Abstrakt:BrukerCistanche DeserticolaParasitisering av to vertsplanter (Haloxylon Ammodendron og Atriplex-canescens) Som testmaterialer, bestemte denne studien polysakkaridinnholdet i C. Deserticola fra forskjellige verter ved bruk av fenol-sulfurinsyre-metoden. Transkriptomsekvensering og analyse av haloxylon-cistanche ogAtriplex-Cistanche Associationsble gjennomført ved bruk av Illumina Novaseq 6000 Sequencing -plattformen. Forskningen fokuserte på å undersøke transkriptomforskjeller i C. Deserticola fra forskjellige verter, screening av nøkkel enzymatiske gener involvert i polysakkaridmetabolisme, og validere de valgte genene gjennom QRT-PCR-verifisering. Denne studien tar sikte på å gi et teoretisk grunnlag for å utforske nye vertsplanter og genetisk forbedring av C. Deserticola. Resultatet viste at polysakkaridinnholdet som ble funnet i atriplex quadriptera-c.deserticola var overlegen den til stede i haloxylon ammodendron-C. Deserticola. Gjennom komparativ analyse av transkriptom ble 14089 differensialt uttrykte gener (DEG) screenet fra de kjøttfulle stilkene til atriplex quadriptera-C. Deserticola og Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola. Resultatene fra KEGG -berikelsesanalyse avdekket at disse DEG -ene var mest fremtredende beriket i veier relatert til karbohydratmetabolisme, galaktosemetabolisme, aminosyremetabolisme og fettsyremetabolisme. Videre ble totalt 26 deg oppnådd fra fire traséer relatert til polysakkaridmetabolisme, hvorav ekspresjonsnivåene av fruktosidase -gen og -galaktosidasegen i haloxylon ammodendron -C. Deserticola var betydelig høyere enn de i Atriplex Quadriptera-C. Deserticola. Ekspresjonsnivåene av UDP-glukosedehydrogenase-gen og mannose -1- fosfat guanylat transferase-gen i atriplex quadriptera-c. Deserticola var betydelig høyere enn i Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola, som kan være de viktigste enzymgenene for å regulere forskjellen på polysakkaridmetabolisme i C. ørkenicola.

Nøkkelord Cistanche Deserticola; transkriptomsekvensering; verter; forskjell på polysakkaridmetabolisme

Cistanche Deserticola

 

Cistanche Deserticola YC Ma, først og fremst distribuert iGansu, Xinjiang, Ningxia og indre Mongolia, er en tradisjonell kinesisk medisinsk urt som nylig er inkludert i"Medisin og mat homolog"katalog. Det har forskjellige helsemessige fordeler, for eksempeltonifisering av nyre yang, nærende essens og blod, og fremme avføring, gjør det mye brukt iMedisin, helsevesen og matindustrien[1]. På grunn av detheterotrofisk natur, Cistanche Deserticolaparasiterer forskjellige vertsplanter, medHaloxylon Ammodendronog den nylig introduserteSemi-eviggrønn buskAtriplex canescens(Pursh) Nutt.å være dets primære verter.

Polysakkarider er de viktigste aktive stoffene i evalueringCistanche Deserticolakvalitet. Under forskjellige vertsforhold,akkumulering og metabolsk sammensetningavCistanchePolysakkarider varierer betydelig [2]. Medisinsk forskning har vist detCistanchePolysakkarider besitterantioksidant, nevrobeskyttende, immunregulerende og hukommelsesforbedringFarmakologiske effekter, effektivt lindrerAlzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og leverdepresjonsindusert miltmangel[3]. Med fremskritt i moderneEkstraksjonsteknikker og multispektrumanalyseteknologier, TheInnhold, sammensetning og strukturelle egenskaperavCistanchePolysakkarider blir gradvis belyst, og utvider applikasjonene.

Når det gjelderMolekylærbiologiforskningpåCistanchearter, transkriptomsekvenseringsstudier har hovedsakelig fokusert påCistanche tubulosaogHaloxylon-Cistanchekomplekse systemer.For eksempel, for eksempelHou et al.[4] utførtfull lengde transkriptomsekvensering og genuttrykksprofileringavCistanche tubulosaBrukerPacbio og Bgiseq -500 RNA-Seq Technologies, identifisere237,772 unike transkripsjonerog screening nøkkel enzymgener involvert iFenyletanoid glykosidbiosyntese. Tilsvarende,Feng et al.[5] Gjennomførttranskriptomiske og metabolomiske analyserav haustoria og tilstøtende vev avHaloxylon røtter ogCistanchekjøttfulle stilker, avslører vertenes rolle i akkumulering avCistanchemetabolitter. Studien deres understreket atVertsanlegg påvirker ikke bare utbyttet avCistancheMen også dens kvalitet. Imidlertid, forskning påCistancheParasitisering av forskjellige vertsplanter er fortsatt begrenset.

Atriplex canescens, a dypt forankret og svært stressbestandig plante, skiller seg fra det tradisjonelleHaloxylon -vertog stammer frahalvtørre platåer i det sentrale USA. De siste årene har det blitt introdusert og promotert som enNy vert forCistanche DeserticolaDyrkingiNordvest -Kina. En Qing et al.[6] analysert og sammenlignetPolysakkaridakkumulering avCistancheParasitiserende haloxylon og atriplex canescensi samme produksjonsområde, å finneBetydelige forskjeller i polysakkaridinnholdmellom de to vertsforholdene.

Dermed tar denne studien som mål åsekvensere de kjøttfulle stilkene tilCistanche DeserticolaParasitiserende haloxylon og atriplex canescens, analysereDifferensialuttrykk av nøkkel enzymgener involvert i polysakkaridbiosyntese. Funnene vil gi enteoretisk grunnlag for videre forskning påCistanchePolysakkaridbiosyntesemekanismer, beriker transkriptomiske studier på atriplex-Cistanchesystemer, og fremme innovasjon i høy kvalitetCistancheGermplasmressurser.

 

Materialer og metoder

1.1 Eksperimentelle materialer

Cistanche DeserticolaPrøver parasitisererHaloxylon AmmodendronogAtriplex canescensble samlet fraCistancheDyrkingsbase iXiquan Town, Jingtai County, Gansu -provinsen(breddegrad36 grad 5 'n, lengdegrad103 grad 42 'e). BådeHaloxylonogAtriplex canescensble dyrket i samme miljø. Prøvene ble kategorisert somHaloxylon-Cistanche(Prøve a)ogAtriplex-Cistanche(Prøve h),med tre replikater for hver kategori (fem planter per replikat). Prøvetaking ble gjennomført iApril 2024, og prøvene ble identifisert somCistanche Deserticolakjøttfulle pærer avProfessor Guo YehongfraCollege of Agriculture, Gansu Agricultural University.

FølgeRetningslinjer for prøvetaking av Shanghai Oe Biotech Co., Ltd., TheCistancheFleshy stengler ble skylt med ultrapurvann, og overflødig fuktighet ble fjernet ved bruk av filterpapir. Tynne skiver ble hentet fratopp, midt og bunnav hver stilk, blandet grundig og plassert i kryogene hetteglass. Prøvene varraskt frosset i flytende nitrogentil2 timerFør du blir overført til en-80 grad fryserfor lagring [7].

1.2 Eksperimentelle metoder

1.2.1 Etablering av standardkurve og bestemmelse av polysakkaridinnhold

A 10 mgprøve avD-glukosestandardble nøyaktig veid og oppløst i en100 ml volumetrisk kolbemed destillert vann for å tilberede en100 ug · ml⁻ stamløsning. Kalibreringsløsninger av{{0}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 7, 0. 8 og 0,9 mlav stamløsningen ble overført til10 ml stoppede testrør, fortynnet med vann til1. 0 ml, og deretter blandet med1. 0 ml av 6% fenolløsningog5 ml konsentrert svovelsyre. Etter virvling ble løsningene oppvarmet i et kokende vannbad for20 minutter, deretter avkjølt i et isvannsbad for10 minutter. A blank kontrollble utarbeidet ved hjelp av1. 0 ml destillert vanni stedet for glukoseløsningen. Absorbansen ble målt ved482 nmBruke enUV-vis spektrofotometer, og astandardkurveble generert medkonsentrasjon (x) som den horisontale aksenogabsorbans (y) som den vertikale aksen.

Etter en modifisert tilnærming fraLi Jie et al. [8], 0. 2 g tørketCistanchepulverble nøyaktig veid og plassert i en20 ml stoppet testrør. 10 ml 80% etanolble tilsatt, og blandingen ble utsatt forUltrasonisk ekstraksjon ved 80 grader (100 W, 40 kHz) i 30 minutter. Ekstraktet ble filtrert mens varmt og prosedyren ble gjentatt en gang. Etter å ha tørket resten,10 ml destillert vannble tilsatt, og ultralydekstraksjon ble gjentatt to ganger. Filtratene ble kombinert og fortynnet til20 mlmed destillert vann.1. 0 ml av denne løsningenble ytterligere utvannet til10 mlmed destillert vann.

A 1. 0 ml alikvotav de forberedteCistanchePrøveløsning ble analysert ved bruk av samme prosedyre som glukosestandarden. Absorbansen på482 nmble målt, og polysakkaridinnholdet iCistanchefra forskjellige vertsplanter ble beregnet.

1.2.2 RNA -ekstraksjon, cDNA -bibliotekskonstruksjon og sekvensering

Totalt RNA ble ekstrahert fraCistanche DeserticolaPrøver parasitisererHaloxylon AmmodendronogAtriplex canescensBrukeTiangen DP441 RNA Kit (Kina), følgeTRIZOL -reagensprotokoll. RNA -renhet ble vurdert med enNanodrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA), mens RNA -konsentrasjon og integritet ble evaluert ved bruk av enAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA).

Transkriptombiblioteker ble konstruert ved hjelp avVAHTS Universal V6 RNA-Seq Library Prep Kit. Etter kvalitetskontroll medAgilent 2100 Bioanalyzer, bibliotekene ble sekvensert påIllumina Novaseq 6000 plattform, generere150 bp sammenkoblede leser.

1.3 Dataanalyse

1.3.1 Transkriptommontering og funksjonell merknad

Raw leser innFastQ -formatble behandlet ved bruk avTrimmomatiskå fjernePloy-n leser og leser av lav kvalitet, noe som resulterer iRen leser. Adaptersekvenser og regioner av lav kvalitet ble fjernet, og de rene lesene ble samlet inn iContigs(uttrykte sekvensmerker) ved bruk avTrinity -programvare. Den lengste transkripsjonen fra hver klynge ble valgt som enunigenefor videre analyse.

Funksjonell merknad av unigenes ble utført ved å sammenligne dem motNCBI ikke-redundant (NR) proteindatabase, sveitsisk-prot og evolusjonær genealogi av gener: ikke-overvurderte ortologe grupper (eggnog) databaseBrukerDiamond Software (e-verdi <1e -5)). Eukaryotiske ortologe grupper (KOG) merknadble utført for å identifisere homologe gener. I tillegg ble unigenes kartlagt tilKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) stierfor metabolsk trase -merknad.Gene Ontology (GO) klassifisering og funksjonell merknadble utført ved hjelp av kartlegginger fra Swiss-Prot-databasen.

1.3.2 Genekspresjonsanalyse og identifisering av differensialt uttrykte unigenes (DEG)

Genekspresjonsnivåer ble kvantifisert ved bruk avBowtie2For å justere rene leser til unigenes. Ekspresjonsverdiene ble beregnet somFragmenter per kilobase transkripsjon per million kartlagte leser (FPKM)BrukerExpress -programvare. Differensiell ekspresjonsanalyse ble utført ved bruk avDESEQ2 -programvare, medNegative Binomial Distribution (NB) testerbrukt til signifikansetesting. Differensialt uttrykte gener (DEG) ble definert som de medq-verdi <0. 05ogFold Change (FC)> 2.

1.3.3 QRT-PCR-validering av differensialt uttrykte gener

Keyenzymgener involvert iPolysakkaridbiosyntesemedbetydelig differensialuttrykkble valgt forKvantitativ validering av sanntids PCR (QRT-PCR). RNA-prøver ble kvalitetssjekket, og OD-verdier ble målt før omvendt transkripsjon. cDNA -syntese ble utført ved bruk avTransscript alt-i-ett første-streng cDNA-syntese supermix for QPCR-sett. Det syntetiserte cDNA ble fortynnet10- brett, og QRT-PCR ble gjennomført ved bruk av enFluorescerende QPCR -systemunder forskjellige sykkelforhold.ACTB (beta-actin) ble brukt som et internt referansegen, og relative genuttrykknivåer ble beregnet ved bruk av2⁻ΔΔCT -metoden.

 

Tabell 1 Primersekvenser

Gen -id	Gennavn	Fremover primer (5 '-3')	Omvendt grunning (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2	GMPP	GatAgTggctacaacatccact	CCTCCTCTTCGTCGTAGGATTC
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2	PFP	Tatatgggaccatggaaccaa	GACCATAGGCCGTGATCGATC
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1	Ugdh	AAAGATCTTCCAGTTCGTAAGC	Accaattcgttgatgctacc
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1	lacz	GTCTCCTTGTTATTCGTGAGGAT	GTCGATGGTGGTGAAGCAGAT
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1	Saca	Ttacgaggatagtgaggtgcta	Aatggaagatgaggaggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2	lacz	GGCACAGTCAAGGAGTACGATG	Cactggcatcgacgaggaaag
-	ACTB	Caatggatgatgatatcgccgcgt	Cactggcatcgacgaggaaag

 

 

1.4 Dataanalyse

Hierarkisk klyngeanalyse avDifferensialt uttrykte gener (DEG)ble utført ved hjelp avR (v3.2.0)For å visualisere genuttrykksmønstre på tvers av grupper og prøver. GO (Gene Ontology) berikelsesanalyse ogKEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Pathway Anrichment Analyseble gjennomført ved bruk avR, basert påHypergeometrisk distribusjon. De betydelig berikede funksjonelle begrepene ble vist ved bruk avStangdiagrammer, bobleplott og berikelsessirkel tomter.

2 resultater og analyse

2.1 Resultater av polysakkaridinnhold

Den lineære regresjonsligningen oppnådd fra absorbansmålingene var:

y {{0}}. 0 154x --0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. 0154x - 0. 1636 \ quad (R^2=0. 9963) y =0. 0154x - 0.1636 (r 2=0. 9963)

med et lineært område på20–90 ug · ml⁻. Presisjon, repeterbarhet, stabilitet og utvinningsgrad var{{0}}. 38%, 0. 86%, 0,53%og 99,67%, henholdsvis.

Den måltePolysakkaridinnholdiCistanche DeserticolaPrøver fra forskjellige vertsplanter var:

Haloxylon-Cistanche: 6.51%

Atriplex-Cistanche: 11.83%

2.2 Transkriptomsekvensering og dataenhet

Transkriptomsekvensering avSeks prøvergenerert totalt41,77 g rene data. Gyldige data per prøve varierte fra6,89 g til 7,04 g, medQ30 Basisprosent mellom 95,38% og 95,91%, og enGjennomsnittlig GC -innhold på 45,13%.

Totalt61.423 UNIGENESble samlet, med en total lengde på65.962.858 bpog enGjennomsnittlig lengde på 1.073,91 bp.

2.3 Genfunksjonell merknad

Totalt61.423 UNIGENESble oppnådd fra sekvensering avCistanche DeserticolaPrøver som parasiterer to forskjellige vertsplanter. Merknadsresultatene er som følger:

30.689 UNIGENES (49,96%)ble kommentert iNR (ikke-redundant) proteindatabase.

18.698 UNIGENES (30,44%)ble kommentert iSwiss-Prot-databasen.

3.998 UNIGENES (6,51%)ble kommentert iKEGG -database.

17.188 UNIGENES (27,98%)ble kommentert iKOG (Eukaryote ortologe grupper) database.

25.280 UNIGENES (41,16%)ble kommentert iEggnog (Evolutionary Genealogy of Genes: Non-Supervised Orthologe Groups) Database.

16.210 UNIGENES (26,39%)ble kommentert iGo (Gene Ontology) database.

16.153 UNIGENES (26,30%)ble kommentert iPFAM (proteinfamilier) database.

Blant disse,21.650 UNIGENESvar lengre enn1 kb.

Homologianalyse basert påNR -databaseavslørte at de tre mest nært beslektede artene var:

Paulownia Fortunei (30,23%)

Phteirospermum japonicum (14,15%)

Chenopodium quinoa (7,1%)

 

 

Tabell 2 Annotasjonsinformasjon avCistanche DeserticolaGenfunksjon

Database	Merknadsgenummer	Proporsjon (%)
Nr	30,689	49.96
Sveitsisk-prot	18,698	30.44
Kegg	3,998	6.51
Kog	17,188	27.98
eggnog	25,280	41.16
GÅ	16,210	26.39

 

 

2.4 GO og KEGG Funksjonell merknad og klassifisering

DeGo (Gene Ontology) databaseble brukt til å kommentere unigenes som er identifisert iNR -database, noe som resulterer i totalt16.210 UNIGENES. Disse unigenene ble kategorisert iTre viktigste funksjonelle grupper:

Biologisk prosess (BP)

Molekylær funksjon (MF)

Cellular Component (CC)

Ibiologisk prosess (BP) kategori, de mest tallrike Unigene -klyngene var:

"Cellular prosess" (11.023 UNIGENES)

"Metabolsk prosess" (9 117 UNIGENES)

ForCellular Component (CC) kategori, 17 Underkategorierble identifisert, med hver underkategori som inneholdt minst30 unigenes. De største klyngene var:

"Celle" (13.947 UNIGENES)

"Celledel" (13.918 UNIGENES)

IMolekylær funksjon (MF) kategori, de mest berikede funksjonelle gruppene var:

"Binding" (10.039 UNIGENES)

"Katalytisk aktivitet" (8.490 UNIGENES)

Fig.2 Gå funksjonell merknad og klassifisering av unigenes

 

KEGG funksjonell merknad og klassifisering

I løpet avtranskriptomsekvensering, totalt3.998 UNIGENESble kommentert iKegg (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Database. Disse unigenene ble klassifisert iSeks primære kategorier, med sine respektive unigene -tellinger og proporsjoner som følger:

Cellulære prosesser: 326 UNIGENES (8.15%)

Miljøinformasjonsbehandling: 299 UNIGENES (7.47%)

Genetisk informasjonsbehandling: 1 771 UNIGENES (44.30%)

Menneskelige sykdommer: 14 UNIGENES (0.35%)

Metabolisme: 1 465 UNIGENES (36.64%)

Organismale systemer: 123 UNIGENES (3.07%)

Disse seks primære kategoriene ble videre delt inn i20 sekundære klassifiseringsnivåer. Blant dem,Genetisk informasjonsbehandlinghadde den høyeste andelen, etterfulgt avMetabolisme. InnenforMetabolismeKategori, de mest tallrike stiene var:

Karbohydratmetabolisme

Fettsyremetabolisme

Flavonoid metabolisme

Fig.3 KEGG Metabolic Pathway Annotation of Unigenes

 

2.5 Differensialgenuttrykk og anrikningsanalyse avCistanche Deserticolafra forskjellige verter

Transkriptomsekvenseringsdata ble filtrert ved bruk avStandard differensialuttrykksvalgskriterier, noe som resulterer i identifisering av14.089 Differensialt uttrykte gener (DEG):

6.576 gener ble oppregulert

7 513 gener ble nedregulert

A Volcano plotble generert for å visualisere den totale fordelingen av DEG -er.

ITopp 30 GO -berikelsesfunksjonsklassifiseringerav degs, ble det observert at:

Sammenlignet medBiologisk prosess (BP)ogCellular Component (CC)kategorier,Molekylær funksjon (MF)viste en mer betydelig DEG -berikelse.

De mest bemerkelsesverdige DEG -ene var assosiert medNukleinsyremetabolisme, proteinmetabolisme og nøkkelenzymer i galaktosemetabolisme.

I tillegg ble DEGs betydelig beriket innGO -vilkår relatert til polysakkaridmetabolisme, inkludert:

Stivelsesmetabolsk prosess

Glykogenbiosyntetisk prosess

Sukrose katabolsk prosess

Glukosidaseaktivitet

UDP-L-Rhamnose syntaseaktivitet

Polysakkaridhydrolaseaktivitet

Fig.4 Vulkansk kart over differensialt uttrykte gener

 

KEGG -baneranrikningsanalyse av DEG -er iCistanche Deserticolafra forskjellige verter

For ytterligere å undersøkeDifferensialt uttrykte gener (DEG)iCistanche Deserticolafra forskjellige vertsplanter,KEGG Pathway -berikelsesanalyseble utført. Analysen avdekket at:

Degs ble kartlagt til 117 metabolske veier.

DeTopp 20 stiervistebetydelig DEG -berikelse, med de mest berikede traséene inkludert:

Fettsyremetabolisme

-Linolensyre metabolisme

Galaktosemetabolisme

Lysinforringelse

En ytterligere berikelsesanalyse avTopp 20 metabolske kategorier med de minste Q-verdieneindikerte at DEG -er var betydelig beriket i:

Organismale systemer

Metabolisme

Genetisk informasjonsbehandling

Blant disse kategoriene,"Metabolisme"Hadde det høyeste antallet berikede DEG og viste den viktigste berikelsen. I tillegg, i de berikede metabolske traséene,andelen oppregulert og nedregulert unigenes var nesten lik.

Disse funnene antyder detMetabolske veier spiller en avgjørende rollei differensialgenuttrykk avCistanche Deserticolafra forskjellige vertsplanter, spesielt iLipid, karbohydrat og aminosyremetabolisme.