Induksjon av perifert trent immunitet i bukspyttkjertelen stimulerer antitumoraktivitet for å kontrollere progresjon av bukspyttkjertelkreft Del 2

Diskusjon

Mens handel med -glukan tidligere har vært karakterisert, er den spesifikke tropismen av -glukan til bukspyttkjertelen ikke tidligere rapportert37. Vi viser at partikkelformig -glukan kan trafikkere direkte inn i bukspyttkjertelen og kan også fagocyteres av makrofager som deretter trafikkerer inn i bukspyttkjertelen. Forholdet mellom peritonealhulen og bukspyttkjertelen er ikke godt definert, og studier knyttet til patofysiologien til akutt pankreatitt (AP) har identifisert at peritoneale makrofager er en hovedbidragsyter til den inflammatoriske responsen i AP, og støtter dermed en sammenheng mellom bukhinnen. og bukspyttkjertelen38.

Bildedataene våre viser faktisk at peritoneale makrofager som fagocyterer isotopmerket WGP primært trafikkerer bukspyttkjertelen. Studier på leverskade har ytterligere støttet denne modellen av en dynamisk utveksling av celler mellom bukhulen og faste organer som er uavhengig av sirkulasjonen 39. Sammen antyder dette at selv under homeostatiske forhold eksisterer det et basalt nivå av immuncelleutveksling mellom bukspyttkjertelen og bukhule som kan utnyttes i setting av partikkelformig -glukan.

Makrofager er en viktig del av det medfødte immunsystemet til menneskekroppen og har kraftige funksjoner for å identifisere, fagocytere og fjerne bakterier og fremmedstoffer. Periodontitt, en kronisk infeksjonssykdom preget av gingival betennelse og alveolært bentap, er den viktigste årsaken til tanntap hos voksne. Det er nå klart at vevsdestruksjonen av periodontitt er forårsaket av vertens immunrespons på infeksjon, og makrofager, som en viktig del av vertens immunrespons, spiller en viktig rolle i forekomsten og utviklingen av betennelse.

Derfor må vi forbedre immuniteten i vårt daglige liv. I vår forskning fant vi at Cistanche kan forbedre immuniteten. Å tilsette Cistanche i kokende vann for å lage Cistanche-te, og drikke den 1-2 ganger om dagen kan styrke kroppens immunforsvar fordi den inneholder aktive ingredienser, som polysakkarider, flavonoider, alkaloider, etc., som kan forbedre immunfunksjonen til kroppen. Samtidig kan tilsetning av Cistanche til suppe eller grøt, en eller to ganger i uken, forbedre immuniteten.

Klikk for å vite rent cistanche-produkt

Mens denne studien undersøkte partikkelformig -glukan WGP, kan det også være interessant å undersøke om løselig gjær-avledet -glukan viser en lignende tropisme og signalmekanisme i bukspyttkjertelen. Partikkelformede -glukaner er kjent for å signalisere direkte gjennom Dectin-1, mens løselige -glukaner antas å fungere gjennom en CR3-avhengig vei for å utøve sine antitumoregenskaper40,41. En studie viste at IP-administrering av løselig -glukan resulterte i handel til det perifere blodet og APC-er i bukhinnen, milten og benmargen, noe som indikerer at til tross for de forskjellige molekylære signalmekanismene, kan en lignende evne til å aktivere trent immunitet være mulig42. Men gitt at dataene våre indikerer at denne handelen er Dectin-1-avhengig, kan bare partikkelformig -glukan vise direkte trafikk til bukspyttkjertelen gjennom både partikkelformig og løselig kan initiere mekanismer for trent immunitet.

Videre viser tidligere studier som karakteriserer handel med intravenøst ​​injisert løselig -glukan handel til milt, nyre og lever, men nevner ikke tropisme til bukspyttkjertelen43. Siden bukspyttkjertelen ikke tidligere har vært antatt å være et mål for -glukanhandel, er det ikke klart om bukspyttkjertelen rett og slett aldri har blitt studert eller om bukspyttkjertelhandel ikke forekommer.

Fremtidige studier bør ta for seg biofordelingen av både løselig og partikkelformig glukan på tvers av ulike administreringsveier.

-Glukanhandel til bukspyttkjertelen har en multifaktoriell innvirkning på immunpopulasjonene i bukspyttkjertelen. For det første påvirker ankomst av glukan til bukspyttkjertelen direkte populasjonene av immunsuppressive M2-residente makrofager som er tilstede i bukspyttkjertelen, og som er kjent for å være viktige for å fremme bukspyttkjertelsvulster. CyTOF og scRNA-Seq-data viste en nesten fullstendig forsvinning av den bosatte makrofagpopulasjonen 7 dager etter WGP-administrasjon. Interessant nok faller forsvinningen av den fastboende makrofagpopulasjonen direkte sammen med et gjensidig utseende av en Ly6Clo makrofagpopulasjon. Denne Ly6Clo-makrofagpopulasjonen har lignende fenotypiske markører som den fastboende befolkningen, men skjev mer mot en M1-fenotype.

Det er derfor sannsynlig at fastboende makrofager kommer i kontakt med -glukan som har transportert til bukspyttkjertelen og disse cellene blir repolariserte, og får derfor en annen cellulær fenotype som resulterer i dannelsen av en unik klynge. For det andre resulterer ankomsten av -glukan til bukspyttkjertelen i amplifisert kjemokin/kjemokinreseptorsignalering som rekrutterer pro-inflammatoriske Ly6CHi-infiltrerende monocyttavledede makrofager fra periferien til bukspyttkjertelen. Tjuefire timer etter administrering av WGP, er CCL2-nivåer i hele bukspyttkjertellysater funnet å være 30- ganger økt. Følgelig viser vi at den robuste -glukanavhengige cellulære tilstrømningen til bukspyttkjertelen er avhengig av CCR2.

Mens vi fokuserer på dynamikken til myeloidrommet på grunn av den observerte betydningen av CCR2/CCL2-signalering, var det en interessant første forbedring av klynge 11 på dag 3 og deretter forsvinning på dag 7 etter WGP-behandling. Klynge 11 ble karakterisert som ILC2s basert på uttrykket av flere markører som KLRG1, IL-5, IL-13 og ICOS. ILC2 er kjent for å være langsiktige vevsresidente celler44. Nyere studier har vist at aktivering av lokale ILC2-er av vevsspesifikke alarminer induserer deres spredning, lymfeknutemigrasjon og blodspredning. ILC2 fra flere vev, som tarm og lunge, har vist seg å komme inn i blodet ved ekstrudering fra disse forstyrrede vevene og migrere til andre vev som leveren44–46.

En slik mekanisme kan forklare den første økningen og deretter forsvinningen av ILC2s i bukspyttkjertelen. Gitt at ILC2-er nylig har blitt implisert i responsen til bukspyttkjertelsvulster på immunterapi47, er mer forskning berettiget som undersøker virkningen av WGP og initiering av trent immunitet på ILC2-populasjonen i bukspyttkjertelen.

Selv om initiering av en tilstrømning av pro-inflammatoriske immunceller til bukspyttkjertelen i seg selv er viktig, er det de CCR2 pluss Ly6CHi infiltrerende monocyttavledede makrofagpopulasjonene fra periferien som viser trekk ved trent immunitet som bærer de viktigste implikasjonene som induksjon av perifert trent immunitet i bukspyttkjertelen har ennå ikke blitt karakterisert. Denne induserte trente immuniteten er også assosiert med metabolsk og epigenetisk omprogrammering.

Mens CCR2 er kjent for å være en viktig reseptor i rekruttering av monocytter, er dette også den første indikasjonen på at CCR2-signalering på monocytter er nødvendig for etablering av perifert trent immunitet. Det bemerkes at CCR2 pluss monocytter/makrofager har vært knyttet til tumormetastase og progresjon48,49. Imidlertid tyder våre data på at rekruttering av omprogrammert, trent CCR2 pluss monocytter/makrofager utøver robuste antitumoreffekter.

Dette er direkte demonstrert av vårt admix-eksperiment der mus som mottok CCR2 pluss myeloidceller fra WGP-trente mus, viste en betydelig redusert tumorbyrde sammenlignet med mus som mottok CCR2- myeloidceller fra den samme trente musen.

Ettersom vi viser at perifert trent immunitet er etablert i bukspyttkjertelen, spør vi om disse cellene kan reaktiveres av tumorceller eller deres utskilte faktorer. Re-eksponering av in vivo WGP-trente bukspyttkjertelmyeloidceller til tumorkondisjonerte medier ble vist å fremkalle en trent respons kraftig. Kalafati et al. viste nylig en rolle for granulocytter i trente immunitetsdrevne antitumormekanismer21, men gitt deres bruk av subkutane kreftmodeller, er den nå rapporterte studien det første tilfellet som antyder at myeloide celler i et spesifikt organ kan trenes til å reagere direkte på tumorceller fra det samme organet.

Det er godt etablert at myeloidceller er i stand til direkte å drepe tumorceller gjennom mekanismer for fagocytose og ROS-produksjon50–54, og her viser vi at WGP-trening signifikant oppregulerer de direkte antitumorfunksjonene til forbedret fagocytose av tumorceller og ROS-mediert cytotoksisitet til tumorceller.

Videre, mens vi fremhever at tumorkondisjonerte medier kan reaktivere trente myeloidceller, identifiserer vi også en spesifikk faktor, MIF, i tumorkondisjonerte media som er involvert i denne aktiveringen. Disse dataene tyder på at induksjon av trent immunitet kan delta i mekanismer for tumorimmunovervåking. For eksempel, i de tidlige stadiene av tumorutvikling, utskiller svulster løselige faktorer som kan re-stimulere trente medfødte celler som fører til utryddelse av disse tumorcellene.

Vi oversetter deretter denne forståelsen av antitumorpotensialet til de trente medfødte myeloidcellene som kommer inn i bukspyttkjertelen til ortotopiske modeller av PDAC, der vi observerer en dramatisk reduksjon i svulstbelastningen og en økning i overlevelsen til mus gitt kun én administrering av WGP. Vi viser videre at cellene som er ansvarlige for svulstkontroll hovedsakelig er trent CCR2 pluss myeloid-avledede celler. I motsetning til andre foreslåtte modeller for svulstkontroll som ser ut til å være helt drevet av induksjon av sentralt trent immunitet i BM21, i denne modellen trente i stedet den tidlige handelen med WGP til bukspyttkjertelen og den resulterende produksjonen av CCL2 i bukspyttkjertelen rekrutter. CCR2 pluss myeloidceller fra periferien som hovedsakelig er ansvarlige for antitumoreffektene. WGP direkte trafikk til bukspyttkjertelen repolariserer også M2-lignende vevsresidente makrofager mot M1-lignende makrofager som også kan begrense tumorprogresjon.

Mens tumorreduksjonen observert hos mus implantert med KPC-svulster som hadde blitt blandet med CCR2 pluss trente celler var signifikant, var den ikke så slående som hos mus som fikk IP WGP. Dette støtter at antitumoreffektene av IP WGP er todelt; rekruttering av CCR2 pluss trente anti-tumor myeloidceller til bukspyttkjertelen og repolarisering av pro-tumorigeniske residente makrofager samarbeider for å fremkalle anti-tumor medfødte responser som fører til redusert tumorbyrde i modeller av PDAC.

Vi legger også merke til det høye uttrykket av MHCII på disse trente monocyttene/makrofagene, som sannsynligvis spiller en rolle i tumorantigenprosessering og kommunikasjon med T-celler for å fremkalle adaptive immunresponser mot svulsten. Interessant nok, mens vi bekreftet at disse antitumormekanismene ikke er avhengige av adaptive immunresponser, observerte vi en betydelig økning i CD8 pluss T-celler tilstede i CCR2 pluss blandede svulster. I tillegg, gitt at myeloide celler i svulstene ble observert å vise høye nivåer av PD-L1 og at tilstedeværelsen av trente CCR2 pluss celler i bukspyttkjertelen så ut til å rekruttere CD8 pluss T-celler, begrunnet vi at WGP kan potensere effekten av anti -PD-L1 terapi.

I litteraturen hadde anti-PD-L1 mAb-terapi alene ingen overlevelsesgevinst mens kombinasjonen av WGP og anti-PD-L1 synergiserte for å gi bedre overlevelsesresultater enn WGP alene55. Dette antyder at trente medfødte immunceller kan aktivere adaptive immunceller i TME, men det immunsuppressive mikromiljøet må sannsynligvis overvinnes ytterligere av de samtidige effektene av anti-PD-L1. Viktigere, til tross for forbedret overlevelse, bukket alle mus til slutt etter for svulsten, så fremtidige undersøkelser av optimalisering av denne behandlingen når det gjelder dosering og antall behandlinger er berettiget.

Immunsuppressive myeloidceller spiller en kritisk rolle i dannelsen av den immunsuppressive TME i PDAC. Her demonstrerer vi en evne til å engasjere disse myeloidcellene i innstillingen av PDAC gjennom induksjon av trent medfødt immunitet i bukspyttkjertelen.

Viktigere, vi viser også at evnen til å sette i gang trent immunitet i bukspyttkjertelen potenserer de terapeutiske effektene av immunterapi som anti-PD-L1 immunkontrollpunktblokkadeterapi. For å gi ytterligere klinisk anvendelighet til disse funnene, viser vi også at induksjon av trent immunitet i adjuvant-innstillingen kan redusere tumorstørrelse og forlenge overlevelse. Disse funnene understreker potensialet ved å bruke -glukan for å terapeutisk målrette myeloidceller i TME og fremhever at induksjon av perifert trent immunitet i bukspyttkjertelen kan spille en konsekvensrolle i omprogrammering av den undertrykkende TME av PDAC, noe som kan føre til å forlenge pasientens levetid. diagnostisert med denne dødelige maligniteten.

Metoder

Etisk utsagn.

Alle eksperimenter som involverte dyr ble utført i henhold til de etiske retningslinjene satt av University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee. Eksperimenter ble utført i henhold til de godkjente protokollene 19471 og 19536.

Mus.

Seks til åtte uker gamle hann- og hunnmus ble brukt i alle forsøk. Villtype (WT) C57BL/6 J-mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) eller oppdrettet i University of Louisville-spesifikke patogenfrie (SPF) dyreanlegg. C57BL/6 Dectin-1 knockout-mus (Dectin-1-/−) ble beskrevet tidligere56. CCR2 globale knockout-mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory. Albino C57BL/6 mus ble vennlig levert av Dr. Jonathan Warawa ved University of Louisville. NOD/SCID/IL2r Null (NSG) mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory. Maksimal tumorstørrelse tillatt av IUCAC var ikke mer enn 2000 mm3. Mus ble overvåket daglig for tumorvekst og avlivet når tumorbelastningen oversteg den begrensede størrelsen. Musene ble holdt på en 12-t mørk/lys-syklus ved romtemperatur med kontrollert fuktighet (rundt 55 prosent).

Alle dyrene ble holdt i et barriereanlegg og kun friske mus ble brukt til eksperimenter. Alle mus var minst 6 uker gamle på oss, og alle eksperimenter som involverte dyr ble utført i samsvar med alle relevante lover og institusjonelle retningslinjer gitt av Rodent Rearing Facility (RRF) og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Louisville.

Fremstilling av -glukan.

Høyrenset partikkelformig -glukan i form av partikkelformede helglukanpartikler (WGP) isolert fra Saccharomyces cerevisiae ble levert av Biothera. Før bruk ble WGP forsiktig sonikert i 15 s, to ganger ved bruk av en Qsonica Q55-110 Q55 Sonicator (Cole-Parmer) for å sikre at aggregater ble brutt opp.

Utarbeidelse og bruk av DTAF-WGP.

DTAF (Sigma-Aldrich) ved 2 mg/ml ble blandet med en suspensjon av 20 mg/ml WGP i boratbuffer (pH 10,8). Dette ble inkubert ved romtemperatur i 8 timer med kontinuerlig blanding. Etter inkubering ble WGP sentrifugert og vasket med kald steril endotoksinfri DPBS (Sigma-Aldrich) fem ganger eller inntil supernatanten ikke lenger inneholdt synlig DTAF. Konsentrasjonen ble justert til 10 mg/ml i endotoksinfri DPBS for lagring. Omtrent 1 mg av DTAF-WGP har injisert IP i C57BL/6 og Dectin-1-/− mus og organer ble høstet 3 dager senere.

Klargjøring av 89Zr-WGP.

WGP (100 mg) ble blandet med DeferoxamineSCN (2,7 mg, i 0,8 ml DMSO) og suspendert i 10 ml natriumkarbonatbuffer (0,1 M, pH 9,4) over natten ved romtemperatur i mørket med forsiktig risting. Deferoxamine-merket WGP ble deretter vasket med DI-vann (10 × 40 ml), og 30 mg Deferoxamine-merket WGP ble blandet med 3 mCi 89Zr-oksalat i 2 ml Tris•HCl-buffer (0,5 M, pH 7,5), og deretter inkubert ved 37 oC i 60 minutter med risting. 89Zr-WGP ble deretter sentrifugert og vasket med 3 ml steril PBS. Radioaktiviteten til 89Zr-WGP ble målt med en dosekalibrator og brukt til in vitro og in vivo studier.

Biodistribusjon og PET/CT-skanning ved bruk av 89Zr-WGP.

Positron Emission tomography (PET)/computertomografi (CT) avbildning ble utført i C57BL/6 og Dectin-1-/− mus 48 timer etter IP-injeksjon av 1 mg ren 89Zr-WGP eller injeksjon av 1 × 106 peritoneal makrofager som var blitt dyrket sammen med 25 ug/ml 89Zr-WGP i 2 timer og deretter forsiktig vasket for å fjerne overflødig 89Zr-WGP. Musene ble skannet i 15 minutter med en Siemens R4 MicroPET etterfulgt av 10 minutter med CT-skanning. Siemens IAW-programvare ble brukt til innhenting og rekonstruksjon av PET-signalet, og Siemens IRW-programvare ble brukt til å slå sammen og analysere bildedataene.

På slutten av avbildningsstudien ble mus avlivet, og organer av interesse ble høstet. For biodistribusjon ble 50 uL perifert blod samlet ved bruk av en retro-bulbar blødningsteknikk. Hjernen, hjertet, lungene, leveren, milten, nyrene, bukspyttkjertelen, tykktarmen, tynntarmen, magen, femur, et stykke hud fra flanken til musene og rectus femoris muskelen ble høstet, veid og plassert i en 2470 Wizard automatisk gammateller (PerkinElmer) for å måle radioaktiviteten til hvert vev. CPM-verdiene ble beregnet ved bruk av Prism-programvare (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Behandling av bukspyttkjertelen.

Etter avliving ble musebukspyttkjertelen høstet og forsiktig kuttet i mindre biter ved hjelp av steril saks. De ble suspendert i et 15 ml rør i komplett medium (RPMI) med 1X fordøyelsesbuffer bestående av 300 U/ml kollagenase I, 60 U/ml Hyaluronidase og 80 U/ml DNase (Sigma). Disse ble plassert i en roterende inkubator ved 37 grader med 5 prosent CO2 i 15–20 min. Fordøyelsesbufferen ble deretter stoppet med iskald komplett RPMI 1640 og vasket. Celler ble ført gjennom et sterilt nylon 40 µm kurvfilter og små ufordøyde vevsbiter ble knust ved å bruke en steril sprøytestopper for å generere en enkeltcellesuspensjon. Hvis det ble sett et betydelig antall røde blodlegemer (RBC) i prøven, ble RBC-lyse utført ved å tilsette 2 mL steril 10x ACK (Thermo Fisher Scientific).

In vivo WGP-administrasjon.

Mus ble gitt en enkelt 1 mg intraperitoneal dose av forsiktig sonikert WGP, 3 μm polystyrenkuler (Sigma-Aldrich) eller 3 μm fluorescerende mikrosfærer (Polysciences) (alle 1 mg i 2 00 ul av steril PBS) eller 200 ul steril PBS på dag 0. For typisk trente immunitetsstudier, 7 dager etter den første IP-dosen, ble mus avlivet ved bruk av CO2, og bukspyttkjertelen sammen med annet vev av interesse ble fjernet og behandlet. For dosetitreringsstudier ble 0,5, 1 og 2 mg WGP levert IP i 200 uL steril PBS. For tidstitreringsstudier ble mus injisert med 1 mg WGP, og bukspyttkjertelen ble høstet etter 24 timer, 48 timer, 3, 7, 10, 16 og 30 dager senere.

Ex vivo restimulering.

For å vurdere den trente fenotypen av mononukleære celler i mus behandlet med WGP eller PBS ex vivo, etter prosessering av bukspyttkjertelen, ble bukspyttkjertelcellesuspensjoner sådd ut i 24-brønners plater og stimulert med LPS (10 ng/ml), supernatanten fra dyrket KPC og Pan02 celler (40 prosent), og rekombinant MIF (rMIF) (10 ng/ml). MIF var en sjenerøs gave fra Dr. Robert Mitchell ved University of Louisville og ble prokaryot alliert uttrykt, renset og refoldet som beskrevet tidligere57. Celler ble dyrket i DMEM og inkubert ved 37 grader med 5 prosent CO2 i 5–6 timer i nærvær av 1X brefeldin A (BioLegend). Cellene ble deretter høstet ved bruk av en celleskraper, vasket, pelletert og deretter farget for intracellulær cytokinekspresjon.

In vitro trening og restimuleringsanalyse.

Peritoneale makrofager eller sorterte CD11b pluss-celler fra en musebukspyttkjertel ble belagt i en 24-brønnplate i 2 timer ved 37 grader og 5 prosent CO2 for å tillate festing av celler til platene, hvoretter de flytende cellene ble forsiktig aspirert. De festede cellene ble forsiktig vasket med steril PBS og deretter resuspendert i 1 ml DMEM bestående av 10 prosent FBS og 1 prosent penicillin/streptomycin.

For den første treningen av celler ble 25 ug/ml partikkelformig WGP, 25 ug/ml 3 μm polystyren-mikropartikkelkuler (Sigma-Aldrich) eller 100 μL PBS tilsatt til den passende brønnen og inkubert i 24 timer. Etter 24 timer ble brønnene forsiktig vasket for å fjerne den første stimulansen og frisk DMEM ble tilsatt og cellene ble inkubert med 5 prosent CO2 ved 37 grader i 7 dager. Etter 7 dager ble mediet aspirert og erstattet med ferskt medium, og cellene ble restimulert med LPS (100 ng/ml), supernatanten av KPC- eller Pan02-celler (40 prosent), eller PBS som kontroll. Tjuefire timer etter stimulering ble supernatantene høstet og brukt i en ELISA for TNF- og IL-6.

Tumorkondisjonerte medier.

Omtrent 1 × 106 KPC- eller Pan02-celler ble dyrket i en seks-brønns plate i 4 mL komplett DMEM ved 37 grader og 5 prosent CO2. Etter 3 dager ble supernatantene høstet og lagret ved -80 grader i alikvoter for bruk som et tumorkondisjonert medium. Som en kontroll ble bukspyttkjertelen til en C57BL/6-mus behandlet til en enkeltcellesuspensjon og 1 × 106 av disse cellene ble dyrket i en seks-brønns plate i 4 mL komplett DMEM og ved 37 grader og 5 prosent CO2, og supernatanter ble også samlet etter 3 dager. Som en kontroll ble bukspyttkjertelen til naive mus behandlet til en enkeltcellesuspensjon og belagt i en seks-brønns plate i 1 dag. Ikke-adherente celler ble vasket bort og disse cellene ble deretter dyrket i 3 dager og supernatanten ble høstet.

Anskaffelse av peritoneale makrofager.

Mus ble avlivet og 5 mL steril RPMI ble injisert i bukhinnen ved hjelp av en 25-målersprøyte. Magen ble massert for å frigjøre de peritoneale makrofagene. Et lite snitt ble laget og en overføringspipette ble brukt for å fjerne suspensjonen. Peritonealhulen ble deretter vasket flere ganger med kald RPMI og cellene ble pelletert ved 458 × g.

Flowcytometri.

Enkeltcellesuspensjoner i PBS med 1 prosent FBS ble blokkert med murin Fc Block (anti-CD16/CD32) ved 4 grader i 15 minutter. Fluorokrommerkede antistoffer for levedyktighet (APC/Cy7) og mot overflatemarkører CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend) og CCR2 (FoU-systemer) var brukt. Informasjonen relatert til alle flow Abs er oppsummert i tilleggstabell 3. Etter 30 min med inkubering i mørket ved 4 grader ble cellene vasket med kald PBS og filtrert gjennom et 40 µm mesh filter. Prøvene ble tatt med et FACSCanto II cytometer (BD Biosciences) og analysert ved bruk av FlowJo-programvare (Tree Star, Ashland, OR). FACSDiva programvareversjon 6 ble brukt i FACSCanto for å innhente alle data.

intracellulær farging for ekspresjon av cytokiner.

Etter stimulering ble cellene farget for de ønskede overflatemarkørene som beskrevet ovenfor. Cellene ble deretter vasket med kald PBS, og 500 ul fikseringsbuffer (Biolegend) ble tilsatt til rørene, vortexet kort og inkubert i mørket ved romtemperatur i 20 minutter. Omtrent 1 ml permeabiliseringsbuffer (Biolegend) ble deretter tilsatt og prøvene ble sentrifugert ved 458 × g i 5 minutter ved 4 grader etterfulgt av en vask til med 1 ml permeabiliseringsbuffer. Celler ble resuspendert i 200 ul permeabiliseringsbuffer og cellene ble farget med antistoffer mot TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6 og IFN eller den respektive isotypekontrollen over natten ved 4 grader. Cellene ble deretter vasket, filtrert, og data ble innhentet ved bruk av et flowcytometer.

FACS-isolering av CD11b pluss makrofager for in vitro-trening.

Bukspyttkjertelen ble behandlet til en enkeltcellesuspensjon som beskrevet ovenfor. Celler ble vasket med 1 ml PBS og inkubert med Fc-blokk i 10 minutter ved 4 grader etterfulgt av farging med levedyktighetsfargestoff (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5) og CD11b pluss (APC) i 30 minutter ved 4 grader. Celler ble vasket med PBS og resuspendert i kald MACS Running Buffer (Miltenyi Biotech). ViabilityCD45 pluss CD11b pluss-celler ble sortert ved å bruke en FACS Aria III (BD Biosciences). Celler ble samlet i 50 prosent FBS, 40 prosent PBS og 10 prosent HEPES (Corning). Etter sortering ble cellene vasket med PBS og deretter belagt for in vitro trening, som beskrevet ovenfor.

ELISA.

Supernatanter fra in vitro-trente celler sammen med standarder ble analysert ved bruk av murine TNF- og IL-6 ELISA-sett (BioLegend). Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner og alle betingelser ble utført i tre eksemplarer. Et ELISA-sett for rMIF (R- og D-systemer) ble også brukt i henhold til produsentens instruksjoner for å kvantifisere rMIF i Pan02 og KPC tumorkondisjonerte medier og supernatanten fra dyrkede ubehandlede pankreasceller. For å kvantifisere histonmodifikasjoner, ble ELISA-sett (Tri-methylhistone H3K4 kvantifiseringssett, Acetyl-histone H3K27 kvantifiseringssett, Tri-methylhistone H3K27 kvantifiseringssett og totalt histon H3 kvantifiseringssett) kjøpt fra EpiGentek og analyser ble utført basert på produsentens analyser. bruksanvisning. Laktat ble målt ved hjelp av L-Lactate-analysesett I (Eton Bioscience).

Western blot-analyse.

CD11b pluss-celler fra PBS-injiserte eller WGP-injiserte mus (24 timer) ble separert ved bruk av CD11b-mikrokuler (Miltenyi Biotech). Histon ble ekstrahert i henhold til produsentens instruksjoner (Active Motif, Inc.), og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Bradford-kvantifisering. Histonproteiner ble separert med SDS-PAGE 15 prosent Tris-HCl-geler og overført til PVDF-membraner (Millipore). Membranen ble blokkert med 5 prosent BSA ved romtemperatur i 1 time og inkubert over natten ved 4 grader med primære antistoffer inkludert tri-metyl-histon H3 (lys4) kanin mAb, acetyl-histon H3 (lys27) XP kanin mAb, tri-metyl -histone H3 (Lys27) kanin mAb og histon H3 XP kanin mAb (cellesignalteknologi), deretter inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoffer (GE Healthcare) ved romtemperatur i 1 time. Membranen ble utviklet med Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) og oppdaget gjennom medisinsk filmprosessor (Konica Minolta Medical & Graphic). Precision Plus Protein Kaleidoscope Pretained Protein Standards ble brukt som en standard proteinmarkør (Bio-Rad).

QRT-PCR.

Etter at CD11b pluss-celler var blitt isolert fra musebukspyttkjertelen i WGP-behandlede og ubehandlede mus, ble celler lagret i TRIzol. RNA ble isolert og revers transkribert ved å bruke TaqMan Reverse Transcription Reagents (qRTPCR) amplifikasjon ved bruk av Bio-Rad MyiQ enfarget RT-PCR deteksjonssystem. Kort fortalt ble cDNA amplifisert i en 25 uL reaksjonsblanding bestående av SYBR Green PCR-supermiks (Bio-Rad), 100 ng komplementær DNA-template og utvalgte primere (200 nM) ved bruk av de anbefalte syklusbetingelsene.

H pluss E.

Syv dager etter injeksjon med PBS/mikropartikkelkuler eller WGP, ble bukspyttkjertelen høstet og fiksert i 4 prosent formalin i 1 uke etterfulgt av innleiring i parafin i henhold til standardprosedyrer. Parafininnstøpt vev ble kuttet i 5 mm tykke seksjoner og farget med hematoksylin og eosin (H & E) for morfologisk analyse.

Serum amylase måling.

Murin serumamylase ble målt ved å bruke Amylase Activity Assay Kit (Millipore Sigma) og ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt, mus ble injisert med WGP og 7 dager senere ble blod samlet fra mus ved bruk av en retro-bulbar blødningsteknikk. Disse prøvene ble brukt til å analysere for serumamylase.

In vivo T-celle utarming.

T-celler ble utarmet ved å bruke en anti-CD4 mAb alene, antiCD8 mAb alene, eller anti-CD4 og anti-CD8 mAb sammen. Antistoffer ble laget internt. I denne uttømmingsprosedyren har mus injisert IP med WGP på dag 1 og ble også injisert IP med 200 µg av mAbs på dag 1 og dag 4 i løpet av behandlingsperioden. Mus ble avlivet på dag 7. (CD4-klon GK1.5, CD8-klon 53-6.72). Uttømmingseffektiviteten ble bekreftet på dag 7.

In vivo utarming av NK-celler.

NK-celler ble utarmet gjennom den intraperitoneale injeksjonen av 100 µg PK136 mAb (produsert i laboratoriet til Dr. Jun Yan ved University of Louisville) på dagene -1 og 5 i løpet av behandlingsperioden. WGP ble injisert på dag 0 og dag 7 dyr ble avlivet og uttømmingseffektiviteten til NK-celler ble vurdert ved å farge bukspyttkjertelvev for NK1.1.

Ly6G uttømming.

Nøytrofiler ble utarmet ved å injisere 300 µg anti-Ly6G mAb (Bio X Cell) eller isotypekontrollrotte-IgG2a (Bio X Cell) på dagene -1, 2 og 6 under behandlingen. Omtrent 1 mg WGP injisert IP på dag 1. Mus ble avlivet på dag 7 og bukspyttkjertelen ble vurdert for effektivitet av uttømming. I svulsten ble modellmus injisert med 300 µg anti-Ly6G mAb eller isotypekontrollrotte-IgG2a på dagene -2, 4, 10 og 16. Musene ble gitt WGP på dag 0 og ble implantert med ortotopiske KPC-bukspyttkjertelsvulster på dagen 7. Mus ble avlivet på dag 21 og bukspyttkjertelvev ble farget med Ly6G for å vurdere granulocyttutarmingseffektiviteten på det tidspunktet.

CyTOF massecytometri prøvepreparering.

Massecytometriantistoffer ble enten kjøpt fra Fluidigm eller ble laget internt ved å konjugere kommersielt tilgjengelige rensede antistoffer til den passende metallisotopen ved å bruke MaxPar X8 Polymer eller MCP9 Polymer-sett (Fluidigm). Bukspyttkjertelprøver fra tre PBS- og tre 7-dagers WGP-mus ble behandlet til en enkeltcelleløsning og ex vivo-stimulering ble utført som beskrevet ovenfor. Celler ble forsiktig skrapet fra platene ved bruk av en steril celleskraper, vasket med PBS og plassert i et sterilt kulturrør. Omtrent 2 × 106 celler per prøve ble brukt. Celler ble først farget for levedyktighet med 5 uM cisplatin (Fluidigm) i serumfri RPMI 1640 i 5 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter vasket med RPMI 1640 inneholdende 10 prosent FBS i 5 minutter ved 300 x g. Celler ble farget med overflateantistoffene i 30 minutter ved romtemperatur og vasket to ganger med Maxpar Cell-fargebuffer (Fluidigm).

For farging på intracellulære cytokiner ble cellene deretter fiksert med 1 mL 1X Maxpar Fix I-buffer i 30 minutter ved romtemperatur og deretter vasket to ganger med 2 mL 1X Maxpar Perm-S-buffer i 5 minutter ved 800 × g. Den cytoplasmatiske/utskilte antistoffcocktailen ble deretter tilsatt og inkubert med cellene i 30 minutter ved romtemperatur. Etter inkubering ble cellene vasket med 1 ml 1X Maxpar Perm-S buffer i 5 minutter ved 800 × g og forsiktig blottet for å fjerne all væske fra røret.

For å farge for kjernefysiske antigener ble cellene deretter suspendert i 1 ml 1X Maxpar kjernefysisk antigenfargingsbuffer i 30 minutter ved romtemperatur. Den nukleære antigen-antistoffcocktailen ble deretter tilsatt og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Celler ble vasket to ganger i 5 minutter ved 800 x g med 2 ml Nuclear Antigen Staining Permeability buffer. Til slutt ble cellene fiksert med 1,6 prosent formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, deretter inkubert over natten i 125 nM IntercalatorIridium (Fluidigm) ved 4 grader.

CyTOF datainnsamling.

Når cellene var klare for anskaffelse, ble prøvene vasket to ganger med Cell Staining Buffer (Fluidigm) og holdt på is mens de ventet på anskaffelse. Rett før anskaffelsen ble cellene suspendert i en 1:9-løsning av Cell Acquisition Solution: EQ 4 element kalibreringsperler (Fluidigm). Et Helios CyTOF-system ble brukt, og etter riktige oppstarts- og innstillingsprosedyrer ble prøver kjørt med en hastighet på mindre enn eller lik 500 hendelser/sekund opptil 300,000 hendelser. Ved å bruke CyTOF-programvaren ble FCS-filer normalisert.FCS-filer og disse filene var så klare for dataanalyse.

CyTOF dataanalyse.

CyTOF-data ble analysert ved hjelp av FlowJo, CytoBank-programvarepakken58 og CyTOF-arbeidsflyten59 som inkluderer en pakke med pakker tilgjengelig i R (r-project.org)60–63. For analyser utført innenfor CyTOF-arbeidsflyten, ble FlowJo-arbeidsområdefiler eksportert fra Flow Workspace og CytoML brukt61.

RNA-sekvensering: RNA-ekstraksjon og isolasjon.

Syv dager etter administrering av PBS eller WGP IP ble bukspyttkjertelen høstet, behandlet til en enkeltcellesuspensjon, farget for levedyktighet, CD45 og CD11b, og sortert ved bruk av en FACS Aria III. Prøver ble fremstilt i tre eksemplarer for hver forsøksgruppe. Når disse myeloide cellene var isolert, ble cellene vasket 2x med iskald PBS og deretter lysert med Trizol (Invitrogen). RNA ble ekstrahert ved å bruke et QIAGEN RNAeasy Kit (QIAGEN).

Det isolerte RNA ble kontrollert for integritet ved bruk av Agilent Bioanalyzer 2100-systemet (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og kvantifisert ved bruk av en Qubit fluorometrisk analyse (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Poly-A-anrikede mRNA-Seq-biblioteker ble fremstilt etter Universal Plus mRNASeq-sett standardprotokollen (Tecan Genomics, Redwood City, CA) ved bruk av 10 ng totalt RNA.

Alle prøver ble ligert med Illumina-adaptere og individuelt strekkodet. Fraværet av adapterdimerer og en konsistent bibliotekstørrelse på ~300 bp ble bekreftet ved bruk av Agilent Bioanalyzer 2100. Bibliotekkonsentrasjonen og sekvenseringsatferden ble vurdert om en standardisert spike-in av PhIX ved bruk av en Nano MiSeq-sekvenseringsflytcelle fra Illumina. 1,8 pm av de sammenslåtte bibliotekene med 1 prosent PhiX spike-in ble lastet på én NextSeq 500/550 75 syklus High Output Kit v2 sekvenseringsflytcelle og sekvensert på Illumina NextSeq 500 sekvenser rettet mot 60 M 1x75 bp avlesninger per prøve.

RNA-sekvensering.

Biblioteker ble utarbeidet ved å bruke Universal Plus mRNA-seq-settet med NuQuant® bibliotekkvantifisering (NuGen). De seks prøvene ble spredt over fire sekvenseringslinjer i en kjøring. De 24 single-end rå sekvenseringsfilene (.fastq)64 ble lastet ned fra Illuminas BaseSpace65 til KBRIN-serveren for analyse. Kvalitetskontroll (QC) av de rå sekvensdataene ble utført ved bruk av FastQC (versjon 0.10.1)66. Sekvensene ble justert til mm10 musereferansegenomet ved å bruke STAR (versjon 2.6)67, og genererte justeringsfiler i bam-format. Differensiell ekspresjon av ENSEMBL-proteinkodende transkripter ble utført ved bruk av DESeq268,69. Råteller ble hentet fra de STAR-justerte bam-formatfilene ved bruk av HTSeq (versjon 0.10.0)70. Råtellingene ble normalisert ved hjelp av Relative Log Expression (RLE)-metoden og deretter filtrert for å ekskludere gener med færre enn ti tellinger på tvers av prøvene71. RNA-seq-data ble deponert med GEO-tiltredelse GSE187464.

RNA-sekvensering: analyse av anrikning av gensett.

Gensettanrikningsanalyse (GSEA) ble brukt for å karakterisere biologien til genene som omfatter WGP vs PBS-forholdene og deres forskjeller72. Gensett ble hentet fra Molecular Signatures Database (MSigDB) for Gene Ontology (GO) biologiske prosesser og reaktomveier. For hvert gensett ble alle testede genplasseringer i sammenligningen av WGP vs PBS-behandlede kontrollmus sortert fra høyeste til laveste betydning ved bruk av p-verdier. Denne tilnærmingen gjør at svært signifikante opp- og nedregulerte gener kan inkluderes i hvert gensett, en tilnærming som mer nøyaktig gjenspeiler forholdene i en biologisk vei. For denne analysen blir en tabell over de berikede settene etterfulgt av et anrikningsplott som viser profilen til anrikningsskåren (ES) og plasseringen av gensettmedlemmer på den rangerte listen.

Enkeltcellesekvensering: isolering av enkeltceller og RNA-sekvensering.

Levende CD45 pluss-celler ble sortert fra musebukspyttkjertelen, vasket og resuspendert i 1x PBS (kalsium- og magnesiumfri) inneholdende 0,04 prosent BSA. Enkeltceller ble fanget og strekkodede cDNA-biblioteker ble konstruert ved å bruke Chromium Next GEM Single-Cell 3ʹ Reagent Kit (v3.1, 10X Genomics) og Chromium Controller, i henhold til produsentens instruksjoner. Biblioteker ble samlet og sekvensert ved å bruke en 28 bp × 8 bp × 125 bp konfigurasjon for read1 × i7 index x read2 på Illumina NextSeq 500 med NextSeq 500/550 150 syklus High Output Kit v2.5 (20024907).

Siden cellesekvensering: profilering av genuttrykk.

Bcl-filer ble demultiplekset til fastq-filer ved hjelp av CellRanger-programvaren (10X Genomics, v3.1.{{10}}). Det totale antallet sekvenserte lesninger var 506 913 062. Avlesningene var av god kvalitet som bestemt av FastQC66. Gentellinger ble målt ved å bruke CellRanger "count", ved å bruke cell ranger-mm10-3.0.0 referansegenomet for mus. En tellematrise ble generert for hver prøve og en aggregert prøve med forventet antall celler satt til 5000.

Råtellingsdataene bestemt av CellRanger ble brukt som input til en tilpasset analysepipeline i R som bruker en rekke enkeltcelleanalyseverktøy basert på Seurat. Kneeplottet (tilleggsfigur 7b) viser en graf som viser rangerte UMI-tellinger for hver celles strekkode for data aggregert på tvers av de tre gruppene. Celler over vendepunktet representerer mulige dubletter mens de under kneet representerer bakgrunnsceller. Tiltak for cellekvalitetskontroll ble analysert ved bruk av Seurat v373, og cellestrekkoder med følgende egenskaper ble fjernet fra analysen: lavt antall (mulige bakgrunnsceller) med en FDR cutoff på 0.01 fra DropletUtils74-funksjonen "emptyDrops", høye tellinger (mulige dublettceller) med flere tellinger enn kneplott-bøyepunktet, mitokondrieinnhold større enn 30 prosent og ribosominnhold større enn 40 prosent. Gen (funksjoner) ble ytterligere filtrert for å fjerne pensjonerte genidentifikatorer og gener som ikke ble uttrykt i minst to celler. Se tilleggsfigur 7a, b for det innledende og filtrerte antallet cellestrekkoder og gener.

Ekspresjonsdataene ble normalisert ved bruk av SCTransform75 hvor cellesyklusgener, ribosomalt innhold og mitokondrieinnhold ble regressert. Cellene ble deretter gruppert og dimensjonsreduksjon ble utført ved bruk av UMAP76. De første klyngenavnene ble tildelt ved å bruke en modifisert GSVA77,78 berikelsesscoreteknikk. For hver av disse klyngene ble toppmarkørgenene identifisert. Differensielt uttrykte gener som sammenlignet hver klynge med hver annen klynge (alle parvise sammenligninger) ble bestemt ved å bruke Seurat73 og MAST79. scRNA-seq-data ble deponert med GEO-tiltredelse GSE187464.

Identifikasjon av klynger generert med scRNA-Seq.

Ikke-myeloid-avledede klynger ble generelt klassifisert som B-celler (MS4A1), plasmaceller (SDC1), CD8 pluss T-celler (CD3e, C8a), CD4 pluss T-celler (CD3e, CD4), T-regulatoriske celler (T) -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), δ T-celler (CD3e, TRGC1, TRGC2, IL7Ra) og type 2 medfødte immunceller (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg, GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS og Rxrg)80–82. Nøytrofiler ble identifisert gjennom MMP9-, Csf3r-, S100A8-, S100A8- og ADAM8-ekspresjon, men kan være underrepresentert i disse analysene på grunn av deres lave RNA-innhold og høye nivåer av iboende RNaser83. Konvensjonelle dendrittiske celler (cDCs) ble identifisert gjennom ITGAX og ITGAE ekspresjon og plasmacytoid DCs (pDCs) ble identifisert av ITGAX og Siglech.

Klassifisering av myeloidklynger fra scRNA-Seq.

Klynge 5 uttrykte ITGAMIntADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- og uttrykte ikke TNFAIP2, noe som indikerer at disse cellene er residente makrofager. Cluster10 uttrykte ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. Klynger 3 og 4 uttrykte ITGAMInt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi, noe som antyder at begge er undergrupper av infiltrerende monocytter/makrofager, selv om de forbedrede inflammatoriske genene uttrykt i klynge 3 ble brukt til å identifisere klyngeinfiltrerende/inflammatorisk/makrofager. .

Fagocytoseanalyser.

Bukspyttkjertelen til PBS/mikropartikkel-injiserte mus og in vivo WGP-trente mus ble høstet 7 dager etter injeksjon og behandlet som beskrevet tidligere til en enkeltcellesuspensjon. Omtrent 2 × 106 ble vasket med HEPES fortynnet 50x i RPMI 1640 og deretter inkubert i 100 μL av denne løsningen i 1 time ved 37 grader for å aktivere cellene. Invitrogen promoterer Green S.

Aureus BioParticlesTM Phagocytosis Kit for Flowcytometri (Thermo Fisher Scientific) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Omtrent 100 μL av de rekonstituerte partiklene eller 1 × 106 GFP pluss KPC-tumorceller ble tilsatt til de aktiverte bukspyttkjertelcellene og inkubert i 1 time ved 37 grader. Prøver ble forsiktig vortexet hvert 15. minutt. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 1 ml kald PBS. Prøver ble inkubert med Fc Block i 10 minutter ved 4 grader, farget for levedyktighet, CD45, CD11b og F4/80 i 30 minutter ved 4 grader, og deretter analysert med en BD FACSCanto. For analyse, etter gating på levende celler og CD45, ble celler som fluorescerte i FITC-kanalen bestemt til å være fagocytiske.

Cytotoksisitetsanalyse.

Bukspyttkjertelen fra WGP og PBS-behandlede mus ble høstet og CD11b pluss-populasjonene ble isolert ved bruk av magnetiske CD11b pluss MicroBeads (Miltenyi Biotec) og en autoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec). Rensede CD11b pluss-celler ble deretter vasket og talt, og disse ble sådd ut i et forhold på 1:20 tumor:effektorceller i en 96-brønnplate. Alle eksperimentelle prøver ble kjørt i tre eksemplarer. Etter utplating av CD11b pluss-cellene, ble ROS-hemmerne N-acetyl-Lcystein (NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 μM, Sigma-Aldrich) eller DFO (50 μM, European Pharmacopoeia) tilsatt til en sett med PBS- og WGP-avledede celler i 1 time før tilsetning av 5000 luciferase-uttrykkende KPC pluss bukspyttkjertelsvulstceller til alle brønner. Etter 24 timers samkultur ble platene sentrifugert og 20 µL av supernatanten ble blandet med 100 µL av Luciferase Assay Reagent (Promega). Luciferaseaktivitet målt i supernatanten korrelerte med tumorceller som var blitt drept av effektorcellene og ble målt ved bruk av et luminometer (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). Det spontane luciferasesignalet fra belagte tumorceller ble trukket fra målingen av supernatanten. Luciferase-verdier er representert som relative lysenheter (RLU).

In vivo tumormodeller av kreft i bukspyttkjertelen.

En KPC-cellelinje på en C57BL/6-bakgrunn avledet fra LSL-KrasG12D/plus; LSL-Trp53R172H/ pluss ; Pdx1-Cre (KPC) musemodell ble kjøpt fra Ximbio. Disse og Pan02-cellene som var en sjenerøs gave fra Dr. Yong Lu ved Wake Forest University ble brukt i en ortotopisk modell av kreft i bukspyttkjertelen. En KPC-linje transfektert med GFP og luciferase (KPCGFP pluss Luc pluss ) var også et sjenerøst bidrag fra Dr. Michael Dwinell ved Medical College of Wisconsin. Disse cellene ble utelukkende brukt i albino C57BL/6 mus.

For tumorimplantasjon ble mus bedøvet ved bruk av isofluran, og magen til musene ble preppet med betadin og drapert på en steril måte. En 2 cm midtlinje laparotomi ble utført ved bruk av en aseptisk teknikk med sterile instrumenter. Etter laparotomi ble bukspyttkjertelen og milten eksternisert. Tumorceller ble suspendert i iskald PBS og blandet i et 1:1-forhold med basalmembranmatrise Matrigel (Corning). 0.1 × 106 tumorceller i 50 uL av PBS-matrigel-løsningen ble injisert inn i halen av bukspyttkjertelen ved hjelp av en 30-måler insulinsprøyte. Dannelsen av en liten boble indikerte vellykket implantasjon. Peritoneum ble lukket ved bruk av belagt polyglykolsyreflettet absorberbar 5/0-sutur og huden ble lukket ved bruk av silkeflettet ikke-absorberbar 5/0-sutur. (CP Medical). Buprenorfin ble administrert for smertebehandling opptil 72 timer etter operasjonen, og mus ble overvåket.

In vivo bildebehandling.

Mus implantert ortotopisk med GFP pluss Luciferase pluss KPC tumorceller ble injisert IP med 150 mg/kg kroppsvekt ved 100 µL XenoLight D-Luciferin-K pluss salt bioluminescerende substrat (PerkinElmer). Etter 10 minutter ble mus bedøvet med isofluran og plassert inne i en Biospace Lab Photon Imager, som er en dedikert lavlysnivå in vivo optisk modalitet for bioluminescerende og fluorescerende avbildning. Bilder av mus ble tatt og brukt til å måle tumorstørrelse og vekst.

Blandingssvulstmodell.

Mus ble trent med 1 mg WGP og 7 dager senere ble CD11b pluss CCR2 pluss og CD11b pluss CCR2− populasjoner sortert og blandet 1:1 med KPC tumorceller 1 × 105 tumorceller. Celler ble implantert ortotopisk i WT-mus og 3 uker senere ble mus avlivet og tumorstørrelsen ble vurdert.

Kombinasjonsbehandling med anti-PD-L1 mAb.

C57BL/6-mus ble behandlet med WGP på dag -7 og implantert med KPC ortotopiske bukspyttkjertelsvulster på dag 0. Mus ble behandlet med 200 µg anti-mus anti-PD-L1 mAb (Bio X Cell) eller rotte IgG2b isotypekontroll (Bio X Cell) på dag 3, 7 og 11. Mus ble deretter overvåket for overlevelse.

WGP som behandling.

C57BL/6 mus ble implantert med KPC ortotopiske bukspyttkjertelsvulster på dag 0 og på dag 4 og 11 fikk mus 1 mg IP WGP eller PBS. Mus ble deretter overvåket for overlevelse.

Statistisk analyse.

Alle resultater ble gjentatt minst tre uavhengige ganger for å bekrefte med mindre annet er spesifisert. Representative resultater vises. Resultatene er representert som gjennomsnitt ± SEM. Data ble analysert ved hjelp av en tosidig Students t-test eller Mann–Whitney U-test. Sammenligninger med flere grupper ble utført ved å bruke en enveis eller toveis ANOVA etterfulgt av Tukeys multiple sammenligningstester. Korrelasjonsanalyser ble utført ved bruk av Pearsons korrelasjonskoeffisient (normalfordeling). Statistisk signifikans ble satt til p < 0.05. Alle statistiske analyser ble utført ved bruk av GraphPad Prism Software versjon 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Rapporteringssammendrag.

Ytterligere informasjon om forskningsdesign er tilgjengelig i Nature Research Reporting Summary koblet til denne artikkelen.

Datatilgjengelighet

Kildedata er gitt i denne artikkelen. RNASeq-data er tilgjengelig under GEO-tiltredelse GSE187464, og scRNA-Seq-data er tilgjengelig under GEO-tiltredelse GSE187464 Kildedata er gitt i denne artikkelen.

Mottatt: 2. april 2021; Godkjent: 17. januar 2022.

Referanser

1. ACS. Kreftfakta og -tall 2020.

2. Rahib, L. et al. Projisere kreftforekomst og dødsfall til 2030: den uventede byrden av kreft i skjoldbruskkjertelen, leveren og bukspyttkjertelen i USA. Cancer Res. 74, 2913–2921 (2014).

3. Kommalapati, A., Tella, SH, Goyal, G., Ma, WW & Mahipal, A. Moderne behandling av lokalisert resektabel kreft i bukspyttkjertelen. Kreft 10, 24 (2018).

4. Bliss, LA, Witkowski, ER, Yang, CJ & Tseng, JF Utfall i operativ behandling av kreft i bukspyttkjertelen. J. Surg. Oncol. 110, 592–598 (2014).

5. Schizas, D. et al. Immunterapi for kreft i bukspyttkjertelen: en oppdatering fra 2020. Kreftbehandling. Rev. 86, 102016 (2020).

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. Checkpoint inhibitors in pancreatic cancer. Kreftbehandling. Rev. 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK Immunkontrollpunkthemmere ved lungekreft og melanom. Semin. Oncol. Sykepleiere. 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ Immune sjekkpunkthemmere for plateepitelkarsinom i hode og nakke: Nåværende landskap og fremtidige retninger. Hode. Neck 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. Regulering og modulering av antitumorimmunitet ved kreft i bukspyttkjertelen. Nat. Immunol. 21, 1152–1159 (2020).

10. Royal, RE et al. Fase 2-studie av enkeltmiddel Ipilimumab (anti-CTLA-4) for lokalt avansert eller metastatisk pankreasadenokarsinom. J. Immunother. 33, 828–833 (2010).

11. O'Reilly, EM et al. Durvalumab med eller uten tremelimumab for pasienter med metastatisk pankreas duktalt adenokarsinom: en fase 2 randomisert klinisk studie. JAMA Oncol. 5, 1431–1438 (2019).

12. Weiss, GJ et al. Fase Ib/II-studie av gemcitabin, nab-paklitaksel og pembrolizumab ved metastatisk pankreasadenokarsinom. Investere. New Drugs 36, 96–102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. i Pancreatic Cancer and Tumor Microenvironment (red. Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (Transworld Research Network, 2012).

14. Karamitopoulou, E. Tumormikromiljø av kreft i bukspyttkjertelen: immunlandskapet er diktert av molekylære og histopatologiske trekk. Br. J. Cancer 121, 5–14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pillarsetty, VG Hypoksi som en barriere for immunterapi ved adenokarsinom i bukspyttkjertelen. Clin. Overs. Med. 8, 10–10 (2019).

16. Wang, W. et al. RIP1 kinase driver makrofagmediert adaptiv immuntoleranse ved kreft i bukspyttkjertelen. Cancer Cell 38, 585–590 (2020).

17. Netea, MG et al. Trenet immunitet: et program for medfødt immunminne i helse og sykdom. Science 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering, S. et al. Metabolsk induksjon av trent immunitet gjennom mevalonatveien. Cell 172, 135–146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. et al. Epigenetikk og trent immunitet. Antioksid. Redokssignal. 29, 1023–1040 (2018).

20. Priem, B. et al. Opplært immunitetsfremmende nanobiologisk terapi undertrykker tumorvekst og potenserer sjekkpunkthemming. Cell 183, 786–801 e719 (2020).

21. Kalafati, L. et al. Medfødt immuntrening av granulopoiesis fremmer antitumoraktivitet. Cell 183, 771–785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. et al. Modulering av myelopoiese stamceller er en integrert komponent i trent immunitet. Cell 172, 147–161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG Trenet immunitet: omprogrammering av medfødt immunitet i helse og sykdom. Annu Rev. Immunol. 39, 667–693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. Utvikling og funksjon av vevsresidente makrofager i mus. Semin. Immunol. 27, 369–378 (2015). 25. Calderon, B. et al. Bukspyttkjertelens anatomi betinger opprinnelsen og egenskapene til fastboende makrofager. J. Exp. Med. 212, 1497–1512 (2015).

26. Kim, H. Transkripsjonsfaktoren MafB fremmer antiinflammatorisk M2-polarisering og kolesterolutstrømning i makrofager. Sci. Rep. 7, 7591 (2017).

27. Kim, SY et al. Antiinflammatoriske effekter av apocynin, en hemmer av NADPH-oksidase, ved luftveisbetennelse. Immunol. Cell Biol. 90, 441–448 (2012).

28. Liu, M. et al. Transkripsjonsfaktor c-Maf er et sjekkpunkt som programmerer makrofager ved lungekreft. J. Clin. Investere. 130, 2081–2096 (2020).

29. Zimmerman, KA et al. Enkeltcelle-RNA-sekvensering identifiserer kandidat-genekspresjonssignaturer for nyreboende makrofager på tvers av arter. J. Am. Soc. Nephrol. 30, 767–781 (2019).

30. Bakos, E. et al. CCR2 regulerer immunresponsen ved å modulere interkonversjonen og funksjonen til effektor- og regulatoriske T-celler. J. Immunol. 198, 4659–4671 (2017).

31. Kurihara, T., Warr, G., Loy, J. & Bravo, R. Defekter i makrofagrekruttering og vertsforsvar hos mus som mangler CCR2-kjemokinreseptoren. J. Exp. Med. 186, 1757-1762 (1997).

32. Kuziel, WA et al. Alvorlig reduksjon i leukocyttadhesjon og monocyttekstravasasjon hos mus med mangel på CC-kjemokinreseptor 2. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 12053–12058 (1997).

33. Kratofil, RM, Kubes, P. & Deniset, JF Monocyttkonvertering under betennelse og skade. Arterioskler. Thromb. Vasc. Biol. 37, 35–42 (2017).

34. Funamizu, N. et al. Makrofagmigrasjonshemmende faktor induserer epitelial til mesenkymal overgang, øker tumoraggressivitet og forutsier kliniske utfall ved resekert pankreas duktalt adenokarsinom. Int. J. Cancer 132, 785–794 (2013).

35. Denz, A. et al. Hemming av MIF fører til cellesyklusstans og apoptose i kreftceller i bukspyttkjertelen. J. Surg. Res. 160, 29–34 (2010).

36. Su, LJ et al. Reaktive oksygenarter-indusert lipidperoksidasjon ved apoptose, autofagi og ferroptose. Oksyd. Med. Cell Longev. 2019, 5080843 (2019).

37. Geller, A., Shrestha, R. & Yan, J. Gjær-avledet -glukan i kreft: ny bruk av et tradisjonelt terapeutisk middel. Int. J. Mol. Sci. 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. Viktig rolle monocytter og makrofager i progresjonen av akutt pankreatitt. World J. Gastroenterol. 16, 3995–4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. Et reservoar av modne hulrommakrofager som raskt kan invadere viscerale organer for å påvirke vevsreparasjon. Cell 165, 668–678 (2016).

40. Qi, C. et al. Differensielle veier som regulerer medfødte og adaptive antitumorimmunresponser av partikkelformige og løselige gjæravledede glukaner. Blood 117, 6825–6836 (2011).

41. Goodridge, HS et al. Aktivering av den medfødte immunreseptoren Dectin-1 ved dannelse av en "fagocytisk synapse". Nature 472, 471–475 (2011).

42. Masuda, Y. et al. Oral administrering av løselige glukaner ekstrahert fra Grifola frondosa induserer en systemisk antitumorimmunrespons og reduserer immunsuppresjon hos tumorbærende mus. Int. J. Cancer 133, 108–119 (2013).

43. Rice, PJ et al. Farmakokinetikk av sopp (1-3)-beta-D-glukaner etter intravenøs administrering hos rotter. Int. Immunopharmacol. 4, 1209–1215 (2004).

44. Huang, Y. et al. S1P-avhengig interorgantrafikk av gruppe 2 medfødte lymfoide celler støtter vertsforsvar. Science 359, 114–119 (2018).

45. Matha, L. et al. Migrasjon av lungeboende gruppe 2 medfødte lymfoide celler kobler allergisk lungebetennelse og leverimmunitet. Front. Immunol. 12, 67950 (2021).

46. ​​Ricardo-Gonzalez, RR et al. Vevsspesifikke veier ekstruderer aktiverte ILC2-er for å spre type 2-immunitet. J. Exp. Med. 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. Aktivering av antitumorimmunitet ved å frigjøre ILC2. Cell Res. 30, 461–462 (2020).

48. Qian, BZ & Pollard, JW Makrofagdiversitet forbedrer tumorprogresjon og metastaser. Cell 141, 39–51 (2010).

49. Qian, BZ et al. CCL2 rekrutterer inflammatoriske monocytter for å lette brystsvulstmetastaser. Nature 475, 222–225 (2011).

50. Munn, DH & Cheung, NK Fagocytose av tumorceller av humane monocytter dyrket i rekombinant makrofag kolonistimulerende faktor. J. Exp. Med. 172, 231-237 (1990).

51. Jadus, MR et al. Makrofager dreper T9-gliomtumorceller som bærer membranisoformen av makrofagkolonistimulerende faktor gjennom en fagocytoseavhengig vei. J. Immunol. 160, 361-368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. & Huang, L. Makrofagemediert tumorcellefagocytose: en mulighet for nanomedisinsk intervensjon. Adv. Funksjon. Mater. 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR Fagocytisk funksjon av tumorassosierte makrofager som en nøkkeldeterminant for kontroll av tumorprogresjon: en gjennomgang. J. Immunother. Kreft 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB & Albina, JE Aktiverte murine makrofager induserer apoptose i tumorceller gjennom nitrogenoksid-avhengige eller -uavhengige mekanismer. Cancer Res. 54, 2462-2467 (1994).

55. Brahmer, JR et al. Sikkerhet og aktivitet av anti-PD-L1 antistoff hos pasienter med avansert kreft. N. Engl. J. Med. 366, 2455–2465 (2012).

56. Saijo, S. et al. Dectin-1 er nødvendig for vertsforsvar mot Pneumocystis carinii, men ikke mot Candida albicans. Nat. Immunol. 8, 39–46 (2007).

57. Bernhagen, J. et al. Rensing, bioaktivitet og sekundær strukturanalyse av mus og human makrofag migrasjonshemmende faktor (MIF). Biochemistry 33, 14144-14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: gir en analyseplattform for samfunnscytometridataanalyse og samarbeid. Curr. Topp. Microbiol. Immunol. 377, 127–157 (2014).

59. Nowicka, M. et al. CyTOF arbeidsflyt: differensiell oppdagelse i høydimensjonale cytometridatasett med høy ytelse. F1000Res. 6, 748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: et klasseoppdagelsesverktøy med konfidensvurderinger og varesporing. Bioinformatikk 26, 1572–1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: Infrastruktur for å representere og samhandle med gated og ungated cytometridatasett. Bioconductor-versjon (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML for deling av cytometridata på tvers av plattformer. Cytom. Del A: J. Int. Soc. Anal. Cytol. 93, 1189–1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD KATALYSATOR: verktøy for analyse av cytometridata. R-pakkeversjon 1.10.3. HelenaLC/CATALYST (2020).

64. Cock, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM Sanger FASTQ-filformatet for sekvenser med kvalitetspoeng, og Solexa/Illumina FASTQ-variantene. Nucleic Acids Res. 38, 1767–1771 (2010).

65. Illumina. Brukerveiledning for BaseSpace. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: et kvalitetskontrollverktøy for sekvensdata med høy gjennomstrømming.

67. Dobin, A. et al. STAR: ultrarask universal RNA-seq aligner. Bioinformatikk 29, 15–21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Moderert estimering av fold endring og dispersjon for RNA-seq data med DESeq2. Genom Biol. 15, 550 (2014).

69. Trapnell, C. et al. Differensiell gen- og transkripsjonsekspresjonsanalyse av RNAseq-eksperimenter med TopHat og mansjettknapper. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT & Huber, W. HTSeq – et Python-rammeverk for å jobbe med sekvenseringsdata med høy gjennomstrømning. Bioinformatikk 31, 166–169 (2015).

71. Boyle, EI et al. GO::TermFinder – åpen kildekode-programvare for å få tilgang til Gene Ontology-informasjon og finne betydelig berikede Gene Ontology-termer knyttet til en liste over gener. Bioinformatikk 20, 3710–3715 (2004).

72. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Kyoto-leksikon av gener og genom. Nucleic Acids Res. 28, 27–30 (2000).

73. Stuart, T. et al. Omfattende integrasjon av enkeltcelledata. Celle 177, 1888–1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Marioni, JC. EmptyDrops: skille celler fra tomme dråper i dråpebaserte enkeltcelle-RNA-sekvenseringsdata. Genom Biol. 20, 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. Normalisering og variansstabilisering av enkeltcellede RNA-sekvensdata ved bruk av regulert negativ binomial regresjon. Genom Biol. 20, 1–15 (2019).

76. Becht, E. et al. Dimensjonsreduksjon for visualisering av enkeltcelledata ved hjelp av UMAP. Nat. Bioteknologi. 37, 38–44 (2019).

77. Diaz-Mejia, JJ et al. Evaluering av metoder for å tilordne celletypeetiketter til celleklynger fra enkeltcelle RNA-sekvenseringsdata. F1000Res. 8 ISCB Comm J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: gensettvariasjonsanalyse for mikroarray og RNA-seq-data. BMC Bioinforma. 14, 7 (2013).

79. Finak, G. et al. MAST: et fleksibelt statistisk rammeverk for vurdering av transkripsjonelle endringer og karakterisering av heterogenitet i enkeltcellede RNA-sekvenseringsdata. Genom Biol. 16, 1–13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. Identifikasjon av medfødte lymfoide celler i enkeltcellede RNA-Seq-data. Immunogenetics 69, 439–450 (2017).

81. Entwistle, LJ et al. Pulmonal gruppe 2 medfødt lymfoid celle-fenotype er kontekstspesifikk: bestemmer effekten av belastning, plassering og stimuli. Front. Immunol. 10, 3114 (2020).

82. Ricardo-Gonzalez, RR et al. Vevssignaler preger ILC2-identitet med antisiperende funksjon. Nat. Immunol. 19, 1093–1099 (2018).

83. Zilionis, R. et al. Encellet transkriptomikk av lungekreft hos mennesker og mus avslører konserverte myeloide populasjoner på tvers av individer og arter. Immunity 50, 1317–1334.e1310 (2019).

Anerkjennelser

Forfatterne ønsker å takke Dr. Wolfgang Zacharias, Dr. Mei Zhang og Sabine Waigel fra Brown Cancer Center Genomics Facility for deres hjelp med RNA-Seq og scRNASeq. Vi vil også takke Dr. Clint Geller for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01CA213990 og R01AI128818 (JY). CD og CTW ble delvis støttet av NIH P20GM135004. En del av dette arbeidet ble utført med bistand fra UofL Genomics Facility, som støttes av NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), Brown Cancer Center og brukeravgifter. CyTOF ble utført i Functional Immunomics Core støttet av NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). Støtte for sekvensering og bioinformatikk for dette arbeidet ble levert av NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) og NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI). Innholdet i dette arbeidet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke de offisielle synspunktene til NIH eller National Institute for General Medical Sciences (NIGMS).

Forfatterbidrag

AEG designet og utførte eksperimentene analyserte data, tolket resultater og skrev manuskriptet. RS, CD og HG bidro til eksperimentell design, datainnsamling og dataanalyse. MRW, XH og MZ hjalp til med datainnsamling og forberedelse av materialer. KA og ECR bidro til beregningsanalyse og tolkning av RNA-Seq-analyser og JHC og ECR bidro til beregningsmessig analyse og tolkning av ScRNA-Seq-analyser. DT og CTW bidro til analysen av CyTOF-data. RAM, H.-gZ og YL bidro med materialer og veiledet prosjektet. RAM utførte en kritisk gjennomgang. JY ledet eksperimentell design og den overordnede studien, tolket data, veiledet forskning og hjalp til med skriving og gjennomgang av manuskriptet.

Konkurrerende interesser

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Ytterligere informasjon

Tilleggsinformasjon Nettversjonen inneholder tilleggsmateriale tilgjengelig på https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

Korrespondanse og forespørsler om materiell skal rettes til Jun Yan.

Informasjon om fagfellevurdering

Nature Communications takker George Miller og de andre, anonyme, anmelderne for deres bidrag til fagfellevurderingen av dette arbeidet. Peer review-rapporter er tilgjengelige.

Opptrykk og informasjon om tillatelser er tilgjengelig på http://www.nature.com/reprints

Utgiverens notat Springer Nature forblir nøytral om jurisdiksjonskrav i publiserte kart og institusjonelle tilknytninger.

Open Access Denne artikkelen er lisensiert under en Creative Commons Attribution 4.0 International License, som tillater bruk, deling, tilpasning, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium eller format, så lenge du gir passende kreditt til den opprinnelige forfatteren (s) og kilden, oppgi en lenke til Creative Commons-lisensen, og angir om endringer ble gjort.

Bildene eller annet tredjepartsmateriale i denne artikkelen er inkludert i artikkelens Creative Commons-lisens med mindre annet er angitt i en kredittgrense til materialet. Hvis materiale ikke er inkludert i artikkelens Creative Commons-lisens og din tiltenkte bruk ikke er tillatt av lovbestemt regulering eller overskrider tillatt bruk, må du innhente tillatelse direkte fra opphavsrettsinnehaveren. For å se en kopi av denne lisensen.

For more information:1950477648nn@gmail.com