Totalt antall glykosider av Cistanche Deserticola fremmer nevrologisk funksjonsgjenoppretting ved å indusere nevrovaskulær regenerering via Nrf- 2/Keap-1-vei i MCAO/R-rotter-Ⅱ

TG-er fremmer nevral ombygging hos I/R-skadde rotter

I følge en rekke studier kan nevrogenese etter et slag forbedre funksjonell utvinning betydelig. Synaptophysin (SYN), postsynaptic density 95 (PSD-95)-proteiner og mikrotubule-assosiert protein 2 (MAP-2) ble brukt som markører for å undersøke nevronal plastisitet i den iskemiske penumbraen i cortex. For å vurdere effekten av TG-, PS- og OS-behandling på nevrogenese hos I/R-skadde rotter, ble immunfluorescens og western blot for SYN-, PSD95- og MAP-2-uttrykk utført. Som vist i figur 9 og 10, reduserte SYN-, PSD95- og MAP{10}}-ekspresjonsnivåene i I/R-rotter etter 14 dager med reperfusjon sammenlignet med NOR-rottene, mens TG- og PS-kurene kunne øke betydelig. regulerer deres uttrykksnivåer. OSs-gruppen hadde ingen signifikant endring sammenlignet med MOD-gruppen. Dataene indikerte at TG-ene og PS-ene var i stand til å kurere dramatiskfremme neural remodellering etter I/R-skade. 

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR Å BESKYTTE MOT ISKEMISK HJELGE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TGs Alter Nrf-2 og beholder-1 uttrykk hos I/R-skadde rotter

Oksidativt stress er den viktigste patogene mekanismen ved I/R-skade. Studiene bekreftet at Nrf-2 er en mesterregulator for antioksidative responser. For å undersøke Nrf-2- og Keap-1-medierte oksidative responser etter I/R-skade, evaluerte vi den cytoplasmatiske

uttrykk så vel som kjernefysisk translokasjon av Keap-1. I mellomtiden ble uttrykket av Nrf-2 i I/R-skadde rotters hjernevev også analysert (figur 10 og 11). I følge immunfluorescensanalysen ble Nrf-2 hovedsakelig lokalisert i cytoplasmaet i NOR-gruppen. I TGs-gruppen ble uttrykket av Nrf-2 i cytoplasmatisk lokalisering nedregulert, men oppregulert i kjernen, og et redusert Keap-1-uttrykk ble også observert. Dataene viste at hjernebeskyttelsen til TG-er kan være assosiert med moduleringen av Nrf-2 og Keap-1.

TG-er demper hjernevevs oksidativt stress hos I/R-skadde rotter

For å bekrefte de antioksidative effektene av TG-er, ble aktivitetene til SOD, CAT, GSH-Px og MDA evaluert i I/R-skadde rotter. I figur 12 ble innholdet av MDA markert økt i MOD-gruppen, og samtidig ble aktivitetene til SOD, CAT og GSH-Px redusert, sammenlignet med de normale rottene. Motsatt førte TG-behandling til en betydelig reduksjon i innholdet av MDA og en økning i aktivitetene til SOD, CAT og GSH-Px. Disse resultatene bekreftet ytterligere antioksidasjonsaktiviteten til TG-er.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR BEHANDLING AV ISKEMISK HJELGE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

DISKUSJON

Mange studier tyder på at TCM C. deserticola har omfattende biologiske aktiviteter, f.eks. styrking av evnen til å lære, hukommelse og immunitet. Imidlertid forblir de aktive komponentene til C. deserticola for nevrobeskyttelse uklare. Det nåværende arbeidet tar sikte på å skjerme de aktive komponentene fraC. deserticola mot iskemisk slagpå MCAO/R-modellen. Tre ekstrakter fra C. deserticola (TGs, PSs og OSs) ble brukt for å evaluere deres effekter på MCAO/R-rotter, samt mulige mekanismer.

Hjerneslag er en vanlig akutt cerebrovaskulær sykdom. Epidemiologiske studier viser at hjerneslag er mer vanlig hos menn enn hos kvinner. I vårt forsøk ble hanrotter tatt i bruk for testene. Resultatene våre viste at I/R-induksjon akselererte oksidativt stress og infarktvolum, brøt BBB og førte til nerve- og cerebrovaskulær skade. Etter screening ble det funnet at TG-er reduserer infarktvolumet og fremmer nevral ombygging og angiogenese. Dessuten ble TG-er observert å opprettholde BBB-integritet etter I/R-skade. Tvert imot gir PS-er og OS-er ingen vesentlig lindring av I/R-skade. Dermed regnes TG-er som den viktigste aktive fraksjonen av C. deserticola for nevrobeskyttelse, potensielt gjennom å fremme nevral remodellering, angiogenese og BBB-integritet via aktivering av Nrf- 2/Keap-1-veien.

Flere bevis indikerer at etablering av effektiv sirkulasjon er betydelig viktig for å unngå dannelse av infarkt og iskemisk penumbra, og er en kritisk behandling på et tidlig stadium av iskemisk hjerneslag. Proliferasjonen av vaskulære endotelceller og glatte muskelceller etter iskemisk infarkt bestemmer etableringen av kollateral sirkulasjon. Imidlertid har iskemimodellene et vanlig fenomen - det vil si at oksidativt stress eksisterer mye i hjernens mikrovaskulatur. Studiedata har vist at et stort antall antioksidanter kan forstyrre funksjonen til BBB og egenskapene til angiogenese. CD31 og a-SMA er markørene for henholdsvis vaskulære endotelceller og glatte muskelceller. For å undersøke effekten av den ovennevnte celleproliferasjonen av ekstraktene fra C. deserticola, undersøkte vi uttrykkene av CD31 og a-SMA i det cerebrale iskemiske penumbra-homogenatet. Dataene våre viste at TG-er påfallende forbedret uttrykkene til CD31 og a-SMA. Det var imidlertid ingen signifikante forskjeller mellom PS- og OS-grupper. Derfor utledet vi at TG-er kan redusere hjerneskade ved å fremme angiogenese ved å øke uttrykkene for CD31 og a-SMA, mens PS-er og OS-er ikke ga noen slik beskyttelse mot hjerneskade. Disse resultatene bekreftet videre at bare TG-er kunne forhindre cerebral I/R-skade.

Iskemisk hjerneslag kan betraktes som et resultat av cerebral iskemi forårsaket av svekkelse i nevronal plastisitet eller ombygging av hjerneområder. Flertallet av slagpasienter lider av nevrologiske mangler. Aktivering av nevrogenese er en lovende strategi for slagpasienter for å forbedre sine nevrologiske funksjoner. Neurogenese deltar direkte i nevrologisk funksjonsgjenoppretting etter hjernens I/R-skade. Tidligere forskning viser at TG-er kan forbedre overlevelsesraten for hippocampus pyramidale celler og indusere neurogenese. Oksidativt stress forårsaker tap av nevroner under mange sykdommer, som Parkinsons, hjerneslag og så videre. Nrf-2 transkriberer mange gener relatert til nevrobeskyttelse i deres promotorregion, hovedsakelig inkludert SOD, MDA, CAT og g-glutamylcysteinligaser, etc. SYN, PSD-95 og MAP{{ 4}} proteiner, som er nært assosiert med synaptisk dannelse og nevrotransmisjon, kan betraktes som markører for forskning på nevronal plastisitet i den iskemiske penumbra-regionen. Etter å ha studert fant vi at kuren med TG-er kunne øke uttrykkene for PSD95, SYN og MAP -2 betydelig, noe som indikerer at den cerebrale beskyttelsen av TG-er var korrelert med forbedret nevronal plastisitet under I/R. Imidlertid er det synd at det ikke er noen åpenbar forskjell mellom PS-er så vel som OS-grupper. Disse resultatene indikerte at TG-er kunne forbedre nevroplastisitet etter cerebral I/R-skade.

Bildeforskning på slagpasienter viste at BBB-dysfunksjon kan betraktes som en slående egenskap ved den peri-iskemiske hjernen (Bang et al., 2007). TJ-ene, som er sammensatt av cytoplasmatiske proteiner, transmembranproteiner og koblingsadhesjonsmolekyler mellom kapillære endotelceller, er svært viktige for å opprettholde BBB-integritet (Ye et al., 2019). Blant dem er ZO-1, claudin-5 og occludin de viktigste proteinene i TJ. Flere bevis indikerer at den økte permeabiliteten til BBB indusert av iskemi generelt korrelerer med endringene av ZO-1, claudin-5 og occludin (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017; Liu et al., 2018). I dette arbeidet viste resultatene at selv om TG-er signifikant kunne øke uttrykkene av ZO-1-, claudin--5- og occludin-proteiner i MCAO-indusert hjernevev, gjorde verken PS-er eller OS-er det. BBB består av cerebrale endotelceller og er nært assosiert med pericytter (Nyul-Toth et al., 2016). Pericytter er avgjørende for BBB-integritet (Bell et al., 2010). Iskemisk hjerneslag utløser pericytedød og løsrivelse fra hjerneendotelceller i den akutte fasen, og destabiliserer dermed mikrovaskulaturen og endrer BBB-egenskapene (Zechariah et al., 2013). Dataene våre viste at TG-er kunne øke pericytdekningen på kapillærer og øke ekspresjonsnivåene av ZO-1, claudin-5 og occludin. Disse fenomenene beviste at TG-er effektivt kunne beskytte BBB-integritet etter cerebral I/R-skade. Oppsummert kan TG-er dempe cerebral skade på flere måter, for eksempel å fremme angiogenese, forbedre nevronal plastisitet og opprettholde integriteten til BBB.

Vi undersøkte deretter signalveien for å utforske mekanismen som ligger til grunn for TGs hjernebeskyttelse. Prosessen med I/R-skade er multifaktoriell, og derfor er mange mekanismer involvert i patogenesen. Oksidativt stress er en grunnleggende risikofaktor som bidrar til I/R-indusert hjerneskade, som BBB-strukturskade, vaskulær endotelial dysfunksjon og forverring av iskemisk nevronal skade. Dermed har oksidativt stress blitt et attraktivt terapeutisk mål ved I/R-indusert hjerneskade. Fase 2-enzymer, som formidles av nukleær faktor E2-relatert faktor-2 (Nrf-2), har blitt ansett som et viktig middel som nevroner beskytter seg mot oksidativt stress. Flere bevis indikerer at aktivering av Nrf-2 under I/R er et potensielt terapeutisk mål for nevrobeskyttelse. Nrf-2, som en viktig regulator av endogent antioksidantforsvar, medierer nivået av hem oksygenase 1 (HO-1) og andre antioksidantenzymer, slik som NAD(P)H kinonoksidoreduktase 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH og MDA. Dessuten spiller Nrf-2 en viktig regulatorrolle i angiogenese. Denne studien viser at Nrf-2 kan forbedres og aktiveres betydelig i prosessen med vaskulær utvikling.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR ANTI-ISKEMISK SLAG PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Som tidligere beskrevet inneholder TG-er mange bioaktive forbindelser, for eksempel echinakosid, tubulosid A, acteosid, isoacteosid og 2'-acetylacteosid, og noen av dem viste nevrobeskyttende funksjoner etter cerebral I/R-skade. Echinacoside har mange farmakologiske effekter, som antioksidasjon, anti-senescens, nevrobeskyttelse, anti-inflammasjon, fremme av cicatrization, hepatoprotection, promotering av beindannelse og anti-tumoraktiviteter. Nylig har echinacoside blitt identifisert som en potent antioksidant i sentralnervesystemet. Echinacoside kan kutte ned MDA-innhold og forbedre aktivitetene til SOD og GSH-Px ved iskemi hjerneskade, og molekylær dokkinganalyse viste at echinacoside kan binde seg til Keap-1, noe som fører til Nrf-2 kjernefysisk translokasjon. Studien av Xia viste at acteosid kunne redusere infarktvolumet og hjernevanninnholdet for å forbedre nevrologiske underskudd hos MCAO/R-rotter ved å dempe oksidativt stress. Andre studier har vist at isoacteosid kan øke aktivitetene til cellulære antioksidantenzymer, SOD og CAT i H2O2-behandlede V79-4-celler. Basert på de ovennevnte rapportene om de aktive forbindelsene i TG-er, er det mulig å utlede at TG-er kanbeskytte mot iskemisk slag via antioksidasjonsveiene.

Li rapporterte om de nevrobeskyttende effektene av fenyletanoidglykosider (PhGs) på H2O2-indusert apoptose på PC12-celler via Nrf2/ARE-veien (Li et al., 2018). Disse PhG-ene ble betydelig undertrykt ved å utløse Nrf2-kjernetranslokasjon og øke uttrykk for HO-1, NQO1, glutamatcystein-ligase-katalytisk underenhet (GCLC) og glutamat-cystein-ligasemodifiserende underenhet (GCLM) (Li et al., 2018) ; Gong et al., 2019). Derfor antyder disse funnene at Nrf-2/ARE-banen spiller en avgjørende rolle i PhGs-medierte beskyttende effekter på nevronceller. Tilsvarende fant vi i denne studien at TG-er kunne redusere nivået av MDA og øke nivåene av SOD, CAT og GSH-Px i I/R-rottene. I mellomtiden kunne TG-er oppregulere Nrf2-uttrykket i kjernen, nedregulere det tilsvarende uttrykket i cytoplasmaet og redusere Keap-1-uttrykket betydelig. Derfor kan Nrf-2/Keap-1-veien være involvert i TGs-medierte nevrobeskyttende effekter. Ytterligere validering av denne veien vil bli utført in vitro cellekultur med oksygen-glukose deprivasjon/reoksygeneringsskademodeller i fremtiden. Dessuten ble C. deserticola-ekstrakter administrert i vår studie i 14 dager kontinuerlig. Siden nevrogenese hos voksne vil påvirke tolkningen av nevrobeskyttende effekter i løpet av 14 dager med reperfusjon, kan nevrogenese ikke utelukkes fra vårt nåværende eksperimentdesign for å utforske den nevrobeskyttende effekten av CT-er. Dette er begrensningen for vår forskning.

Avslutningsvis er det TG-ene fra C. deserticola som kanforbedre angiogenese og neurogenesesamt opprettholde integriteten til BBB i I/R-skaderotter, men ikke PS-ene og OS-ene. Effektene kan formidles ved aktivering av Nrf-2/Keap-1-banen.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR BEHANDLING AV ISKEMISK STROKE PHGS75% ECH 30% ACT 12%