Behandling for steiner i nyrene: G. Fruticosus
Mar 22, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
DEL Ⅰ: Evalueringer av den helbredende effekten av G. fruticosus løsemiddelekstrakter i eksperimentelt induserte nefrolithiatiske Wistar hannrotter
Tilahun Alelign, Tesfaye Sisay Tessema, Asfaw Debella og Beyene Petros
Bakgrunn
Urolithiasis(steineri urinveiene) påvirker rundt 12 prosent av verdens befolkning på et tidspunkt i livet [1]. Andre studier rapporterte at den verdensomspennende utbredelsen avnyresteinvarierer mellom 2 og 20 prosent [2, 3]. Urolithiasis påvirker alle aldre, kjønn og raser[4,5], men det forekommer hyppigere hos menn enn hos kvinner mellom 20 og 49 år [6]. Patogenesen avnyresteinforblir ufullstendig forstått [7] og behandlingen er fortsatt en utfordring, selv om det finnes moderne behandlingsformer inkludert ESWL[8]. Hendelsesforløpet som utløsersteindannelse inkluderer kjernedannelse, vekst, aggregering og retensjon av krystaller i nyrene [9, 10].
Nyresteindannelse krever vedvarende oppbevaring av krystaller inyreretter fullføringen av krystalliseringsprosessen[11, 12]. Interaksjonen av COM-krystaller med en overflate av nyreepitelceller er en kritisk initierende hendelse ved nefrolithiasis [13]. Krystall-celle interaksjoner resulterer i bevegelse av krystallene fra den basolaterale siden av cellene til basalmembranen [14]. En studie på dyremodeller avslørte også at administrering av høye konsentrasjoner av CaOx-krystaller eller oksalationer ser ut til å være giftig, og forårsake skade på nyrenes tubulære celler [7]. Eksponering for høyere nivåer av oksalat eller CaOx-krystaller induserer epitelcelleskade, som er en disponerende faktor for den påfølgendesteinformasjon [15, 16].
En ubalanse mellomurinsteininhibitorer og promotere har blitt foreslått å være årsaken tilsteinformasjon [17]. Arrangører legger til rettesteindannelse [18], men inhibitorer reduserer initieringen av overmetning, kjernedannelse, krystallvekst og aggregeringshastighet [17]. Imidlertid virker inhibitorer likt for alle; derfor danner noen mennesker steiner; mens andre ikke gjør det [19]. Blant tilbakevendendesteinutskillelse av urinoksalat var høyere, mens sitratutskillelse var lavere. En studie indikerte også at oksalat kan lette reabsorpsjon av klorid, natrium og vann i de proksimale tubuli og aktivere flere signalveier i nyreepitelceller [20].
Til tross for betydelige forbedringer i medisinsk terapi som nytten av ekstrakorporeal sjokkbølgelitotripsi (ESWL), finnes det ikke noe tilfredsstillende medikament for å behandle nyrestein [21]. ESWL-behandling er assosiert med akutt nyreskade på grunn av den traumatiske effekten av sjokkbølgen, og infeksjoner etter behandling [22]. Det resulterer også i ufullstendigsteinklarering, og kan ikke unngå nyesteinformasjoner [23], ellersteinresidiv ofte opp til 60 prosent [24,25]. Etter den første episoden av enstein, er gjentakelsesraten mer enn 50 prosent innen 10-år [26,27]. Derfor,nyresteintilbakefall er en stor risiko, som anses som en uoppfylt klinisk utfordring innen urologiområdet [28].SteinDannende pasienter er utsatt for tilbakefall etter den første kirurgiske behandlingen [29]. Selv om de kjemiske sammensetningene til ensteinpåvirke valg av intervensjon [30], åpen kirurgi forblir bærebjelken i behandlingen [31]. Noen medisinske planter studert så langt mot urolithiasis er angitt i tabell 1
I Etiopia er de fleste pasienter avhengige av tradisjonelle medisinske planter som en alternativ terapi for ulike sykdommer, inkludert urolithiasis. Medisinplanter er rimelige, tilgjengelige, effektive, med færre bivirkninger, og er bedre kompatible med menneskekroppen [41], sammenlignet med konvensjonelle legemidler [42]. I denne studien,G. fruticosus(L.) ble valgt for å undersøke deres effekter på eksperimentelt indusert urolithiasis. En grundig litteraturundersøkelse ble utført for å fastslå at ingen av de utvalgte medisinske plantedelene har blitt studert så langt på anti-urolitiatiske aktiviteter. Til dags dato er det heller ikke rapportert tilstrekkelig vitenskapelig bevis på den antihelt-litiatiske aktiviteten til denne medisinplanten. Derfor var målet med studien å evaluere den helbredende effekten av medisinplanter i eksperimentelt induserte nefrolithiatiske hannrotter.
Tabell 1 Medisinplanter med anti-urolitiatiske effekter i tidligere studier
Materialer og metoder
Identifikasjon og innsamling av medisinsk plantematerialeGomphocarpusfruticosus(G. fruticosus) blader ble samlet under blomstrings- eller fruktingstiden. DeG.fruticosus(L)Ait.f, kjent som Tifriena (lokalt navn), ble samlet på Bole Bulbula rundt "93 Mazoria" Addis Abeba i løpet av oktober 2018.G. fruticosusL.Ait.f(Asclepiadaceae)(rapportert av nøkkelinformant) ble krevd for urolithiasis-behandling. Planteprøvene ble sendt til National Herbarium, Department of Plant Biology and Biodiversity Management, Addis Abeba University(AAU) for taksonomisk autentisering (TA238), og det tilsvarende samlingsnummeret ble gitt. Prøvene ble deponert i National Herbarium of AAU for fremtidige referanser.
Fremstilling av råekstraktet
Plantematerialene ble renset grundig med vann fra springen for å fjerne forurensninger og tørket i et skur ved romtemperatur fra 2 til 3 uker i Biomedical Sciences laboratorium, AAU. De tørkede plantedelene ble fint pulverisert ved bruk av en kjøkkenkvern (morter og stamper, ca. 9 tommer i diameter). Pulverene ble satt gjennom en sikt med 3 mesh-størrelser for å filtrere et grovt fast materiale.
Ekstraktene ble fremstilt ved å bruke en prosedyre som ligner på den som ofte brukes av tradisjonelle healere eller pasienter, med noen mindre modifikasjoner. Plantepulverene ble bløtlagt i destillert vann, som ble plassert på en shaker i 72 timer. Blandingen ble filtrert gjennom bomull/gasbind, deretter gjennom Whatman-filterpapir nummer 1 (porestørrelse: 1l μm) for å fjerne fine faste plantepartikler eller uløselige bestanddeler. Hele ekstraktene ble konsentrert til tørrhet ved hjelp av en frysetørringsmaskin ved å fjerne destillert vann under redusert trykk. Deretter ble de halvfaste konsentratene helt over i glasspetri-plater og fikk tørke helt i vannbad justert til 45 grader. De endelige tørkede ekstraktene ble samlet og lagret i merkede sterile flasker dekket med en tett propp og holdt i fryseren på -20 grader til den brukes i eksperimentene.
Forberedelser av suksessive løsemiddelekstraksjoner
Gomphocarpus fruticosusmoderekstrakt (vandig) ble delt med løsemidler med økende polaritet fra ikke-polare til polare løsningsmidler, noe som sikret at et bredere polaritetsområde av forbindelser kunne ekstraheres. Suksessiv ekstraksjon ble sekvensielt startet med petroleumseter, etterfulgt av kloroform, etylacetat, butanol og vann, hvori disse løsningsmidlene ble fjernet og konsentrert under en rotasjonsvakuumfordamper. Plantematerialene maserert i destillert vann ble lyofilisert under frysetørkeren for å oppnå de pulveriserte restene. De tørkede ekstraktene ble lukket tett med propp og lagret i glassflasker og oppbevart i kjøleskap ved -20 grader C inntil de ble brukt til eksperimentet.
cistanche deserticola fordel: behandle nyresykdom
Kjemikalier og reagenser/standard legemidler
Kjemikaliene og reagensene eller settene som ble brukt var analytiske kvaliteter kjøpt fra forskjellige kilder. Anskaffelsen av petroleumseter, kloroform, etylacetat, butanol og etanol var fra Wisteam PLC (Addis Abeba, Etiopia), kaliumdihydrogenfosfat (vannfritt), natriumfosfat (dibasisk vannfri ekstra ren), Tris-HCl buffer (CaHuNO), og natriumklorid (NaCl) ble kjøpt fra Micron International Trading House PLC (Addis Ababa Etiopia). Tilsvarende ble isofluran og formaldehyd kjøpt fra Neway Chemicals PLC (Addis Ababa, Etiopia). Etylenglykol (EG) og ammoniumklorid (NH, Cl) ble kjøpt fra Pharma PLC (Addis Abeba, Etiopia). EDTA-rør, serumseparatorrør, kapillærrør og kirurgiske blader ble kjøpt fra Micro Pharma PLC (Addis Abeba, Etiopia). Videre ble sett for lever- og nyrefunksjonstester kjøpt fra en Roshi PLC (London, England). Oksalat (oksalsyre) kolorimetriske analysesett og sitrat kolorimetriske/fluorometriske analyser kjøpt fra BioVision Incorporated-sett var (Milpitas, USA). Kaliumsitratpulver ble hentet fra Black Lion Referral Hospital (Addis Abeba, Etiopia). Cystone (polyurte-formulering) ble kjøpt fra Mumbi, India. Askorbinsyre, som ble kjøpt fra Micron International Trading House PLC (Addis Abeba, Etiopia).
Solubilisering av planteekstraktet og standardlegemidlene Testekstraktene/legemidlene i forskjellige konsentrasjoner ble oppløst ved bruk av passende vehikler, som var destillert vann og 3 prosent Tween 80. Alle planteekstrakter og kaliumsitrat ble oppløst i destillert vann kl. forskjellige konsentrasjoner. Prosedyren som ble brukt for å løse opp Cystone var lik metodene til Pha-tak og Hendre [43] og Garimella et al. [44] med noen modifikasjoner. Cystone-tabletter ble pulverisert ved å bruke en morter og støder (størrelse: 0,23 m), og oppløst (suspendert) i destillert vann (900 ul） og 100 ul av 3 prosent Tween 80 (det vil si 750 mg/ml). Deretter ble de holdt i 3 timer for å oppløses, sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter og filtrert gjennom 0,22 mm porestørrelse filterpapir. Den klare supernatanten ble samlet og brukt til kalsiumoksalat-kjernedannelse og aggregeringsanalyser. Ekstrakter ble samlet ved bruk av Falcon-rør ( 45 ml), lufttrammes og oppbevares i kjøleskap til eksperimentell bruk.Testekstraktene og standardmedisinene ble tilberedt daglig og kort tid før testadministrasjon med dose 200 mg/kg ekstrakt, 750mg/kg Cystone og 2,5g/kg av kaliumcitrat. Doseringsvolumet for teststoffet var 2 ml/100 g kroppsvekt. Avionisert vann ble brukt for å tilberede alle ekstrakter/legemidler og disse ble fremstilt daglig før testadministrasjon.
In vivo urolithiatiske farmakologiske undersøkelser
Måldyr: Friske voksne Wistar hann-albino-rotter av samme aldersgruppe mellom 8 og 10 uker og veiende (220-280g) ble brukt, kjøpt fra Ethiopian Public Health Institute (EPHI), og avlet på Biomed-ical Sciences animal laboratory, AAU. Eksperimentet ble utført ved Biomedical Sciences Laboratory ved AAU og EPHI, i samsvar med internasjonalt aksepterte standard retningslinjer for bruk av dyr i vitenskapelig forskning. Før forsøket startet ble rottene akklimatisert til standard laboratorieforhold (6 rotter per polypropylenbur) i 7 dager. De ble holdt under et kontrollert miljø med temperatur (27±2 grader), relativ fuktighet (55±5 prosent) og lys (12 timer lys/mørke sykluser). Disse rottene ble matet med vanlige pellets (standard diett) og fikk gratis drikkevann (ad libitum) i 28 dager.
cistanche deserticola fordel: behandle nyresykdom
Urolithiasis induksjon
Nyresteinble indusert ved bruk av etylenglykol (EG) sammen med ammoniumklorid (NHCl) administrert i rottens drikkevann. I denne hyperoksalurimodellen ble 1 prosent (w/v) NHACl gitt med 0,75 prosent (v/v)EG de første 5 dagene for å akselerere litiasis, etter dette ble vannforsyningen byttet til {{4 }}.75 prosent EG alene for de neste 25 dagene [45-47]. Eksponering av disse dosenivåene var tilstrekkelig tolererbar i dyrestudier [48]. EG-administrasjoner resulterer i hyperoksaluri, som igjen fører til CaOx-avsetning i nyrene [49]. Forsøksrottene tildelt somsteinkurative grupper mottoksteininduserende behandling i 28 dager.
Kurative effekter av urolithiasis
I den kurative behandlingen (oppløsning) ble totalt 54 al-bino Wistar hannrotter delt tilfeldig inn i 9 grupper bestående av 6 individer per gruppe med matchende kroppsvekter. I kurativ behandling ble sykdommen indusert på forhånd fra dag 1 til 14. Deretter ble hvert av ekstraktene/legemidlene administrert oralt fra dag 15 til 28 samtidig med sykdomsinduksjonsprotokoller (EG) for å bestemme kurative effekter [50, 51] . På slutten av 28. dager ble rotter ofret for biokjemiske og histopatologiske studier. Det eksperimentelle designet ble tildelt som gruppe I (normal kontroll), gruppe II (litia-tisk kontroll), gruppe I (K-Cit), gruppe IV (cystone), gruppe V (G. fruticosusPET-ekstrakt), Gruppe VI (G.fruti-koster Chl.-ekstrakt), Gruppe VI(G. fruticosusEtOAc-ekstrakt), gruppe VIII (G.fruticosus BuOH-ekstrakt), og gruppe IX(G. fruticosusEn q. brøkdel). Andre etterforskere ble også brukt kaliumsitrat (2,5 g/kg) som positiv kontroll [52, 53]. Doseringsvolumet var 2 ml/100 g kroppsvekt. Kontrollgruppen mottok destillert vann én gang daglig gjennom hele forsøket. På slutten av 28. dag ble rotter ofret for biokjemiske og histopatologiske studier.
Urinsamling og mikroskopisk analyse
Urin, serum og histologiske profiler er indikatorer påsteindannelse så vel som gjentakelser. Overfloden og morfologien til kalsiumoksalatkrystaller dannet under in vivosteininduksjoner ble undersøkt ved bruk av et lysmikroskop (Wagtech Thatcham Berkshire RG194QD, Storbritannia, 40x forstørrelse). Rotter ble plassert i separate metabolske bur og utsatt for 24 timers urinsamling på dag 28 for helbredende test [50]. I krystallurianalyse ble ca. 3 ml av de friske urinprøvene samlet inn i et glassrør og sentrifugert ved 3000 rpm i 10 minutter for å fjerne rusk, og supernatanter ble kastet. Disse urinsedimentene ble brukt til å bestemme CaOx-krystalldannelse. Omtrent 10 ul av de vortexede sedimentene ble plassert på et mikroskopglass (dekket med et dekkglass), og undersøkt for CaOx-krystaller med tanke på antall og størrelse under et lysmikroskop (40x). Krystallene dannet av kjemikalier i urinen ble nøye undersøkt fra andre urinartefakter. Fotografiene av mikroskopiske observasjoner ble tatt med et digitalkamera (Sony Cyber-shot DSC-W180 10.1MP med 3x optisk zoom, New Jersey, USA) manuelt montert på toppen av det.
Urin biokjemisk analyse
Ved slutten av de respektive behandlingsperiodene ble dyrene individuelt plassert i metabolske bur, og 24 timers urinprøver (forsuret og ikke-forsuret) ble samlet inn. Urinen ble surgjort med 1 ml 6N HCL (saltsyre) og lagret ved 4 grader i 5 dager. Deretter ble disse sentrifugert ved 3000 rpm i 10 minutter (REMI, R24), og supernatanten av surgjort urin ble brukt til å estimere ekskresjoner som oksalat-, kalsium-, magnesium- og fosfatinnhold. I ikke-forsuret urinprøve ble innhold som sitrat, kreatinin og urinsyre, og totale proteinkonsentrasjoner analysert ved bruk av kommersielt tilgjengelige diagnostiske sett av den automatiske kliniske kjemianalysatoren. Både oksalat- og sitratkonsentrasjoner ble analysert ved bruk av et flerbrønnsspektrofotometer (ELISA-leser) i henhold til håndboken som fulgte med settene. For å kvantifisere ble det utarbeidet en kalibreringskurve ved bruk av oksalat- og sitratsett som standard.
Seruminnsamling og analyse
Etter slutten av forsøksperioden (dag 28.) ble rottene bedøvet ved bruk av isofluran og 3 ml blodprøver ble samlet fra retro-orbitalvenen ved kapillær punktering. Serum ble separert etter sentrifugering ved 3000 rpm, 20 grader i 15 minutter. Det innsamlede serumet ble undersøkt for biokjemiske parametere som kreatinin, blod urea nitrogen, urinsyre, urea, kalsium, magnesium og fosfat av Clinical Chemistry Auto-analyzer (Cobas 6000 analysator, Tyskland) med de respektive diagnostiske settene. Oksalat- og sitratkonsentrasjonene i flere brønner bestemt ved bruk av 1 var spektrofotometer (ELISA-leser) i henhold til håndboken som følger med settene. For å kvantifisere ble det utarbeidet en kalibreringskurve ved bruk av oksalat- og sitratsett som standard.
cistanche deserticola fordel: anti-inflammasjon
Nyrehomogenatanalyse
Ved slutten av forsøksperioden (dag 28.) ble rotter avlivet under isofluranbedøvelse, etterfulgt av cervikal dislokasjon. Deretter ble buken åpnet og begge nyrene samlet fra hver rotte. De isolerte nyrene ble forsiktig fjernet og renset (vasket/skyllet) fra fremmede vev med en iskald fysiologisk saltløsning (0,15 M NaCl). De venstre nyrene fra hvert dyr ble konservert i 10 prosent bufret nøytralt formalin og brukt til histologiske studier. De høyre nyrene ble skåret i to like halvdeler ved hjelp av et blad, og halvparten tørket ved 80 grader i varmluftsovn. Metoden som ble brukt var lik Ashok et al. [35] med noen modifikasjoner, der en fast vekt på 200 mg (29 prosent) av den totale nyrens gjennomsnittlige vekt (0,67 g) ble ytterligere oppvarmet separat i 10 ml 1N saltsyre (1 prosent HCl), som ble plassert i et kokende vannbad på 100 grader C i 30 min. Deretter ble den finhakket i stykker ved hjelp av et blad, krasjet med støder og morter, og videre homogenisert i 10 minutter ved bruk av Ultra-Sonicator. Homogenatet ble sentrifugert ved 3000 rpm i 15 minutter, og supernatanten ble samlet opp ved å bruke merkede Cryotubes. Til slutt ble supernatantene brukt for estimeringer av kalsium-, oksalat- og fosfatinnhold med kommersielt tilgjengelige biokjemiske sett (BioVision PLC, USA), i henhold til produsentens protokoll [54,55].
Histopatologiske undersøkelser
Histopatologiske undersøkelser ble gjort for nyrevev fra forsøksrottene. Alle rottene ble avlivet på en human måte ved bruk av isofluran-anestesi på slutten av den 28. dagen (kurative studier av urolithiasis). Vevsstykkene ble tatt fra nyrene og analysert for urolithiatiske helbredende potensialer av planteekstrakter. Vevene ble fiksert med 10 prosent bufret nøytral formalinløsning, og deretter innleiret i parafinvoks. Seksjonene (5 μm tykke) ble kuttet ved hjelp av Rotary Microtome 4060E (Tyskland), montert på glassplater og farget med Hematoxylin og Eosin for å studere de histopatologiske endringene [34]. Alle felt av vevsmorfologien ble undersøkt under et lysmikroskop (100x forstørrelse) (Wagtech Thatcham, Berkshire, RG19 4QD, Storbritannia), og mikrofotografiene ble tatt med et digitalt kamera montert manuelt (Sony) Cyber-shot DSC-W180 10.1MP med 3x optisk zoom, New Jersey, USA) for ytterligere referanser.
Kalsiumoksalat krystallavsetninger
I nyrene ble krystallavsetninger bestemt ved bruk av semikvantitative analyser, som er en mikroskopisk skåringsmetode [46,56]. Mikroskopet filarmikrometer (0,1 mm) okular (10x, bredt felt på 23,3 mm, Olympus Optics OSM 212422, laget i Japan) ble brukt. Det vil si at krystallavleiringer i nyrevevet ble talt ved hjelp av et lysmikroskop. Alvorlighetsgradene til krystallavsetninger ble tilordnet som 0=<1 crystal(no="" crystal="" deposition),1="1-10,2=11-30," 3="31-50," 4="51-75" and="" 5="">75 krystalltellinger, med gjennomsnittsverdier [46].
Ved telling av CaOx-krystallavsetninger ble en sagittal del av hver nyreprøve delt inn i fire like store områder med to virtuelle linjer, og avlesninger av gjennomsnittlig 4 mikroskopiske felt ble rapportert [57,58]. Et felt på 100x ble deretter tilfeldig. valgt fra hver region og CaOx-avsetninger ble talt. Bildet av en av de fire regionene under et lysmikroskop ble tilfeldig fanget [58] ved hjelp av et digitalkamera montert manuelt på toppen av mikroskopet.
Statistisk analyse
Dataene ble analysert ved å bruke Graph Pad Prism versjon 6 Software (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av post-hoc Dunnetts testsammenligninger ble utført når det var nødvendig for å sammenligne mellom behandlede og ubehandlede grupper. Dataverdiene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Verdiene til P<0.05 was="" considered="" statistically="">
cistanche deserticola fordel: behandle nyresykdom