere BRD4-binding til kromosomet, mens siBRD4 bare kan forstyrre BRD4-proteinekspresjon for å redusere BRD4-binding til målstedet, noe som antyder at BRD4 medierer Cd-utløst inflammatorisk respons kan avhenge av binding med acetylert NF-KB RelA. Nyere studier har vist en lignende reguleringsmekanisme: etter NF-KB kjernefysisk translokasjon og aktivering, interagerte BRD4 deretter med acetylert RelA for å koaktivere transkripsjonsaktiveringen av NF-KB (Huang et al., 2009). RelA–BRD4 ble rekruttert til NF-κB-målpromotere under forskjellige inflammatoriske stimuleringstilstander, mens JQ1-behandling virket ved å forhindre BRD4-binding til acetylert NF-κB RelA, og dermed reduserte transkripsjonsaktiviteten til NF-κB (Zou et al., 2014). Resultatene våre viste at hemmingen av BRD4 blokkerer Cd-forsterket interaksjon mellom BRD4 og RelA-K310ac i rottenyrer, og støtter resultatene ovenfor om at hemming av BRD4 undertrykker den Cd-induserte transkripsjonsaktiviteten til NF-KB, noe som indikerer at Cd øker BRD4-bindingen til acetylert NF-KB RelA for å øke transkripsjonen av inflammatoriske cytokiner.

Oppsummert avslørte vår studie de regulatoriske mekanismene til BRD4 i Cd-utløst inflammatorisk respons i rottenyrer: (1) BRD4 medierer Cd-indusert NF-KB kjernefysisk translokasjon og aktivering. (2) Cd øker RelA K310-acetyleringsnivåer og øker BRD4-bindingen til acetylert NF-KB RelA, som fremmer NF-KB-avhengig transkripsjon av inflammatoriske cytokiner. I tillegg lindret inhiberingen av BRD4 signifikant Cd-forhøyede inflammatoriske cytokinnivåer, noe som tyder på at målrettet BRD4 har potensial til å utvikles som et effektivt middel for å behandle inflammatoriske sykdommer inkludert Cd-indusert nefritt.

CRediT forfatterbidragserklæring

Zhongguo Gong: Konseptualisering, metodikk, visualisering, formell analyse, validering, undersøkelse, formell analyse, datakurering, skriving – originalutkast. Gang Liu: Konseptualisering, Metodikk, Visualisering, Datakurering, Skriving – originalutkast, Prosjektadministrasjon, Finansieringsanskaffelse. Wenjing Liu: Programvare, ressurser, metodikk, formell analyse. Hui Zou: Prosjektadministrasjon, Veiledning. Ruilong Song: Programvare, formell analyse, tilsyn. Hongyan Zhao: Programvare, formell analyse, tilsyn. Yan Yuan: Tilsyn. Jianhong Gu: Tilsyn. Jianchun Bian: Finansieringsanskaffelse, tilsyn. Jiaqiao Zhu: Skriving – gjennomgang og redigering, tilsyn. Zongping Liu: Skriving – gjennomgang og redigering, tilsyn,

Prosjektadministrasjon, Finansieringsanskaffelse, konseptualisering.

Erklæring om konkurrerende interesse

Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold som kan ha sett ut til å påvirke arbeidet som er rapportert i denne artikkelen.

Bekreftelse

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 31872533, 31902329, 32072933), National Key Research and Development Program of China (nr. 2016YFD0501208), og prosjektet til Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institusjon (PADP). Manuskriptet ble redigert for riktig engelsk språk, grammatikk, tegnsetting, stavemåte og generell stil av en eller flere av de høyt kvalifiserte engelskspråklige redaktørene ved ELIXIGEN.

Referanser

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Royal jelly demper kadmium-indusert nefrotoksisitet hos hannmus. Sci. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Samtidig eksponering for ikke-toksiske nivåer av kadmium og fluor induserer levertoksisitet hos rotter via utløser mitokondriell oksidativ skade, apoptose og NF-kB-veier. Environ. Sci. Forurense. Res. Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Bukkehornkløverfrøpulver reduserer kadmiumindusert testikkelskade og levertoksisitet hos hannrotter. Exp. Toxicol. Pathol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting på Nrf2: hvordan Nrf2-signalering kan påvirke de terapeutiske aktivitetene til BET-proteinhemmere. Bioessays 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Roller av selenoprotein S i reaktive oksygenarter-avhengig nøytrofil ekstracellulær felledannelse indusert av selen- mangelfull arteritt. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J. ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 styrer utvikling av hematopoetiske stamceller og modulerer inflammatoriske responser fra makrofager. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., Born, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstr.m, G., 2017. Kadmiumeksponering er assosiert med løselig urokinaseplasminogenaktivatorreseptor, en sirkulerende markør for betennelse og fremtidig kardiovaskulær sykdom. Environ. Res. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Oppstrøms signalhendelser fører til økt produksjon av pro-overlevelse nitrogenoksid i fotodynamisk utfordrede glioblastomceller. Free Radic. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Variasjon av forskjellige metabolitter og tungmetaller i Oryza sativa L., relatert til kronisk nyresykdom av ukjent etiologi i Sri Lanka. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Palmitinsyre-indusert NAD( pluss ) utarming er assosiert med den reduserte funksjonen til SIRT1 og økt ekspresjon av BACE1 i hippocampale nevroner. Neurochem. Res. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Kadmiumbehandling induserer echinokokkose, DNA-skade, betennelse og apoptose i hjertevev hos albino Wistar-rotter. Environ. Toxicol. Pharmacol. 59, 43–52. betennelse og kreft. Biomedisiner 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Akutt eksponering for kadmium induserer forlenget nøytrofili sammen med forsinket induksjon av granulocyttkolonistimulerende faktor i leveren til mus. Arch. Toxicol. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Effektene av kadmiumeksponering i induksjon av betennelse. Immunopharmacol. Immunotoksikol. 42 (1), 1–8.