Glutamatreseptoren spiller en rolle i forsvar mot Botrytis Cinerea gjennom elektrisk signalering i tomat

Abstrakt:

Planteglutamatlignende reseptorgener (GLRs) er homologe med pattedyrs ionotrope glutamatreseptorgener (iGluRs). Selv om GLR-er har vært involvert i planteforsvar mot biotisk stress, er forholdet mellom GLR-mediert planteimmunitet mot sopppatogener og elektriske signaler fortsatt dårlig forstått. Her fant vi at forbehandling med en GLR-hemmer, 6,7-dinitriquinoxaline-2,3-dion (DNQX), økte følsomheten til tomatplanter for det nekrotrofiske sopppatogenet Botrytis cinerea. Vurdering av glr3.3, glr3.5 og glr3.3/glr3.5 dobbeltmutantene ved B. cinerea-infeksjon viste at tomat GLR3.3 og GLR3.5 er essensielle for planteimmunitet mot B. cinerea, der GLR3. 3 spiller hovedrollen.

Analyse av membranpotensialendringene indusert av glutamat (Glu) eller glycin (Gly) avslørte betydelig redusert amplitude ved å slå ut GLR3.3 i tomater. Mens behandling med Glu eller Gly signifikant økte immuniteten mot B. cinerea i villtypeplanter, ble denne effekten signifikant svekket i glr3.3-mutanter. Dermed viser våre data at GLR3.3- og GLR3.5-mediert planteimmunitet mot B. cinerea er assosiert med elektriske signaler i tomatplanter.

Styrken av immunitet bestemmer direkte vår helsestatus. Når immuniteten er sterk, er vi bedre i stand til å bekjempe sykdom og infeksjon. Omvendt, hvis immunsystemet vårt er svakt, kan patogener lettere invadere kroppene våre og føre til at vi blir syke. Derfor er det veldig viktig å holde immunforsvaret sunt, som kan forbedres gjennom kosthold, trening og redusere stress.

I forskningen ble det funnet at Cistanche Herba kan forbedre immuniteten betydelig. De totale glykosidene av Cistanche deserticola, Cistanche deserticola polysaccharides og verbascoside kan redusere innholdet av MDA i leveren og hjernevevet betydelig, og aktiviteten til telomerase i hjertet og hjernevevet. Den fagocytiske funksjonen til makrofager er forbedret, og den proliferative responsen til lymfocytter og innholdet av IL-2 i perifert blod økes betydelig, og forbedrer dermed immunfunksjonen til kroppen.

Klikk helsemessige fordeler av cistanche

1. Introduksjon

Planter som vokser i et naturlig miljø er kontinuerlig truet av ulike patogener. Disse biotiske stressfaktorene påvirker avlingsproduksjonen og forårsaker ofte økonomiske tap. Siden planter mangler mobilitet, har de anskaffet en rekke signaltransduksjonssystemer under utviklingen for effektivt å dempe de negative effektene av miljøendringer. Jo raskere disse signalene manøvrerer, jo mer sannsynlig vil planter tilpasse seg og motstå det innkommende stresset. Signalene som er rapportert så langt inkluderer kalsiumstrøm, ROS (reaktive oksygenarter), elektriske signaler, etc. [1–5], som reagerer i løpet av sekunder eller minutter.

Planteglutamatlignende reseptorgener (GLRs) er homologe med pattedyrs ionotrope glutamatreseptorgener (iGluRs), som utløser elektriske og Ca2 pluss signalkaskader [3,6]. Plante-GLR-er antas å ha ligandbinding så vel som ionekanalaktivitet. GLR-er har 20 familiemedlemmer i Arabidopsis [7] og 13 medlemmer i ris [8]. Det er 13 full-lengde GLR gener i tomatplanter [9].

Viktigere er at GLR-er er involvert i plantens respons på biotisk stress. For eksempel er AtGLR3.3 en viktig modul for planteimmunitet mot bakteriepatogenet P. syringae pv. tomat DC3000 (Pst DC3000), Oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis og insektet Spodoptera littoralis [10–12].

I tillegg har Wang et al. (2019) rapporterte at GLR3.5 fungerer i tomatforsvar mot rotknute-nematoden (RKN) Meloidogyne incognita [13]. Overekspresjon av reddik GluR-komplementært DNA i Arabidopsis-planter øker motstanden mot et nekrotisk sopppatogen, B. cinerea. Arabidopsis glr3.3-mutanter viser imidlertid ikke økt sårbarhet for sopppatogenet sammenlignet med Col-0. Dermed er rollen til GLR i planteimmunitet mot sopppatogener fortsatt kontroversiell.

Anleggs GLR-er er involvert i generering og overføring av elektriske signaler. Eksistensen av elektriske signaler i planter ble oppdaget av Burden-Sanderson og Charles Darwin [14,15]. De er hurtigresponssignaler generert av den øyeblikkelige endringen i den elektriske potensialgradienten på plasmamembranen eller alveolarbladmembranen [16]. Alle planter kan produsere langdistanse elektriske signaler, som spiller en rolle i kommunikasjonen av forskjellige vev og organer, noe som fører til integrering av miljøresponser [17,18].

De siste årene har funksjonen til elektriske signaler i GLR-mediert planteresistens mot biotisk stress tiltrukket seg mye oppmerksomhet [19]. I Arabidopsis kan insekter som lever av blader forårsake endringer i overflatepotensialet, noe som fører til ekspresjon av flere nøkkeljasmonater (JA)-induserbare regulatoriske gener i den voksne fasen av planter [3]. Rot-knute-nematodeangrep på tomatrøtter forårsaker overføring av elektriske og ROS-signaler fra røtter til blader, noe som resulterer i en akkumulering av JA i blader [13]. Farmer et al. (2014) foreslo en hypotese om at distal JA-syntese i planter ved sår var avhengig av clade 3 GLR-medierte elektriske signaler [20]. Forholdet mellom elektriske signaler og GLR-indusert planteimmunitet mot sopppatogener er imidlertid ikke fullt ut underbygget.

Tomaten (Solanum lycopersicum L.) rangerer som en av verdens mest betydningsfulle dyrkede avlinger når det gjelder økonomisk betydning [21]. Ikke desto mindre skader soppsykdommer tomatproduksjonen, noe som resulterer i betydelige økonomiske tap [22]. Spesielt har Botrytis cinerea, en typisk nekrotrofisk sopp, blitt ansett for å være på andreplass blant de 10 beste sopppatogenene i molekylær plantepatologi [23]. Den har et bredt vertsområde og kan infisere over 200 plantearter, inkludert en rekke kontantvekster [24]. B. cinerea kan forårsake en betydelig nedgang i tomatutbytte og fruktkvalitet etter høsting [25]. En tomatsort med bred resistens mot B. cinerea er imidlertid ikke utviklet ennå. Derfor er det spesielt viktig å forstå de molekylære mekanismene for tomatresistens mot B. cinerea.

Det er 13 GLR-gener i full lengde i tomatplanter. I denne studien ble GLR3.3 og GLR3.5, som spiller positive roller i kuldetoleranse [26] og forsvar mot RKNs [13], funksjonelt karakterisert med hensyn til tomatplanteimmunitet mot B. cinerea. Vi fant at GLR3.3 og GLR3.5 er viktige aktører i planteimmunitet mot B. cinerea i tomater, muligens gjennom binding til ligand glutamat (Glu) eller glycin (Gly), og derved utløse elektriske signaler. Dette funnet har iboende vitenskapelig verdi, med potensial for å utvikle nye strategier for å øke avlingsresistensen mot B. cinerea.

2. Materialer og metoder

2.1. Plantematerialer, vekstforhold og kjemiske behandlinger

Tomatlinjene (CRISPR-Csa9-redigerte linjer av glr3.3, glr3.5 og glr3.3/3.5) som ble brukt i denne studien var i CV Ailsa Craig (AC) villtype (WT) bakgrunn , som tidligere rapportert [27]. Ved jordfri substratkultur ble tomatplanter dyrket i potter som inneholdt et blandet substrat (vermikulitt: torv, 1:3, v/v) og gjødslet med Hoaglands næringsløsning.

Når det gjelder hydroponisk kultur, ble tomatfrø først spiret i brett fylt med et blandet substrat (vermikulitt: perlitt, 1:1, v/v), og etter oppvekst ble frøplanter overført til plastbeholdere med 1,5 L kapasitet (fire frøplanter) per beholder). Beholderne ble fylt med halvsterk Enshi næringsløsning, som ble kontinuerlig ventilert ved å lufte luften fra en luftpumpe [21]. Følgende var vekstbetingelsene: 14 timer lys/8 timer mørk fotoperiode; 24 ◦C/20 ◦C dag/natt temperatur; og 400 µmol m−2 s −1 PPFD (fotosyntetisk fotonflukstetthet). Fire uker gamle tomatplanter ble utsatt for behandlinger.

For DNQX (6,7-dinitriquinoxaline-2,3-dion, GLRs inhibitor) forbehandlingsanalyse, ble WT-plantene behandlet med bladspray med 1 mM DNQX eller H2O som kontroll, 12 timer før B. cinerea inokulering. Glu- og Gly-forbehandlingsanalyser ble utført da glr3.3-mutantene og WT-plantene ble behandlet med 20 mM Glu, 20 mM Gly eller H2O som kontroll en gang per dag på både de aaksiale og adaksiale overflatene til bladene. To dager etter farmakologisk behandling ble plantene utsatt for patogeninokulering.

2.2. Patogeninokulering og sykdomssymptomanalyser

B. cinerea-stammen BO5-10 ble brukt i denne studien. Inokuleringen ble utført ved bruk av en suspensjon av B. cinerea med en tetthet på 2 × 105 sporer mL−1 [28]. Helbladsdelen av tomatplanter ble sprøytet med suspensjonen. De inokulerte plantene ble plassert i en forseglet boks for å opprettholde en fuktighet på rundt 90 prosent. Temperaturen og lyset var det samme som under normale dyrkingsforhold.

Etter patogeninokulering ble B. cinerea aktin-mRNA-akkumulering kvantifisert ved {{0}}dag etter inokulering (dpi) [29]. Klorofyllfluorescens ble målt med et klorofyllfluorometer (IMAG-MAXI; Heinz Walz) ved 3 dpi. Den fotokjemiske kvanteeffektiviteten til PSII (ΦPSII) ble analysert som Fm0–F/Fm0 [30].

2.3. Subcellulær lokalisering

GLR3.3 og GLR3.5 genfragmenter ble amplifisert ved å bruke primerne oppført i tilleggstabell S1 og klonet inn i en pAC402 vektor med en grønn fluorescerende protein (GFP) tag [31]. Agrobacterium-stamme GV3101, som bærer plasmider, og Agrobacterium, som bærer FLS2-mCherry som en plasmamembranlokaliseringsmarkør, ble forbigående samuttrykt i den transgene Nicotiana benthamiana (uttrykt med histon 2B-mCherry for å markere kjernelokaliseringen), tidligere beskrevet [32]. 2 dager etter infiltrasjon ble de fluorescerende signalene til GFP- eller mCherry-merkede proteiner vurdert i blader ved bruk av et Zeiss LSM 780 konfokalmikroskop ved tidligere beskrevne eksitasjons-/emisjonsbølgelengder [28].

2.4. RNA-isolering, transkripsjon og qRT-PCR

Totalt RNA ble isolert fra tomatblader ved å bruke RNAsimple Total RNA Kit (Tiangen, Kina) og omvendt transkribert ved bruk av ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japan). qRT-PCR-prosessen ble utført ved bruk av LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche, Sveits). Reaksjonssystemet ble utført som beskrevet i forrige forsøk [28]. De spesifikke primerne for B. cinerea-aktingenet og det interne kontroll-tomat-aktingenet er oppført i tilleggstabell S1.

2.5. Elektrisk potensialopptak

Hydroponiske tomatplanter på firebladsstadiet ble brukt til elektrisk potensialregistrering. Borosilikatglasskapillærer med en ytre diameter på 1,5 mm og en indre diameter på 0.86 mm (Sutter Instrument Company, Amerika) ble formet til glassmikroelektroder med en spissdiameter på rundt 0 ,5 mm for intracellulære cytoplasmatiske potensialmålinger. En APE-2 vertikal mikropipettetrekker (Narishige, Tokyo, Japan) ble brukt til å trekke kapillærer etter oppvarming. Mikroelektroder ble fylt med 1 M KCl og satt inn i mesofyllcellene til et blad. Bladet ble nedsenket med den basiske løsningen (sammensatt av 5 mM MES, {{10}},5 mM CaSO4, 0,05 mM KCl og pH 6,0) [13], som var utført som vist i tilleggsfigur S1. Hver elektrode ble koblet til en differensialforsterker. To to-kanals forsterkere (FD223 og Duo773, World Precision Instruments) ble brukt til å oppdage signalene. Den hydroponiske løsningen ble erstattet med den samme løsningen tilsatt 2 mM Glu eller 2 mM Gly ved bruk av infusjonsrøret, når verdien av målt membranpotensial var stabil. Amplituder er potensielle forskjeller i forhold til grunnlinjen før endringene.

2.6. Statistisk analyse

Eksperimentene ble utført via et fullstendig randomisert design, og minimum tre replikater ble brukt i hvert eksperiment. Med mindre annet er oppgitt, for hver biologisk replikasjon, ble to blader fra hver av de to plantene kombinert og brukt som en uavhengig prøve. Tre separate eksperimenter ble utført uavhengig. Vi kjørte en variansanalyse på dataene ved å bruke SAS programvareversjon 8 (SAS Institute) og brukte deretter Tukeys test for å bestemme signifikans på 5 prosent nivå.

3. Resultater

3.1. Forbehandling med en GLR-hemmer øker følsomheten til tomat for B. cinerea

For å utforske rollen til GLR i planteforsvar mot B. cinerea, ble tomatplantene sprayet med DNQX eller H2O (kontroll), i 12 timer før inokulering med B. cinerea. Ved 3 dpi med B. cinerea viste de inokulerte bladene synlige sykdomslesjoner. B. cinerea-infeksjonsindusert skade på blader ble vurdert ved bruk av klorofyllfluorescensavbildning for å bestemme avvikene i kvanteutbyttet til fotosystem II (ΦPSII) (Figur 1a,b). Etter inokulering med B. cinerea ble ΦPSII signifikant redusert. Spesielt var verdien av ΦPSII i de DNQX-behandlede plantene lavere enn i kontrollen. DNQX-behandling økte også forekomsten av B. cinerea-aktin-mRNA i bladene (figur 1c). Disse funnene indikerer at GLR positivt regulerer planteimmunitet mot B. cinerea i tomatplanter.

Figur 1. DNQX-behandling øker følsomheten til tomater for B. cinerea. Fire uker gamle tomatplanter ble behandlet med 1 mM DNQX eller H2O, 12 timer før inokulering med B. cinerea: (a) pseudofargebilder av tomatblader som viser ΦPSII ved 3 dpi; (b) kvantitative verdier av ΦPSII ved 3 dpi; (c) transkripsjonsoverflod av B. cinerea-aktin i tomatblader inokulert med B. cinerea ved 1 dpi. Resultatene i panelene (b,c) er presentert som gjennomsnittsverdier ± SD; n=4. Statistisk signifikante forskjeller mellom behandlinger (p < 0.05, Tukeys test) vises med forskjellige bokstaver. Forsøkene beskrevet ovenfor ble utført tre ganger, med samme funn hver gang.

3.2. Subcellulær lokalisering av GLR3.3 og GLR3.5

Tomat GLR3.3 og GLR3.5 er homolog med henholdsvis Arabidopsis GLR3.3 og GLR3.6 (9], som er rapportert å delta som respons på nematodeangrep og kuldetoleranse hos tomater. For å bestemme den subcellulære lokaliseringen av tomat GLR3.3og GLR3.5, GLR3.3-GFP, GLR3.5-GFP og GFP ble transformert til Agrobacteriumtumefaciens, og deretter forbigående uttrykt i N. benthamiana. Konfokalmikroskopi av bladepidermale celler viste at kontroll-GFP-signalet viste en lokalisering i cellemembranene, cytosolene og kjernene (figur 2). De fluorescerende signalene til GLR3.3-GFP ogGLR3.5-GFP ble kolokalisert med FLS2-mCherry ved plasmaet membraner av cellene ble ikke observert at GLR3.3 og GLR3.5 kolokaliserte med histon 2B-mCherry ved kjernene. Resultatene tyder på at tomat GLR3.3-GFP og GLR3.5-CFP lokaliserer seg ved plasmamembranen til en celle.

Figur 2. Subcellulær lokalisering av GLR3.3 og GLR3.5. Tomat GLRs-GFP ble forbigående samuttrykt med FLS2-mCherry (en plasmamembranlokaliseringsprodusent) i N. benthamiama-blader. GFP- og mCherry-signalene ble visualisert ved hjelp av konfokalmikroskopi 48 timer etter infiltrasjonen. Bar=25 µm.

3.3. GLR3.3 og GLR3.5 Funksjon i planteforsvar mot B. cinerea

For å undersøke rollen til GLR i planteimmunitet, ble CRISPR/Cas 9-mediert genredigerte tomat GLR3.3 eller GLR3.5 knockoutplanter og glr3.3/3.5 dobbeltmutanter infisert med B. cinerea. Resultatene viste at knockout av GLR33 og GLR3.5 resulterte i en åpenbar reduksjon i PSll, sammenlignet med WT-kontroll (Figur 3a,b). Følgelig økte akkumuleringen av B. cinerea-aktin-mRNA i blader betydelig (figur 3c) i glr3.3- eller glr3.5-mutantene.

I mellomtiden viste glr3.3/glr3.5-dobbeltmutantene mer demping i planteforsvar sammenlignet med glr3.3- og glr3.5-mutantene. Disse observasjonene antyder at GLR3.3 og GLR3.5 fungerer redundant for å etablere motstand mot B. Cameron. Videre spiller GLR3.3 hovedrollen, da glr3.3-mutanter var mer mottakelige for B. cinerea-inokulering enn glr3.5-mutanter. På dette grunnlaget ble GLR3.3 valgt for videre studier.

3.4. Gjenkjennelse av Glu og Gly av GLRs utløste elektrisk signalering i immunresponsen

Ettersom Glu eller Gly kan gjenkjennes av GLR for å utløse membrandepolarisering [33], bestemte vi Glu- eller Gly-indusert elektrisk signalering ved å overvåke effekten av Glu og Gly på membranpotensialet i tomatblader. Glu- og Gly-behandling fremkalte betydelige endringer i membranpotensial på kort tid, med en økning i amplituden på ca. 17–20 mV (Figur 4). Spesielt var endringen i membranpotensial indusert av Glu og Gly betydelig svekket i glr3.3-mutanter. Disse funnene tyder på at elektrisk signalering i tomatblader, indusert av Glu eller Gly, delvis er avhengig av GLR3.3.

Figur 3. Effekter av GLR3.3- og GLR3.5-redigering på planteforsvar mot B. cinerea-inokulering i tomat: (a) pseudofargebilder av tomatblader som viser pPSll ved 3 dpi; (b) kvantifisering av pPSllat 3 dpi; (c) transkripsjonsoverflod av B. cinerea-aktin i tomatblader inokulert med B. cinerea atl dpi. Resultatene i panel (b,c) er presentert som middelverdier - SD; n=4. Statistisk er signifikante forskjeller mellom behandlinger (p < 0.05, Tukeys test) vist med forskjellige bokstaver. Forsøkene beskrevet ovenfor ble utført tre ganger, med samme funn hver gang.

Figur 4. Glu eller Gly påvirker membranpotensialet til WT og glr3.3 blader: (a) typiske membranpotensialendringer i tomat WT eller glr3.3 mutantblader behandlet med Glu eller Gly; (b) kvantifisering av membranpotensialendringer av amplitude. Resultatene i panel (b) er presentert som gjennomsnittsverdier ± SD; n=4. Statistisk signifikante forskjeller mellom behandlinger (p < 0.05, Tukeys test) er vist Mock WT glr3.3 glr3.5 B. cinerea WT glr3.3/glr3.5 (b) (c) ) (a) WT pluss 2mM Glu WT pluss 2mM Gly glr3.3 pluss 2mM Gly glr3.3 pluss 2mM Glu WT pluss Kontrollløsning (a) (b) Figur 4. Glu eller Gly påvirker membranpotensialet til WT og glr3.3 blader: (a) typiske membranpotensialendringer i tomat WT eller glr3.3 mutante blader behandlet med Glu eller Gly; (b) kvantifisering av membranpotensialendringer av amplitude. Resultatene i panel (b) er presentert som gjennomsnittsverdier ± SD; n=4. Statistisk signifikante forskjeller mellom behandlinger (p < 0,05, Tukeys test) vises med forskjellige bokstaver. Forsøkene beskrevet ovenfor ble utført tre ganger, med samme funn hver gang.

Glr3.3-mutantene viste mer følsomhet overfor B. cinerea, noe som var i samsvar med reduksjonen i de Glu- eller Gly-induserte elektriske signalene. Basert på disse observasjonene antok vi at gjenkjennelsen av Glu og Gly av GLR er kritisk i immunitet mot B. cinerea. For å bekrefte denne hypotesen ble en farmakologisk analyse utført ved Glu- eller Gly-eksogen behandling. Før B. cinerea-inokulering ble WT-plantene og glr3.3-mutanten forbehandlet med Glu, Gly eller H2O (kontroll).

I WT-plantene ble den B. cinerea-inokulasjonsinduserte reduksjonen i ΦPSII og økningen i B. cinerea-aktin-mRNA-akkumulering betydelig lindret ved forbehandling med eksogen Glu eller Gly ved 3 dpi (figur 5). Imidlertid var sykdomssymptomer i glr3.3-mutanten mer alvorlige, og de gunstige effektene av Glu og Gly på motstanden mot B. cinerea ble betydelig redusert på grunn av knockouten av GLR3.3. Disse resultatene indikerer således at Glu- og Gly-indusert planteimmunitet mot B. cinerea delvis avhenger av GLR3.3.

Figur 5. Glu- eller Gly-indusert immunitet mot B. cinerea avhenger delvis av GLR3.3. Fire uker gamle tomatplanter ble behandlet med 20 mM Glu, 20 mM Gly eller vann én gang per dag i to dager før B. cinerea-inokulering: (a) pseudofargebilder av tomatblader som viser ΦPSII ved 3 dpi ; (b) kvantifisering av ΦPSII ved 3 dpi; (c) transkripsjonsoverflod av B. cinerea-aktin i tomatblader inokulert med B. cinerea ved 1 dpi. Resultatene i panelene (b,c) er presentert som gjennomsnittsverdier ± SD; n=4. Statistisk signifikante forskjeller mellom behandlinger (p < 0,05, Tukeys test) vises med forskjellige bokstaver. Forsøkene beskrevet ovenfor ble utført tre ganger, med samme funn hver gang.

4. Diskusjon

s er kationkanalproteiner som finnes i bakterier, planter og dyr. Hos dyr er GLR-er bevist å være involvert i nevrotransmisjon og immunregulering, og deres ligand Glu fungerer som et signalmiddel mellom de to systemene [34–36]. I planter spiller GLR en positiv rolle i immunitet mot biotisk stress [10,12,13]. Spesielt ble GLR-indusert forsvar mot RKN-er og insektbitt vist å være assosiert med elektriske signaler [3]. Forholdet mellom GLR-mediert soppsykdomsresistens og elektriske signaler er imidlertid ikke fullt ut underbygget. Her gir vi overbevisende bevis som viser at tomat GLR3.3- og GLR3.5-modulert planteimmunitet mot det typiske sopppatogenet B. cinerea er relatert til elektriske signaler.

I denne studien ble rollen til GLR i tomatfrøplanteimmunitet mot B. cinerea avduket for første gang. Anvendelsen av GLR-hemmeren DNQX økte følsomheten til tomatplanter for B. cinerea (figur 1). Dessuten svekket det å slå ut GLR3.3 eller GLR3.5 betydelig planteimmunitet, noe som førte til økte sykdomssymptomer i bladene (Figur 3). Disse funnene støtter oppfatningen om at tomatplanter krever GLR-er for å montere et tilstrekkelig forsvar mot det nekrotrofiske sopppatogenet B. cinerea. Selv om overekspresjon av reddik GluR hemmer veksten av B. cinerea [37], ble ingen av Arabidopsis glr-mutantene funnet å være mer følsomme for B. cinerea [12], noe som tyder på at funksjonen til GLR-er kan variere mellom arter. I denne studien viste glr3.3/glr3.5 dobbeltmutantene en mer sensitiv fenotype sammenlignet med enkeltmutanten glr3.3 og glr3.5. Disse funnene tyder på at GLR3.3 og GLR3.5 fungerer redundant. Spesielt antyder en sammenligning av fenotypene mellom glr3.3 og glr3.5 mutanter at GLR3.3 spiller hovedrollen i forsvaret mot B. cinerea.

Elektriske signaler er en rask respons involvert i GLR-mediert planteresistens mot biotisk stress. Her ble de elektriske signalene indusert av Glu eller Gly betydelig svekket i glr3.3-mutanter. Glu- eller Gly-behandling induserte membranpotensialet i kort tid. Imidlertid er variasjonen i amplitude betydelig redusert i glr3.3-mutanter (figur 4). Tilsvarende, i Arabidopsis, er generering og forplantning av elektriske signaler indusert av bladskade svekket i glr3.3 og glr3.6 mutanter [3]. Imidlertid manifesteres svekkelsen av sår-induserte overflatepotensialendringer i forkortelsen av varigheten, men amplituden forble den samme som WT i Arabidopsis glr3.3-mutanter etter sår på bladene. Disse forskjellene i resultater kan skyldes forskjeller i arter og behandlinger. I samsvar med resultatene våre, hemmer knockouten av GLR3.3 Glu-behandling-indusert membrandepolarisering i Arabidopsis-røtter [38]. Alle disse resultatene tyder på at de elektriske signalene indusert av Glu eller Gly delvis avhenger av GLR3.3.

Eksogen behandling med Glu induserer immunresponser mot flere sykdommer, slik som rissoppen Magnaporthe Oryza, den nekrotrofiske soppen Alternaria alternata i tomatfrukter og det jordbårne bakteriepatogenet Ralstonia solanacearum [39–41]. Sun et al. (2019) rapporterte at Glu-behandling øker motstanden til tomatfrukter mot B. cinerea [42]. I denne studien induserte eksogen behandling med Glu eller Gly immunitet mot B. cinerea i WT-planter; fordelene med denne behandlingen ble imidlertid betydelig hemmet i glr3.3-mutanten (figur 5). Dataene presentert her viste at GLR3.3 var nødvendig for Glu- eller Gly-indusert immunitet mot B. cinerea. Derfor antyder disse funnene at B. cinerea-resistensen indusert av Glu eller Gly er delvis avhengig av GLR3.3.

Basert på dataene som er gitt her, foreslår vi at GLR-er er involvert i forsvarsreaksjoner på B. cinerea gjennom elektriske signaler. Tatt i betraktning den fytohormonmedierte immuniteten, letter salisylsyresignalveien forsvaret mot biotrofiske og hemibiotrofe patogener, mens JA/etylen-signalveien fungerer mot nekrotrofiske patogener [43,44]. Et antagonistisk forhold mellom disse to banene er tydelig i mange plantepatosystemer [45,46].

GLR3.3 har imidlertid vist seg å positivt mediere motstanden mot det biotrofiske patogenet Pst DC3000, samtidig som det er essensielt for immunitet mot det nekrotrofiske patogenet B. cinerea. Vårt forslag er rimelig, da GLR3.3 kan gjenkjenne Glu, som anses å være en slags DAMP [6,47]. DAMP-er utløser tidlige sekundære signaler og induserer ekspresjonen av JA/etylen, et SA-signalforsvarsgen. Videre injiserer injeksjon av kunstig strøm inn i overflaten av stilken en betydelig økning i akkumulering av JA i planter [13].

Ved disse resultatene kan GLR3.3 spille en rolle i den tidlige fasen av planteresistens gjennom Glu- eller Gly-induserte elektriske signaler, som reagerer på sekunder eller minutter, oppstrøms for hormonsignalveien. JA-signalveien kan også aktiveres av elektriske signaler. I tillegg er det godt dokumentert at AtGLR3.3 deltar i planteresistens ved å mediere [Ca2 pluss ]cytvariasjon og oksidasjonsresponser [12]. Forholdet mellom disse banene og elektriske signaler i reguleringen av planteresistens mot B. cinerea krever videre undersøkelse.

5. Konklusjoner

Dataene som presenteres her viser at GLR3.3 og GLR3.5 spiller en positiv rolle i tomatplanteforsvaret mot det nekrotrofiske patogenet B. cinerea gjennom elektriske signaler. Vår studie gir ny innsikt i planteforsvarsmekanismen mot B. cinerea. Ikke desto mindre vil det være interessant å undersøke forholdet mellom flere signalveier indusert av GLR, som bidrar til planteimmunitet mot sopppatogener.

Forfatterbidrag:

Konseptualisering, SF, CP og KS; metodikk, KS; programvare, SF og PW; validering, SF, CP og KS; formell analyse, SF, CH og QM; etterforskning, SF, CP og SD; ressurser, KS; datakurering, SF og CP; skriving—original utkast utarbeidelse, SF og KS; skriving—gjennomgang og redigering, KS; tilsyn, KS; prosjektadministrasjon, KS; finansieringsanskaffelse, KS Alle forfattere har lest og samtykket til den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering:

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31772355, 32172650), Natural Science Foundation of Zhejiang Province for Distinguished Young Scholars (LR19C150001), Key Research and Development Program of Zhejiang Province (2021C02040), og Starry Night Science Fund ved Zhejiang University Shanghai Institute for Advanced Study (SN-ZJU-SIAS-0011).

Uttalelse fra institusjonell revisjonskomité:

Ikke aktuelt.

Erklæring om informert samtykke:

Ikke aktuelt.

Datatilgjengelighetserklæring:

Rådataene som støtter konklusjonene i denne artikkelen vil bli gjort tilgjengelig av forfatterne, uten unødig forbehold.

Anerkjennelser:

Forfatterne vil gjerne gi sin oppriktige takknemlighet til National Natural Science Foundation of China, Natural Science Foundation of Zhejiang Province, Key Research and Development Program of Zhejiang Province, og Starry Night Science Fund ved Zhejiang University Shanghai Institute for Advanced Studer for deres økonomiske støtte.

Interessekonflikter:

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Referanser

1. Gilroy, S.; Suzuki, N.; Miller, G.; Choi, WG; Toyota, M.; Devireddy, AR; Mittler, R. En flodbølge av signaler: Kalsium og ROS i forkant av rask systemisk signalering. Trender Plant Sci. 2014, 19, 623–630. [CrossRef]

2. Hedrich, R.; Salvador-Recatala, V.; Dreyer, I. Elektriske ledninger og langdistanseanleggskommunikasjon. Trender Plant Sci. 2016, 21, 376–387. [CrossRef]

3. Mousavi, SA; Chauvin, A.; Pascaud, F.; Kellenberger, S.; Farmer, EE Glutamatreseptorlignende gener medierer blad-til-blad sårsignalering. Natur 2013, 500, 422–426. [CrossRef]

4. Choi, WG; Miller, G.; Wallace, I.; Harper, J.; Mittler, R.; Gilroy, S. Orkestrere rask langdistansesignalering i anlegg med Ca2 pluss, ROS og elektriske signaler. Plant J. 2017, 90, 698–707. [CrossRef]

5. Marcec, MJ; Gilroy, S.; Poovaiah, BW; Tanaka, K. Gjensidig samspill av Ca2 pluss og ROS-signalering i planteimmunrespons. Plant Sci. 2019, 283, 343–354. [CrossRef]

6. Toyota, M.; Spencer, D.; Sawai-Toyota, S.; Jiaqi, W.; Zhang, T.; Koo, AJ; Howe, GA; Gilroy, S. Glutamat utløser langdistanse, kalsiumbasert planteforsvarssignalering. Science 2018, 361, 1112–1115. [CrossRef]

7. Wudick, MM; Michard, E.; Oliveira, NC; Feijo, JA Sammenligning av glutamatreseptorer fra planter og dyr: Vanlige egenskaper, men forskjellige skjebner? J. Exp. Bot. 2018, 69, 4151–4163. [CrossRef]

8. Ni, J.; Yu, Z.; Du, G.; Zhang, Y.; Taylor, JL; Shen, C.; Xu, J.; Liu, X.; Wang, Y.; Wu, Y. Heterologt uttrykk og funksjonell analyse av ris GLUTAMATE RESEPTOR-LIGNENDE familie indikerer dens rolle i glutamat utløst kalsium fluks i ris røtter. Rice 2016, 9, 9. [CrossRef] [PubMed]

9. Aouini, A.; Matsukura, C.; Ezura, H.; Asamizu, E. Karakterisering av 13 glutamatreseptorlignende gener kodet i tomatgenomet etter struktur, fylogeni og ekspresjonsprofiler. Gene 2012, 493, 36–43. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, F.; Wang, J.; Ma, C.; Zhao, Y.; Wang, Y.; Hasi, A.; Qi, Z. Glutamatreseptorlignende kanal3.3 er involvert i å formidle glutation-utløste cytosoliske kalsiumtransienter, transkripsjonelle endringer og medfødte immunitetsresponser i Arabidopsis. Plant Physiol. 2013, 162, 1497–1509. [CrossRef] [PubMed]

11. Nguyen, CT; Kurenda, A.; Stolz, S.; Chetelat, A.; Farmer, EE Identifikasjon av cellepopulasjoner som er nødvendige for blad-til-blad elektrisk signalering i en såret plante. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2018, 115, 10178–10183. [CrossRef]

12. Manzoor, H.; Kelloniemi, J.; Chiltz, A.; Wendehenne, D.; Pugin, A.; Poinssot, B.; Garcia-Brugger, A. Involvering av glutamatreseptoren AtGLR3.3 i planteforsvarssignalering og motstand mot Hyaloperonospora arabidopsidis. Plant J. 2013, 76, 466–480. [CrossRef] [PubMed]

13. Wang, G.; Hu, C.; Zhou, J.; Liu, Y.; Cai, J.; Pan, C.; Wang, Y.; Wu, X.; Shi, K.; Xia, X.; et al. Systemisk rot-skudd-signalering driver jasmonatbasert rotforsvar mot nematoder. Curr. Biol. 2019, 29, 3430–3438. [CrossRef] [PubMed]

14. Darwin, CR insektetende planter; John Murray: London, Storbritannia, 1875.

15. Burdon-Sanderson, JS Merknad om de elektriske fenomenene som følger med irritasjon av bladet til Dionæa muskulær. Proc. R. Soc. Lond. 1873, 21, 495–496.

16. Sukhova, E.; Akinchits, E.; Sukhov, V. Matematiske modeller av elektrisk aktivitet i planter. J. medlem. Biol. 2017, 250, 407–423. [CrossRef]

17. Li, JH; Vifte, LF; Zhao, DJ; Zhou, Q.; Yao, JP; Wang, ZY; Huang, L. Plant elektriske signaler: En tverrfaglig utfordring. J. Plant Physiol. 2021, 261, 153418. [CrossRef] [PubMed]

18. Garcia-Servin, MA; Mendoza-Sanchez, M.; Contreras-Medina, LM Elektriske signaler som mulighet for kommunikasjon med anlegg: En gjennomgang. Theor. Exp. Plant Physiol. 2021, 33, 125–139. [CrossRef]

19. Li, M.; Wang, F.; Li, S.; Yu, G.; Wang, L.; Li, Q.; Zhu, X.; Li, Z.; Yuan, L.; Liu, P. Importører driver blad-til-blad overføring av jasmonsyre i sår-indusert systemisk immunitet. Mol. Anlegg 2020, 13, 1485–1498. [CrossRef]

20. Farmer, EE; Gasperini, D.; Acosta, IF Klemcellehypotesen for aktivering av jasmonatsyntese som respons på sår. Ny Phytol. 2014, 204, 282–288. [CrossRef]

21. Ding, S.; Shao, X.; Li, J.; Ahammed, GJ; Yao, Y.; Ding, J.; Hu, Z.; Yu, J.; Shi, K. Nitrogenformer og metabolisme påvirker planteforsvaret mot blad- og rotpatogener i tomat. Plantecellemiljø. 2021, 44, 1596–1610. [CrossRef]

22. Li, X.; Yang, R.; Chen, H. Arabidopsis thaliana Mediator-underenheten MED8 regulerer planteimmunitet mot Botrytis Cinerea ved å samhandle med den grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktoren FAMA. PLoS ONE 2018, 13, e193458. [CrossRef]

23. Dean, R.; Van Kan, JA; Pretorius, ZA; Hammond-Kosack, KE; Di Pietro, A.; Spanu, PD; Rudd, JJ; Dickman, M.; Kahmann, R.; Ellis, J.; et al. Topp 10 sopppatogener i molekylær plantepatologi. Mol. Plant Pathol. 2012, 13, 414–430. [CrossRef]

24. Bai, Y.; Lindhout, P. Domestisering og avl av tomater: Hva har vi fått og hva kan vi få i fremtiden? Ann. Bot. 2007, 100, 1085–1094. [CrossRef] [PubMed]

25. Wang, X.; Zhou, X.; Cai, Z.; Guo, L.; Chen, X.; Chen, X.; Liu, J.; Feng, M.; Qiu, Y.; Zhang, Y.; et al. En biokontrollstamme av Pseudomonas aeruginosa CQ-40 fremmer vekst og kontrollerer Botrytis cinerea i tomat. Patogener 2020, 10, 22. [CrossRef]

26. Li, H.; Jiang, X.; Lv, X.; Ahammed, GJ; Guo, Z.; Qi, Z.; Yu, J.; Zhou, Y. Tomato GLR3.3 og GLR3.5 medierer kuldeakklimatisering-indusert kjølingstoleranse ved å regulere apoplastisk H2O2-produksjon og redokshomeostase. Plantecellemiljø. 2019, 42, 3326–3339. [CrossRef]

27. Hu, C.; Duan, S.; Zhou, J.; Yu, J. Kjennetegn på planteetende/sårutløst elektrisk signaloverføring i tomat. Front. Agric. Sci. Eng. 2021, 8, 292–301.

28. Zhang, H.; Hu, Z.; Lei, C.; Zheng, C.; Wang, J.; Shao, S.; Li, X.; Xia, X.; Cai, X.; Zhou, J.; et al. Et plantefytosulfokinpeptid initierer auxinavhengig immunitet gjennom cytosolisk Ca2 pluss-signalering i tomat. Plantecelle 2018, 30, 652–667. [CrossRef] [PubMed]

29. Zhang, S.; Li, X.; Sun, Z.; Shao, S.; Hu, L.; Ja, M.; Zhou, Y.; Xia, X.; Yu, J.; Shi, K. Antagonisme mellom fytohormonsignalering ligger til grunn for variasjonen i sykdomsfølsomhet hos tomatplanter under forhøyet CO2. J. Exp. Bot. 2015, 66, 1951–1963. [CrossRef]

30. Genty, B.; Briantais, JM; Baker, NR Forholdet mellom kvanteutbyttet av fotosyntetisk elektrontransport og slukking av klorofyllfluorescens. Biochim. Biofys. Acta 1989, 990, 87–92. [CrossRef]

31. Ma, Q.; Liu, Y.; Fang, H.; Wang, P.; Ahammed, GJ; Zai, W.; Shi, K. En essensiell rolle for mitokondriell alfa-ketoglutarat dehydrogenase E2 i den basale immunresponsen mot bakterielle patogener i tomat. Front. Plant Sci. 2020, 11, 579772. [CrossRef]

32. Liao, Y.; Tian, ​​M.; Zhang, H.; Li, X.; Wang, Y.; Xia, X.; Zhou, J.; Zhou, Y.; Yu, J.; Shi, K.; et al. Salisylsyrebinding av mitokondriell alfa-ketoglutarat dehydrogenase E2 påvirker mitokondriell oksidativ fosforylering og elektrontransportkjedekomponenter og spiller en rolle i basalt forsvar mot tobakksmosaikkvirus i tomater. Ny Phytol. 2015, 205, 1296–1307. [CrossRef]

33. Stephens, NR; Qi, Z.; Spalding, EP Glutamatreseptorundertyper bevist av forskjeller i desensibilisering og avhengighet av GLR3.3- og GLR3.4-genene. Plant Physiol. 2008, 146, 529–538. [CrossRef] [PubMed]

34. Boldyrev, AA; Carpenter, DO; Johnson, P. Nye bevis for en lignende rolle av glutamatreseptorer i nerve- og immunsystemet. J. Neurochem. 2005, 95, 913–918. [CrossRef]

35. Fazio, F.; Ulivieri, M.; Volpi, C.; Gargaro, M.; Fallarino, F. Målretting av metabotropiske glutamatreseptorer for behandling av nevroinflammasjon. Curr. Opin. Pharmacol. 2018, 38, 16–23. [CrossRef]

36. Ganor, Y.; Levite, M. Nevrotransmitteren glutamat og humane T-celler: Glutamatreseptorer og glutamat-induserte direkte og potente effekter på normale humane T-celler, kreft hos human leukemi og lymfom T-celler og autoimmune humane T-celler. J. Neural Transm. 2014, 121, 983–1006. [CrossRef] [PubMed]

37. Kang, S.; Kim, HB; Lee, H.; Choi, JY; Heu, S.; Å, CJ; Kwon, SI; En, CS-overuttrykk i Arabidopsis av en plasmamembran-målrettet glutamatreseptor fra liten reddik øker glutamatmediert Ca2 pluss tilstrømning og forsinker soppinfeksjon. Mol. Cells 2006, 21, 418–427.

38. Qi, Z.; Stephens, NR; Spalding, EP Kalsiuminngang mediert av GLR3.3, en Arabidopsis glutamatreseptor med en bred agonistprofil. Plant Physiol. 2006, 142, 963–971. [CrossRef]

39. Kadotani, N.; Akagi, A.; Takatsuji, H.; Miwa, T.; Igarashi, D. Eksogene proteinogene aminosyrer induserer systemisk motstand i ris. BMC Plant Biol. 2016, 16, 60. [CrossRef] [PubMed]

40. Seo, S.; Nakaho, K.; Hong, SW; Takahashi, H.; Shigemori, H.; Mitsuhara, I. L-Histidin induserer resistens i planter mot bakteriepatogenet Gastonia solanacearum delvis gjennom aktivering av etylensignalering. Plant Cell Physiol. 2016, 57, 1932–1942. [CrossRef]

41. Yang, J.; Sun, C.; Fu, D.; Yu, T. Test for L-glutamat-hemming av vekst av Alternaria alternata ved å indusere resistens i tomatfrukt. Food Chem. 2017, 230, 145–153. [CrossRef]

42. Sun, C.; Jin, L.; Cai, Y.; Huang, Y.; Zheng, X.; Yu, T. L-Glutamatbehandling øker sykdomsresistensen til tomatfrukter ved å indusere ekspresjonen av glutamatreseptorer og akkumulering av aminosyrer. Food Chem. 2019, 293, 263–270. [CrossRef]

43. Li, N.; Han, X.; Feng, D.; Yuan, D.; Huang, LJ Signalering av krysstale mellom salisylsyre og etylen/jasmonat i planteforsvar: Forstår vi hva de hvisker? Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 671. [CrossRef] [PubMed]

44. Farmer, EE; Gao, YQ; Lenzoni, G.; Wolfender, JL; Wu, Q. Sår- og mekanostimulerte elektriske signaler kontrollerer hormonresponser. Ny Phytol. 2020, 227, 1037–1050. [CrossRef] [PubMed]

45. Zhang, Y.; Sang, RF; Yuan, HM; Li, TT; Wang, LF; Lu, KK; Guo, JX; Liu, WC Overuttrykk av N-terminalen til CATALASE2 forbedrer plantesjasmonsyrebiosyntese og motstand mot nekrotrofisk patogen Botrytis cinerea B05.10. Mol. Plant Pathol. 2021, 22, 1226–1238. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Caarls, L.; Van der Does, D.; Hickman, R.; Jansen, W.; Verk, MC; Proietti, S.; Lorenzo, O.; Solano, R.; Pieterse, CM; Van Wees, SC Vurderer rollen til etylenresponsfaktor transkripsjonsrepressorer i salisylsyremediert undertrykkelse av jasmonsyreresponsive gener. Plant Cell Physiol. 2017, 58, 266–278. [CrossRef]

47. Tanaka, K.; Heil, M. Skade-assosierte molekylære mønstre (DAMPs) i plante medfødt immunitet: Anvendelse av faremodellen og evolusjonære perspektiver. Annu. Rev. Phytopathol. 2021, 59, 53–75. [CrossRef]

Shuxian Feng †, Caizhe Pan †, Shutting Ding, Qiaomei Ma, Chaoyi Hu, Ping Wang og Kai Shi *.

Institutt for hagebruk, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Kina; 21916054@zju.edu.cn (SF)

22016198@zju.edu.cn (CP); 3130100256@zju.edu.cn (SD); 11916060@zju.edu.cn (QM); cyhu@zju.edu.cn (CH); 11916061@zju.edu.cn (PW)

Korrespondanse: kaishi@zju.edu.cn; Tlf.: pluss 86-0571-88982383

Disse forfatterne har bidratt like mye til dette arbeidet.

For more information:1950477648nn@gmail.com