Totalt antall glykosider av Cistanche Deserticola fremmer nevrologisk funksjonsgjenoppretting ved å indusere nevrovaskulær regenerering via Nrf- 2/Keap-1-vei i MCAO/R-rotter-Ⅰ

INTRODUKSJON

Hjerneslag anses å være en viktig årsak til død og funksjonshemming i verden. Nesten 87 % av alle slagtilfeller utløses av iskemisk hjerneslag. Foreløpig det mest effektive middelet og det eneste FDA-godkjente stoffet som brukes tiliskemisk slagbehandlinger rekombinant vevsplasminogenaktivator. Imidlertid klarer ikke en stor mengde slagpasienter å reagere på dette stoffet på grunn av dets smale terapeutiske tidsvindu og en alvorlig risiko for hemorragiske komplikasjoner. En stor utfordring ved trombolytisk behandling er iskemi/reperfusjonsskade (I/R), som regnes som en hovedårsak til hjerneskade og funksjonsødeleggelse. Reperfusjon etter cerebral iskemi øker risikoen for hjerneblødning samtidig som det fører til nevrovaskulær skade og produserer overdreven reaktive oksygenarter (ROS) som skader blod-hjerne-barrieren. Flere studier har bekreftet at forstyrrelsen av BBB er en hovedårsak til patogenesen av iskemisk slag.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR BEHANDLING ISKEMISK STROKE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

BBB består hovedsakelig av endotelceller, pericytter, astrocytter, nevroner og basalmembranene. Kjernekomponentene til BBB er cerebrale mikrovaskulære endotelceller som er forbundet med tette koblinger, og dermed begrenser eksogene molekyler inn i hjernen. De patologiske endringene av tight junctions – spesielt occludin, claudin-5 og zonula occludens-1 (ZO-1) – påvirker BBB-funksjonen signifikant under et iskemisk slag, spesielt barrierepermeabiliteten. Under I/R-perioder er overdreven ROS en av hovedfaktorene som fører til direkte skade på hjerneneuroner. ROS-overproduksjon fører til nedbrytning av visse kryss og BBB-forstyrrelser, noe som resulterer i at eksogene molekyler kommer inn i hjernen gjennom BBB, noe som fører til forverring av hjerneskade. Derfor har beskyttelse av BBB med antioksidanter blitt sett på som en potensiell måte å forhindre reperfusjonsskade.

I tillegg til nedbryting av BBB, kan I/R resultere i nevrovaskulær skade og nevronal død. Under et hjerneslag kan økt nevronal celledød skyldes oksidativt stress, og en rekke studier har vist at ROS forverrer alvorlighetsgraden av hjerneslag og nevrologisk skade. Selv om kliniske studier ikke har gitt tilfredsstillende resultater, er nevrobeskyttelse fortsatt en lovende strategi for behandling av akutt iskemisk hjerneslag. Derfor er det en fordel for slagpasienter å finne effektive nevrobeskyttelsesmedisiner for å behandle slag.

Tradisjonell kinesisk medisin (TCM) tar tiltak for å gripe inn mot kroppens indre ubalanse. På grunn av den komplekse patogenesen av iskemiske slag, spiller den multifaktorielle effekten av TCM og dens aktive bestanddeler en kritisk rolle i behandlingen av slag.Cistanchedeserticola YC Ma, utbredt i tørre eller halvtørre områder i hele Mongolia og Nordvest-Kina, har vært en mye brukt TCM-urt for behandling av ulike sykdommer som glemsel og depresjon i mer enn 1,000 år i Kina. Moderne farmakologiske studier indikerte at råekstraktene fra C. deserticola viste flere farmakologiske aktiviteter, som f.eks.forbedre lærings- og hukommelsesfunksjon, nevrobeskyttelse, immunitet, antioksidant, anti-aldring og antifatigue effekter. Kjemisk analyse av C. deserticola viste at dens hovedbestanddeler inkludererfenyletanoidglykosider, iridoidglykosider, polysakkarider og oligosakkarider. Imidlertid er de aktive komponentene i C. deserticola for hjernebeskyttelse ikke veldig klare.

Den nevrobeskyttende egenskapen til C. deserticola innebærer dets terapeutiske potensiale ved kognitiv-relaterte sykdommer som slag og depresjon, samt Alzheimers sykdom. Forskning på virkningen av C. deserticola på slag, inkludert dens aktive komponenter og virkningsmekanismer, er imidlertid svært begrenset. I det nåværende arbeidet undersøkte vi den beskyttende effekten av tre ekstrakter fra C. deserticola, totale glykosider (TG-er, fenyletanoidglykosider og andre glykosider), polysakkarider (PS-er) og oligosakkarider (OS-er) på cerebrale I/R-skader. Våre funn kan bidra til nøyaktig klinisk anvendelse av C. deserticola og gi et kandidatmiddel foriskemisk slagterapi.

MATERIALER OG METODER

Kjemikalier og reagenser

Stilkene til Cistanche deserticola ble kjøpt fra Alashan, Indre Mongolia, og identifisert av en av forfatterne (P.-F. Tu). TG-er, PS-er og OS-er ble utarbeidet i henhold til vår tidligere rapporterte metode. Kvantitativ analyse av TG ble utført ved høyytelses væskekromatografi (HPLC) som tidligere beskrevet, og kromatogrammet er vist i figur 1. Hovedkomponentene til TG er echinacosid, tubulosid A, acteosid, isoacteosid og 2'-acetylacteosid; deres innhold er henholdsvis 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g og 12,045 mg/g. Innholdet av PS-er og OS-er er henholdsvis 69,42 % og 65,24 %, bestemt ved henholdsvis HPLC og fenol-svovelsyreanalyse.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR BEHANDLING AV ISKEMISK STROKE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Standardreferansene for echinacosid (A0282), tubulosid A (A0942), acteosid (A0280), isoacteosid (A0281) og 2'-acetylacteosid (A0943) ble kjøpt fra Chengdu Must Biotechnology. Renheten til alle standarder er mer enn 98%. Nissl stain H&E-sett ble kjøpt fra Boster. Edaravone (T0407-1) ​​ble kjøpt fra Target Mol (Shanghai, Kina). Kanin anti-rotte MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) og mus anti-rotte CD31 (ab24590) ble kjøpt fra Abcam Inc. Rabbit anti-rotte Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) og Occludin (BS72035) ble kjøpt fra Bioworld Technology. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) var kilden til kanin anti-rotte Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) ble kjøpt fra Proteintech Group, Inc. Sekundære antistoffer ble levert av Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, Kina). Hoechst 33258 ble hentet fra Beyotime.

Dyr

Sprague-Dawley-rotter (hann, veier 250–300 g) ble hentet fra Vital River Laboratory Animal Technology og holdt i et luftkondisjonert rom holdt på en 12 timers lys/mørke-syklus. Alle dyreforsøk ble utført av dyreforskningen ARRIVE-retningslinjene, og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Peking University Health Science Center.

Dyreforsøksprotokoller

Rottene ble utsatt for MCAO/R, som tidligere beskrevet (Wang et al., 2018). Kort fortalt ble den venstre felles halspulsåren (CCA), den eksterne halspulsåren (ECA) og den indre halspulsåren (ICA) eksponert, og en 3-0 nylon monofilamentsutur ble satt inn fra ECA inn i ICA til den nådde midten cerebral arterie (MCA). Etter 1,5 time med MCA-okklusjon ble reperfusjon simulert ved å fjerne filamentet. Under den kirurgiske prosedyren ble kroppstemperaturen til alle rottene holdt på 37,0 grader. Legemiddel

Administrasjon

Rottene ble tilfeldig delt inn i seks grupper ved å bruke SPSS-programvaren versjon 22.0 som beskrevet: normal gruppe (NOR); modellgruppe (MOD); edaravongruppe (positivt medikament, 6 ml/kg, EDI); TGs-gruppe (280 mg/kg, TGs); PSs-gruppe (280 mg/kg, PSs) og OSs-gruppen (280 mg/kg, OSs). TG-er, PS-er og OS-er ble administrert en gang om dagen etter MCAO/R i 14 dager. NOR- og MOD-gruppene ble behandlet med vanlig saltvann. Dyrenes tall er vist i tabell 1.

Måling av vekt og modifisert nevrologisk underskuddscore (mNSS)

Kroppsvekten ble overvåket på den 14. dagen ved bruk av en ADVENTURE™ Digital Scale (OHAUS, New Jersey, USA). mNSS ble vurdert i henhold til metoden beskrevet av FJ Wang (Wang et al., 2018), med mindre revisjoner.

2, 3, 5-Trifenyltetrazoliumklorid (TTC)-farging

Infarktvolum ble målt som beskrevet tidligere. Kort fortalt ble hjernen delt inn i syv koronale blokker (2 mm). Disse seksjonene ble farget med 2% TTC ved 37 grader i 15 minutter. Infarktvolum (%)=(ipsilateral ischemisk hemisfærevolum - kontralateral iskemisk hemisfærevolum)/kontralateral iskemisk hemisfærevolum × 100.

Nissl og H&E Staining

Rottene ble dypt bedøvet, og hele hjernen ble deretter raskt fjernet fra hodeskallen fiksert ved bruk av 4% paraformaldehyd innebygd i parafinvoks og delt i skiver med 7 µm tykkelse. Seksjonene ble farget med Nissl og H&E. I denne studien ble seks tilfeldige 200 × 200 µm felt fanget i hver vevsprøve med et lysmikroskop. Antallet Nissls kropper ble talt med IPP-programvareversjon 6.0.

Evans Blue Assay

Rotter ble injisert med 2 % EB etter MCAO/R. To timer senere ble rottene bedøvet og hele hjernen ble deretter raskt fjernet og homogenisert i aceton. Supernatantene ble analysert ved 620 nm av en 800 TS absorbansleser.

Måling av aktivitetene til katalase (CAT), superoksiddismutase (SOD), malondialdehyd (MDA) og glutationperoksidase (GSH-Px)

Alle serumprøver ble sentrifugert ved 4,000 × rpm i 15 minutter ved 4 grader og deretter analysert for å oppdage aktivitetene til MDA, CAT, SOD og GSH-Px i henhold til produsentens instruksjoner.

Western blotting-analyse

Hjernevev (100 mg) samlet fra hver rotte ble homogenisert og lysert i RIPA-lysebuffer og deretter analysert for å påvise proteinkonsentrasjonen ved bruk av et BCA-sett. Totalt vevsproteiner ble lastet på 10% SDS-PAGE-geler og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen ble blokkert ved bruk av 5 % skummet melk, deretter inkubert over natten med primære antistoffer ved 4 grader. Membranen ble deretter inkubert med et sekundært antistoff. Western blot-analyse ble analysert ved bruk av Kodak Digital Imaging System.

Immunfluorescerende analyse

Immunfluorescensfarging for CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 og Keap-1 ble utført. Primære antistoffer mot Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 og Keap-1 ble fortynnet til 1 :200 og 1:100, henholdsvis. De sekundære antistoffene til Alexa Flur 488 mus anti-kanin IgG og rhodamine (TRITC) geit anti-kanin IgG ble begge fortynnet til 1:200. Kjernene ble farget av Hoechst 33258. Bilder ble tatt med Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA). Proteinuttrykket ble analysert ved bruk av IPP-programvareversjon 6.0. Statistisk analyse

Alle data ble beskrevet som gjennomsnitt ± SD. SPSS-programvareversjon 22.0 ble utført for statistisk analyse. Enveis ANOVA ble brukt ved sammenligning av ulike grupper. P < 0.05 ble ansett for å være den statistiske forskjellen.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR ANTI-ISKEMISK SYKDOM PHGS75% ECH 30% ACT 12%

RESULTATER

TG-er øker kroppsvekten og reduserer hjerneskader hos MCAO/R-rotter

Etter 14 dagers kur med TG-er, PS-er, Oss og EDI ble kroppsvektene, nevrologiske mangler og infarktvolumene til I/R-rotter evaluert. Resultatene viste at kroppsvektene i MOD-gruppen ble kraftig redusert, mens de reduserte vektene i TG-, PS- og EDI-gruppene ble økt (Figur 2A). Nevrologiske underskuddskår ble betydelig redusert av EDI og TG-er (figur 2B). Hjerneskivene i NOR-gruppens rotter var dyprøde og det var ingen infarkter, mens rottene i MOD-gruppen viste et stort ipsilateralt hjerneinfarkt. Etter TGs-behandling ble infarktvolumene betydelig redusert (figur 2C, D). PS- og OS-behandlingen viste ingen åpenbar effekt på indeksene ovenfor. Dataene ovenfor viste at TG-er markant kunne lindre den I/R-induserte cerebrale skaden, men PS-er og OS-er kunne ikke.

TG-er forbedrer histopatologisk skade hos MCAO/R-rotter

For å bestemme noen av effektene av TG-, PS- og OS-behandling på histopatologisk skade, ble H&E-farging gjort for å avsløre patologisk skade. De histomorfologiske strukturene til hjerner i NOR-gruppen ble arrangert regelmessig. Morfologiendringene i TGs-gruppene var mindre enn de i MOD-gruppen. Imidlertid viste PS- og OS-behandlingsgruppene ingen signifikant forbedring av morfologiendringene (figur 3).

TG-er demper nevronal skade etter I/R-induserte rotter

Nissl-farging viste histopatologiske forandringer av nevroner i penumbra i det iskemiske området. Som vist i figur 4 hadde de normale nevronene en klar nukleolus og intakt struktur. I MOD-gruppen hadde nevronene forstørrede intercellulære rom. Nissl-kroppene forsvant, krympet og dypt flekkete. Imidlertid ble disse endringene sjelden observert i EDI-, TG- og PS-gruppene. Disse resultatene illustrerte at TG-er og PS-er kunne betydeligdempe iskemi/reperfusjon-indusert nevronal skade.

TG-er demper BBB-avbrudd etter I/R-behandlede rotter

Evans blue assay er en klassisk metode for å undersøke endringen av BBB-permeabilitet. Eksperimentresultatene viste at økt Evans-blått ble observert i MOD-gruppen, mens det var signifikant redusert Evans-blått i TG-er og EDI-behandlede rotter. Dessuten var det ingen signifikant forskjell mellom PSs og OSs terapigrupper (figur 5). Disse resultatene antydet at TG-er kunne redusere BBB-forstyrrelser betydelig.

TG-er fremmer angiogenese hos I/R-skadde rotter

Nyere studier viser at angiogenese spiller en kritisk rolle i nevrologisk funksjonell utvinning og prognostiske utfall etter akutt iskemisk hjerneslag (Yuen et al., 2015). For å evaluere effekten av TG-er, PS-er og OS-er på angiogenese, ble CD31 og a-SMA brukt til å kvantifisere kapillærtallene. Immunfluorescensfarging viste at MOD-gruppen forårsaket en bemerkelsesverdig reduksjon i uttrykkene av CD31 (figur 6A, B) og a-SMA (figur 6C, D) i penumbra i iskemiske områder av I/R-rotter, sammenlignet med normale rotter . Dette resultatet illustrerte at I/R kunne forårsake vaskulær skade i cortex penumbra på iskemiske hemisfærer. Imidlertid økte TG-er og EDI-behandling bemerkelsesverdig kapillærtetthet, angiogenese og arteriogenese som indikert av økte uttrykk for CD31 og a-SMA. Disse resultatene tyder på at TG-er kan fremme angiogenese i den iskemiske penumbraen til I/R-rotter, men PS-ene og OS-ene kunne ikke.

TG-er øker uttrykket av Tight Junction-proteiner i I/R-skadde rotter

BBB-forstyrrelser kan øke hjernens vanninnhold og hevelse i vevet, noe som fører til hjerneskade. Tight junction-proteiner er viktige strukturelle komponenter i BBB. For å teste om TG-, PS- og OS-behandling etter hjerneslag kan påvirke BBB-integritet, ble uttrykkene av ZO-1, claudin-5 og occludin utført ved immunfluorescensanalyse. Resultatene indikerte at uttrykkene claudin-5, occludin og ZO-1 var synlig redusert i MOD-gruppen. Imidlertid økte de betydelig etter 14 dager etter administrering. PS- og OS-grupper viste ingen signifikante endringer i disse proteinuttrykkene (figur 7). Disse dataene indikerte at TG-ene kan regulere tight junction-proteinuttrykk og sannsynligvis opprettholde BBB-integritet etter I/R-skade.

TG-er øker pericyttdekningen på kapillærer hos I/R-skadde rotter

Pericytdekning på kapillærer spiller en kritisk rolle for å opprettholde BBB-integritet. Dermed testet vi om pericyttekningen kunne økes ved TG-, PS- og OS-behandling. Immunfluorescensintensitetsanalyseresultater viste at både PDGFRb- og CD31-uttrykk ble dramatisk redusert i MOD-gruppen. Administrering av TG-er til I/R-rottene gjenopprettet eller økte til og med ekspresjonsintensitetene til PDGFRb og CD31 betydelig, men ingen forskjell ble observert i PS- og OS-behandlingsgruppene (figur 8). Dermed kan behandling av TG-er øke pericytdekningen betydelig. Disse funnene bekreftet videre at TG-er kan opprettholde integriteten til BBB etter I/R.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FOREBYGGING AV ISKEMISK SLAG PHGS75% ECH 30% ACT 12%