Tredimensjonal arkitektur av nefroner i den normale og cystiske nyren
Mar 17, 2022
for mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com
Thomas Blanc1,2,7, Nicolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Cle´ment Nguyen1, Martine Burtin1, Gerard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8og Marco Pontoglio1,8
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, Centre National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université deParis, Institut Necker Enfants Malades, Département « Croissance et Signalisation », Paris, Frankrike;2Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris, Frankrike;3Structure Fédérative de Recherche Necker, USA24-UMS3633, Paris, Frankrike; 4Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, Frankrike;5Service d'ExplorationsFonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris, Frankrike; og6Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, HôpitalEuropéen Georges Pompidou, Paris, Frankrike
SØKEORD: cystisknyresykdom;nyre; nefron; nefronoftise; vevsrensing
Oversettelseserklæring
Clearingmetoder gir et unikt verktøy for å forstå hvordan morfologiske endringer fører til patologiske konsekvenser.Nyrerer kritiske organer som opprettholder kroppens homeostase gjennom vann-, metabolitt- og elektrolytthåndtering, som er avgjørende avhengig av den komplekse 3-dimensjonale strukturen tilnefroner.Når denne strukturelle organisasjonen endres, oppstår nyrepatofysiologi. I denne studien har vi utviklet en kraftig metode basert på optisk clearing, multifotonmikroskopi og digital sporing for å studerenyrepå enkeltnefronnivå under fysiologiske og patologiske forhold. Spesielt gir vi den første 3-dimensjonale rekonstruksjonen av en polycystickidney på skalaen til enkeltnefroner. Denne metoden kan brukes i flere patologiske sammenhenger, slik at vi bedre kan forstå den komplekse prosessen med nyreforringelse og følgelig utvikle mer målrettede terapeutiske strategier
Nyren opprettholder kroppens homeostase via komplekset3-dimensjonal(3D) nefronstruktur. Når denne strukturelle organisasjonen endres, oppstår nyrepatofysiologi. Kronisknyresykdommer er preget av utvikling av nyreskader. Interessant nok har patologer rapportert om en bred heterogenitet i fordelingen av lesjoner under kroniske nyresykdommer.1,2 Hvorvidt dette reflekterer det faktum at spesifikke nefronsegmenter kan være ulikt skadet, eller alternativt at noen nefroner har forskjellig mottakelighet for å bli skadet som helhet, er ukjent. For å løse dette problemet er det obligatorisk å rekonstruere 3D (Tredimensjonal) form avnefroneri patologiske sammenhenger.
Så vidt vi vet,nefronerhar bare blitt fullstendig rekonstruert ved bruk av serielle 2D-seksjoner.3–5 Selv om standard histologisk seksjonering gir høy oppløsning, er 3Drekonstruksjoner arbeidskrevende og vanskelige å oppnå. Dette skyldes først og fremst mekaniske forvrengninger, som er en uunngåelig effekt av skjæreprosedyren. Videre tillater ikke 3D-rekonstruksjon fra 2D-bilder direkte avbildning av 3D-strukturer i helmonterte vev.
Multifotonmikroskopi har forbedret vår evne til å oppdage morfologiske endringer i tykke seksjoner. En betydelig begrensning er imidlertid den grunne tilgjengelige dybden på grunn av lysspredning. Ved å minimere brytningsindeksforskjeller, har clearingmidler forbedret evnen til å avbilde dybder dramatisk.6,7 Til tross for at det første clearingmiddelet ble introdusert for et århundre siden,8 er det først nylig at flere clearingprotokoller har blitt utviklet, mest for hjernen.9 –17 Nyere studier har vist deres potensiale for å forestille seg andre solide organer, som leveren, bukspyttkjertelen ellernyre.18–26
Polycystisknyresykdom, en genetisk heterogen lidelse som involverer mutasjoner i flere ciliære gener, er den vanligste arvelige nyresykdommen.27,28 Polycystisknyresykdom karakteriseres ved utvikling av cyster som fører til fullstendig ødeleggelse av nyren.28 Mikrodisseksjonsstudier antydet at cyster kan utvikle seg enten som et "utpressing" av et nefronsegment, som ved autosomal dominant polycystisk nyresykdom; som ekstatisk utvidelse av samlekanaler (CDer), som i autosomal recessiv polycystisknyresykdom; eller utelukkende i medullære tubuli, som ved nefronoftise (NPHP).27,29 Men hvordan cyster utvikler seg i 3D (Tredimensjonal) og organisere med hverandre og normal nabotubulesis fortsatt ukjent.
Her kombinerte vi optisk clearing med multifotonmikroskopi for å gi ny innsikt i hvordannefronerer formet og organisert i fysiologiske forhold og hvordan de modifiseres under sykdom, for eksempel cystogenese. Våre resultater viser at det er 3 typernefronerog at kar kan påvirke nefrons romlige organisering. Interessant nok observerte vi at nefroner har en tendens til å ligge i spesifikke plan. Uventet, da vi brukte denne teknikken på jckmus, observerte vi at cyster bare utviklet seg i spesifikke nefronsegmenter med fusiforme cyster blandet med normale tubuli.
Klikk for åCistanchebivirkningerfor nyresykdom
RESULTATER
Eksperimentelt oppsett
For å studere formen til helenefroneri forhold til deres miljø, tok vi i bruk en teknikk basert på optisk klaring og multifotonmikroskopi (tilleggsfigur S1A). Ved å sammenligne forskjellige optiske clearing-protokoller, bestemte vi at fornyre, benzylalkohol/benzylbenzoat (BABB) var den mest hensiktsmessige med tanke på effektivitet (tilleggsfigur S1B og C og tilleggstabell S1).
3D (Tredimensjonal) rekonstruksjon og digital sporing krever bilder av høy kvalitet med høy oppløsning og et høyt signal-til-bakgrunnsforhold. Vi observerte at det optiske signalet gitt av naturlig fluorescens ikke var ensartet over nyreseksjoner. Spesielt ble bilder fra medulla dårlig kontrastert med et lavt signal-til-bakgrunnsforhold (tilleggsfigur S2). For å forbedre signal-til-bakgrunnsforholdet, ble seksjoner vestfarget med periodic acid–Schiff (Supplementary Figure S1D), fordi vi empirisk bemerket at denne fargingen ga opphav til høy kontrast i tynne seksjoner under 2-fotonfluorescens. Signalet var imidlertid ikke ensartet gjennom tykk periodic acid-Schiff-fargetnyreseksjoner(Tilleggsfigur S1E). Derfor farget vi nyreseksjoner med fluorokrom-koblede lektiner: peanøtt-agglutinin og hvetekim-agglutinin, som farger glomeruli og tubuli, og Griffonia simplicity I folia-agglutinin, som markerer blodkar. ble dramatisk økt i hele nyreseksjoner, med en betydelig forbedring i både XY-planet og z-aksen (tilleggsfigur S1E og tilleggsfilm S1).
3D nefronsegmentvisualisering
Å visualisere formen til helhetennefroner, sporet vi deres stier, og begynte ved urinpolen til glomerulus og sluttet ved CD-krysset (Supplementary Movie S2). Til tross for det faktum at lektinene som brukes globalt binder alle nefronsegmenter, la vi merke til at når de ble nøye inspisert, ble disse lektinene preget av et spesifikt mønster i måten de farget basale eller luminale membraner i de forskjellige nefronsegmentene. Med andre ord, vi utnyttet det stereotype mønsteret av lektinfarging for å identifisere de forskjellige nefronsegmentene. På denne måten kunne vi enkelt identifisere 6 enheter: proksimal tubuli (PT), tynn lem (TL) av Henleloop (HL), tykk ascenderende lem (TAL) av HL, distal convoluted tubuli (DCT), connecting tubuli (CNT), og CD. Overgangen mellom PT og TL var preget av det plutselige tapet av det typiske PT-børstegrensesignalet og av reduksjonen i lumenbredden, som nesten var fraværende i TL (Figur 1a). Motsatt var overgangen mellom TL og TAL preget av en betydelig økning i eksternt rørformet diameter og relativt konstant lumenbredde (Figur 1b). I alle nefroner ble overgangen av TAL til DCT systematisk funnet ved den vaskulære polen til glomerulus. Denne overgangen var preget av en plutselig utvidelse av den ytre rørdiameteren som hovedsakelig skyldtes en betydelig økning i lumendiameteren (Figur 1c). Overgangen mellom DCT og CNT var preget av areduksjon i både rørdiameter og lumen (Figur 1d). Til slutt ble forbindelsen mellom CNT og kortikal CD karakterisert av en plutselig økning i både rørdiameter og lumen (Figur 1e). Kvantifiseringen av disse morfologiske overgangene var statistisk signifikant (figur 1f), og dens relevans ble verifisert med farging med spesifikke rørformede markører (tilleggsfigurer S3–S5 og tilleggsfilm S3–S5).
Formen og størrelsen på PT-er varierer i henhold til deres dybde
Fargingen av tykknyreseksjoner tillot oss å spore koordinatene til den romlige utviklingen av hele PT-segmenter. Interessant nok oppdaget vi at formen deres var ekstremt variabel og bestemt av posisjonen til glomeruli deres i cortex. Globalt identifiserte vi 3 mønstre. Den første tilsvarte den mest overfladiskenefroner(SNs) (Figur 2a; Supplementary Movie S6), som okkuperte den mest eksterne delen av cortex (de mest eksterne 30 prosent nær nyrekapselen). Deres kronglete deler dannet kompakte strukturer med bare 6 til 7 viklinger rundt sin egen glomerulus, som okkuperte veldig små og tettpakkede rom. Konvolusjonen av disse SN-ene endte i lange og rette pars recta som gikk ned i medulla. I den motsatte enden av dette spekteret observerte vi et andre mønster av nefroner lokalisert i den dypeste delen av cortex (40 prosent større indre dybde), ved siden av medulla (juxtamedullære nefroner [JNs]) (Figur 2a; Supplerende figur S6 og Supplementary Movie) S6). Deres PT-er var preget av en innledende kortsløyfe som systematisk gikk ned mot papillen og deretter snudde U for å stige opp mot nyrekapselen. I motsetning til SN-er ble JN proksimale kronglete tubuli karakterisert av store spoler som utviklet seg rundt deres egen glomerulus og okkuperte store, løst pakkede domener i juxtamedullarycortex. Den kronglete delen av PT av JNs hadde 10 til 15 konvolusjoner, og dannet store domener. Til slutt inkluderte det tredje mønsteret nefroner lokalisert i den midtre delen av cortex (midtre nefroner [MNs]) (Figur 2a; Supplerende film S6). Interessant nok hadde disse tubuli en form og romlig orientering som representerte en overgang mellom SN-er og JN-er. Faktisk inneholdt de 8 til 9 viklinger med spoler som var større enn SN-er, men mindre enn JN-er. I tillegg hadde MN-er lengre pars recta enn JN-er. Interessant nok viste en global sammenligning av formene til PT-ene at SN-er og MN-er hadde et homogent mønster, mens JN-er var ekstremt heterogene (tilleggsfigur S6). I tillegg romlig rekonstruksjon av flerenefroner avslørte at PT-er aldri blander seg (SupplementaryMovie S6), noe som indikerer at hvert nefron opptar sitt eget individuelle rom i cortex.
Morfometriske analyser bekreftet de store forskjellene i størrelsen og formen til SN-er og JN-er, med et mellomliggende aspekt for MN-ene. PT av JN-er var mer enn 2-fold lengre enn PT for SN-er (figur 2b); Imidlertid var rettheten større i SN-er enn i JN-er (figur 2c), i samsvar med observasjonen at JN-tubuli var mye mer kronglete (figur 2a; tilleggsfigur S6).
Figur 1|Morfologiske kriterier brukt for å identifisere nefronsegmenter. (a–e) Morfologi til de forskjellige segmentene til nefroninkontrollmusene.Nefronerble sporet fra urinpolen til glomerulus til samlekanalen (proksimal tubuli [PT]: turkis; tynn lem[TL] av Henle-løkken: lys grå; tykk stigende lem [TAL] i Henle-løkken: mørk grå; distal innviklet tubuli [DCT]: rosa; forbindelsestubuli [CNT]: gul; kortikal samlekanal [CCD]: oransje). Pilene indikerer diameteren til de forskjellige nefronsegmentene. (Fortsettelse)
Figur 1|(Fortsettelse) (f) Kvantifisering av den ytre rørformede diameteren til de forskjellige nefronsegmentene. Data er uttrykt som gjennomsnitt±SEM. Variansanalyse etterfulgt av Tukey-Kramer-testen: **P < 0.01, ***P < 0,001.
Figur 2 |Tredimensjonal(3D) proksimal tubulerekonstruksjon avslører 3 forskjellige former og organisasjoner. (a) Representative 3D-rekonstruksjonsbilder av proksimale tubuli gjennom hele nyrebarken, delt inn i 3 nivåer (hvite linjer) i henhold til formen på proksimale tubuli (PTs): overfladisk (blå), midtre (grønn) og juxtamedullær (rød) cortex, tilsvarende henholdsvis ytre 30 prosent, midtre 30 prosent og indre 40 prosent av cortex. Legg merke til de forskjellige formene til de 3 typenenefronerog spesielt lengden og tortuositeten til de juxtamedullære tubuli. Bar{{0}} mm. (b,c) Kvantifisering av (b) lengde og (c) retthet av de 3 typene proksimale tubuli. (d) Kvantifisering av volumet av glomeruli fra hver cortex-region. Data er uttrykt som gjennomsnittlig SEM. Analyse av varians etterfulgt av Tukey-Kramer-testen: juxtamedullær PT versus overfladisk PT: ###P < 0.001;="" juxtamedullær="" pt="" versus="" midtre="" pt:="" ***p="">< 0,001;="" overfladisk="" pt="" versus="" middels="" pt:="" $$$p=""><>
Figur 3 |Tredimensjonal(3D) nefronrekonstruksjon avslører 3 forskjellige typer nefroner. (a) Representative 3D-bilder av hele nefron (venstre paneler) fra glomeruli til oppsamlingskanal i den overfladiske cortex (blå), midtre cortex (grønn) og juxtamedullær region (rød) i kontrollmus. Nefronsegmentering (høyre paneler) for de 3 forskjellige typene nefroner. Bar=150 mm. (b) Kvantifisering av den indre avstanden mellom de 2 lemmene i Henle-løkken for de 3 typene nefroner. (c) Kvantifisering av nefronlengden for (fortsatt)
Figur 3|(fortsettelse) 3 typernefroner. (d) Kvantifisering av lengden til de forskjellige segmentene av nefronet i henhold til typen nefron. Data er uttrykt som gjennomsnitt±SEM. Analyse av varians etterfulgt av Tukey-Kramer-testen: juxtamedullær nefron (JN) versus overfladisk nefron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" midtre="" nefron="" (mn):="" *p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001.="" cnt,="" tilkoblingsrør;="" dct,="" distalconvoluted="" tubuli;="" pt,="" proksimal="" tubuli;="" tal,="" tykt="" stigende="" lem="" av="" henle-løkken;="" tl,="" tynn="" lem="" av="">
Glomerulær størrelse varierer med dybden
Vi analyserte deretter dybden og diameteren til glomeruli tilfeldig valgt fra hver av de 3 sonene. Morfometriske analyser avslørte at glomeruli var lokalisert i gjennomsnitt 783 og 355 mm fra nyrekapselen i henholdsvis JNs og SNs. Som tidligere rapportert, observerte vi at størrelsen på glomeruli varierte i henhold til deres dybde. Spesielt var det glomerulære volumet til JN-er 3 ganger større enn det for SN-er og MN-er (figur 2d).
3D nefronrekonstruksjon
Vi sporet deretter den romlige utviklingen av helenefronerfraPT til CNT. Den globale visningen av deres 3D (Tredimensjonal) rekonstruksjon bekreftet at nefronformen var forskjellig mellom SN-er, MN-er og JN-er (Figur 3a; Supplerende film S7). Denne forskjellen skyldtes hovedsakelig strukturen til PT. I tillegg observerte vi at HL hadde en annen 3D romlig organisasjon. Spesielt var TL og TAL mer fjernt separert i JNsthan i SNs og MNs (figur 3b). Morfometriske analyser avslørte at JN-er globalt sett var 2-fold lengre enn SN-er (figur 3c). Den økte lengden var proporsjonalt fordelt i alle segmenter, bortsett fra TAL og DCT, som hadde en tendens til å ha en lignende absolutt lengde i alle nefrontyper (Figur 3d). Dette antydet at nefronforlengelse er overraskende homogent mønstret prosess.
De bueformede karene påvirker juxtamedullær PT-konvolusjon
For å få et mer omfattende perspektiv pånyrestruktur, utnyttet vi Griffonia simplicifoliaagglutinin-farging, som gjorde det mulig for oss å spore buekarene og grenene deres inn i de kortikale strålekarene (Figur 4a; Supplerende film S8). Interessant nok, den samtidige 3D (Tredimensjonal) rekonstruksjon av nefroner og kar viste at de bueformede karene har en tendens til å være i en overraskende parallell romlig organisasjon med nærliggende tubuli. Spesielt observerte vi at banen fulgt av spesifikke JN-er (begrensede JN-er) har en tendens til å følge banen til det nærliggende fartøyet (Figur 4b; Supplerende film S9). Bemerkelsesverdig nok er denne skjevheten (bare observert i en undergruppe av JNnefroner) stod for den store heterogeniteten i formene til PT (tilleggsfigur S6). Morfometriske analyser viste at de "begrensede" PT-ene var betydelig lengre og mer kronglete (redusert retthet) enn de "ikke-begrensede" (Figur 4c og d). Det er verdt å merke seg at de kronglete delene av både SN-er og MN-er var plassert over buekarene og ikke var begrenset.
Cistanche-kronisk nyresykdom
Tubuler har en tendens til å ligge i fly
Interessant nok, en inspeksjon av 3D (Tredimensjonal) former avnefronerindikerte at de pleier å ligge i fly (Figur 5a; Supplementary MovieS10). For å kvantifisere denne parameteren og for å vurdere den mulige statistiske skjevheten til denne konformasjonen, målte vi den generelle tendensen til tubuli til å bøye seg ut av planet definert av løkkene deres. Våre målinger viste at sammenlignet med en simulert modell av tilfeldig gange generert med samme sett av påfølgende målte vinkler og lengde mellom påfølgende punkter (Figur 5b), hadde tubuli en tendens til å utvikle seg med et mindre avvik fra et plan (Figur 5c). Dette indikerte at tubulus forsøkte å begrense banen deres langs et fly. De observerte forskjellene var svært statistisk signifikante (P <>
3D nefronrekonstruksjon avslører et spesifikt mønster for cysteutvikling
For å finne ut om protokollen vår tillater sporing av nefroner i uorganisert patologisk vev, karakteriserte vi formene og den romlige fordelingen av cyster i jack-mus, en mye brukt modell av NPHP og cystisk sykdom.31–33 3D-bilder viste at til tross for utseende av fremtredende cyster, den generelle 3D (Tredimensjonal) forløpet av nefroner skilte seg ikke signifikant fra kontrollmusene (Supplementary Movie S11). På samme måte bekreftet morfometriske analyser at den globale lengden avnefroner, glomerulært volum og lengde av hvert nefronsegment var sammenlignbare med de for kontrollmus (tilleggsfigur S7). På grunn av cysteutvikling klarte vi ikke å skille TL fra TAL i HL. Alle nefronene utviklet fusiforme cyster (SupplementaryMovies S11 og S12). Et av de mest slående trekkene var observasjonen at fusiforme cystiske dilatasjoner skjedde på flere steder langs det samme nefronsegmentet (tilleggsfilmer S12 og S13). Interessant nok observerte vi at cyster aldri utviklet seg i PT-er og HL-nedadgående lemmer (Figur 6a; Supplerende film S12). I motsetning til dette ble de hovedsakelig oppdaget i HL-stigende lemmer, DCT-er, CNT-er og i den øvre delen av CD-er, i kontinuitet med CNT (Figur 6a; Supplerende film S12). Spesielt observerte vi at DCT, så vel som CNT-segmenter, hadde en spesielt økt sannsynlighet for å utvikle cyster i deres respektive mer distale deler (figur 6b). Kvantitative morfometriske analyser av 3D-rekonstruksjonsbilder viste at det totale cystevolumet per nefron var spesielt høyt i CNT (Figur 7a). I tillegg observerte vi at cysteforstørrelser i HL og DCT var større i JNs enn i SNs og MNs (Figur 7a; Supplerende film S12). Dessuten var cysteforekomsten signifikant høyere i JN enn i de andre typenenefroner(Figur 7b). Vi observerte også at den gjennomsnittlige glomerulære interavstanden (beregnet på de nærmeste 5 glomeruli) hadde en tendens til å være spesielt økte incystiske mus, spesielt i den mer overfladiske cortex (tilleggsfigur S8).
Figur 4|Fartøy bestemmer nefronformen. (en)Tredimensjonalrekonstruksjon av kararkitekturen fra de bueformede karene til de kortikale strålingskarene. Bar ¼ 200 mm. (b) Representative bilder av "nonconstrained" (øvre panel) og "constrained" (nedre panel) juxtamedullære proksimale tubuli. Bar ¼ 100 mm. (c,d) Kvantifisering av (c) lengden og (d) rettheten til "ikke-begrensede" og "begrensede" juxtamedullære proksimale tubuli. Data er uttrykt som gjennomsnitt±SEM. Mann-Whitney-test: "begrenset" versus "ikke-begrenset":*P < 0.05,="" ***p=""><>
3D (Tredimensjonal) rekonstruksjon av mange cyster avslørte at de var ekstremt varierende i form og volum (Figur 6c; Supplerende filmer S11 og S13). I HL ascenderende lem hadde cyster en fusiform med liten diameter. I DCT hadde cyster en ganske sfærisk og større form og var spredt mellom ikke-utvidede tubuli. Interessant nok ble overgangen mellom DCT og CNT systematisk preget av en normal ikke-dilatert struktur. I kontrast, i CNT, observerte vi systematisk en sammenhengende utvidet cystisk struktur direkte i kontakt med CD. Interessant nok, i CD, krympet denne strukturen gradvis til en normal tubulistørrelse. Merdistisk kunne ingen ytterligere cyster påvises i den sammenhengende delen av CD-en. Et annet konsistent trekk var den særegne romlige organiseringen av cyster i HL-ascenderende lem. Faktisk, selv om cyster var dypere og nærmere løkken i SN-er, var de mer overfladiske og nærmere DCT i JN-er (Figur 6c). Igjen, cyster okkuperte en mellomposisjon i MNs (figur 6c).
Figur 5|Nephron tubuli har en tendens til å utvikle seg som en flat struktur. (a) En typisk bane for en nefron proksimal tubuli. Denne banen illustrerer dens tendens til å ligge i et fly. Planheten til utviklingen av banen kan bedre sees når den er riktig rotert og justert med observatørens synsvinkel (se høyre representasjon av det samme rørformede segmentet, som på venstre side er representert i en annen vinkel) . (b) Skjematisk representasjon av en rørformet bane sammensatt av 4 segmenter (mellom 5 punkter som definerer en gitt rørformet bane vist som et eksempel). Graden i hvilken stier har en tendens til å gå "ut av planet" kan representeres av vinkelen som er angitt her som "beta". (Fortsettelse)
Figur 5|(Fortsatt) Denne vinkelen måles mellom segmentet p3-p4 i forhold til planet (definert av de umiddelbart foregående punktene p3, p2 og p1) og representert av et mørkegrå rektangel i skjemaet. Beregning av beta-vinkler ble deretter rekursivt beregnet langs med settet med punkter i en rørformet bane. For å evaluere omfanget av skjevheten til disse beta-vinklene, simulerte vi en tilfeldig gange (Monte Carlosimulation [MCs]) ved å bruke det samme settet med påfølgende alfa-vinkler for hver rørformet bane (målt mellom alle påfølgende segmenter). Denne tilfeldige vandringen genererte en sti med et identisk sett med alfa-vinkler og randomiserte beta-vinkler. (c) Fiolinplott av den globale fordelingen av beta-vinkler og resultatet av MC-er i den proksimale tubulus (PT), tynn lem (TL) av Henle-løkken, tykk stigende lem (TAL) i Henle-løkken, distal convoluted tubuli (DCT) ), og binderør (CNT). MCs, P <>
DISKUSJON
Tradisjonelle histologiske metoder er begrenset i deres evne til å oppdage patologiske endringer som påvirker den globale formen tilnefroner. Her presenterer vi en kraftfull tilnærmingsbasert tilnærming som har potensial til å ta opp avgjørende spørsmål omnyrearkitektur med enestående romlige detaljer under normale og patologiske forhold. Resultatene våre bekreftet eksistensen av 3 typer nefroner, som er forskjellige i deres plassering, form og størrelse, i samsvar med deres funksjonelle spesifisiteter. Dessuten demonstrerte vi at nephronstender til å ligge i fly og tilpasse seg fartøyets romlige organisasjon. Spennende nok, da vi brukte denne teknikken på en modell av cystisk nyresykdom, observerte vi at cyster utvikler seg i allnephrons, men bare i spesifikke segmenter. Interessant nok viste vi at cysteformen varierer i henhold til nefronsegmentet, og at cyster langs det samme nefronet interkalerer med normale ikke-dilaterte tubuli. Til sammen gir disse resultatene den første 3D (Tredimensjonal) karakterisering av den romlige ordningen avnefronerog kar og viktigere gir grunnlaget for å forstå en patologisk prosess, for eksempel ascystogenese.
Nyreoptisk clearing er utfordrende på grunn av høye nivåer av autofluorescens og celletetthet. Ved å sammenligne ulike clearing-protokoller, identifiserte vi i BABB en kraftig teknikk for å implementere visualisering og rekonstruksjon av strukturer som ligger i den dypeste delen avnyre, altså medulla. Dessuten er BABB rask og skalerbar, og når de er fjernet, kan prøver lagres i måneder før bildeinnhenting. En annen hovedfordel med denne teknikken er den lave kostnaden. Clearingmidler kan føre til krymping eller utvidelse av strukturer.9–17 Men fordi disse modifikasjonene av nyrestørrelse er isotrope, forventes ikke de relative målingene å bli påvirket eller skjev tolkningen deres. En av de viktigste begrensningene er merknaden av strukturer som er svært tidkrevende. Likevel er det et økende antall teknikker basert på dyp læring som raskt bør overvinne denne begrensningen.
I samsvar med resultatene oppnådd med klassiske teknikker, viste vår studie at nefroner varierer i form og lengde i henhold til deres posisjon. Spesielt observerte vi at JN-er har mer utviklede kronglete PT-er og større glomeruli og er 2 ganger lengre enn SN-er. Den økte lengden er resultatet av en harmonisk prosess fordi forlengelsen påvirker proporsjonalt alle nefronsegmenter. Vi observerte også at JN-er har større HL. Til sammen viser disse data klart at mikroanatomien til SN-er og JN-er er betydelig forskjellig, og at MN-ene viser mellomfunksjoner. Interessant nok har fysiologiske studier vist detnefronerer også funksjonelt forskjellige.2 Morfogenetiske hendelser som ligger til grunn for disse forskjellene er ennå ikke kjent. Det er derfor fristende å spekulere i at den spesielle strukturen til JN kan forklare spesifisiteten til funksjonene deres.
Interessant nok ved å tilby 3D for første gang (Tredimensjonal) rekonstruksjon avnefronerog deres omkringliggende kar, vi oppdaget en romlig begrensning mellom de bueformede karene og en undergruppe av nefroner. Dermed kan det tenkes å tenke at fartøy kan diktere måten nefroner forlenges under utvikling.34,35 Inspeksjonen av 3D-formene til nefroner kombinert med beregningssimuleringer avslørte også at nefroner aldri blander seg og at hver nefron har en tendens til å ligge i et plan. Den funksjonelle betydningen av denne observasjonen gjenstår å belyse.
Cysteutvikling under polycystisknyresykdom er fortsatt en spennende prosess. NPHP, en patologisk tilstand preget av cysteutvikling, er den vanligste genetiske sykdommen som forårsaker nyresykdom i sluttstadiet hos barn og ungdom. Tjue NPHP-gener er identifisert så langt.36Blant dem koder NEK8 for et medlem av den aldri inmitosis A-relaterte kinasefamilien, som spiller en rolle i ciliafunksjon og cellesyklusprogresjon.37 Nek8 ble opprinnelig karakterisert som genet mutert i jck-mus.32 Spesielt har amutasjon i det samme proteindomenet vist seg å føre til NPHP9 hos mennesker.38 2D-studier antydet at cysteutviklingen er dramatisk forskjellig mellom de forskjellige formene for polycystisk nyresykdom.27,29 Spesielt i NPHP ser det ut til at cyster er avledet utelukkende fra CD og DCT.31 Selv om de er informative, kan disse immunhistokjemiske studiene ikke argumentere mot muligheten for at tapet av spesifikke tubulære markører39 kunstig forklarer denne observasjonen. Dermed vår 3D (Tredimensjonal) studie gir det første klare beviset på at cysteutvikling er en prosess som kan involvere bare spesifikke nefronsegmenter. Interessant nok, selv om NIMA (Never In mitosisgene A) – Related Kinase 8 (NEK8) er uttrykt i cytoplasmaet til alle nefronsegmenter, er uttrykket i cilia begrenset til DCT og CD. Fordi bare disse segmentene er tilbøyelige til å utvikle cyster,31 kan vi postulere at forstyrrelsen av NEK8 ciliær funksjon er den avgjørende hendelsen for cystedannelse. Interessant nok har vi også observert at fusiforme cyster er i kontinuitet med normale ikke-dilaterte tubuli. Det faktum at en recessiv kimlinjemutasjon fører til en patologisk fenotype i bare en undergruppe av celler antyder at en andre hendelse kan utløse cysteutvikling i disse cellene, som foreslått for autosomal dominant polycystisknyresykdom.40,41
Figur 6 |Tredimensjonal(3D) nefronrekonstruksjon avslører at cyster bare utvikler seg i spesifikke nefronsegmenter. (a) Representative 3D-bilder med gjengivelse av cystevolum av et helt nefron (venstre paneler) fra glomeruli til oppsamlingskanal i den overfladiske cortex (blå), midtre cortex (grønn) og juxtamedullær region (rød) i jack-mus. Nephron segmentering (høyre paneler) for de 3 forskjellige typene avnefroner. Bar=150 mm. (b) Sannsynlighet for å utvikle cyster i de forskjellige nefronsegmentene hos jackmus. (Fortsettelse)
Figur 6|(Fortsettelse) Den horisontale aksen er en normalisert lengde av nefroner som tilsvarer 50 binger (proksimal tubuli [PT], turkis; Henleloop [HL], hvit; distal kronerør [DCT], rosa; forbindelsesrør [CNT], gul). (c) Representative 3D-cyster-rekonstruksjonsbilder med gjengivelse av cystevolum av den stigende delen av HL (venstre paneler), DCT-er (midtpaneler), og CNT-er og kortikale samlekanaler (CCD-er) (høyrepaneler) i overfladiske (øvre paneler), midtre (midtre paneler) paneler), og juxtamedullære (nedre paneler) nefroner i jack-mus. Bar= 50 mm.
Figur 7|Karakterisering av cystefordeling og volum gjennom nefronet. (a) Kvantifisering av det totale cystevolumet (summen av cystene per nefron) for hvert nefronsegment (Henle-sløyfe [HL], hvit; distalt kronglete rør [DCT], rosa; forbindelsesrør [CNT], gul) og (b) lengde av tubuli okkupert av cystene for hver type nefron (overfladisk: blå; midt: grønn; juxtamedullær: rød) hos knektmus. Data er uttrykt som gjennomsnitt±SEM. Analyse av varians etterfulgt av Tukey-Kramer-testen: juxtamedullær nefron [JN] versus overfladisk nefron [SN]: #P < 0.05;="" jn="" versus="" midtre="" nefron="" [mn]:="" *p="">< 0.05,="" **p=""><>
Vi observerte også at cysteforstørrelse er mer dominerende i JN-er enn i SN-er, i det minste med tanke på cystene som befinner seg mellom PT og CNT. Det er konsekvent rapportert at i sammenheng med glomerulosklerose, er glomerulære lesjoner funnet hyppigere i JN enn i SN. å forverres er en interessant hypotese som fortjener nærmere undersøkelse.
Oppsummert beskriver vi en ny teknikk for å avbildenyreri 3D (Tredimensjonal) med tilstrekkelig molekylær spesifisitet og oppløsning til direkte å registrere den romlige og kvantitative fordelingen av spesifikt merkede interne strukturer (nefroner, kar og cyster). Gitt bekvemmeligheten, hastigheten og evnen til direkte kvantifisering, forventer vi at denne teknikken vil bli et kraftig verktøy for å forstå nyrepatofysiologi.
METODER
Dyr
Alle dyreprosedyrer ble godkjent av "Services Vétérinairesde la Préfecture de Police de Paris" og av den etiske komiteen ved Université Paris Descartes. To måneder gamle FVB/N-mus (n=20) ble brukt til å sette opp den eksperimentelle tilstanden fornyreclearing. Studien ble deretter utført på 2-uke gamle jack hannmus (n=4) og kontrollkullkamerater (n=3).
Forberedelse av nyrevev
Før avliving ble mus perfusert, via intrakardial kateterisering, med 25 ml heparinisert saltvann (1000 IE/l) etterfulgt av 75 ml 4 prosent paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS). Eksperimenter ble utført under anestesi med xylazin (Rompun 2 prosent, Bayer, Leverkusen, Tyskland, 6 mg/g kroppsvekt) og ketamin (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Frankrike, 120 mg/g kroppsvekt).
For clearingstudier,nyrerble fiksert i 4 prosent paraformaldehyd i 4 timer og innebygd i 4 prosent agarose og 1,5-mm tykke seksjoner rundt nyrehilum ble kuttet og lagret i PBS ved 4grad. Nyreseksjoner ble først farget og deretter fjernet.
For immunhistokjemiske studier på tynne seksjoner ble nyrene fiksert i 4 prosent paraformaldehyd over natten og parafininnstøpte og 4-mm seksjoner ble kuttet.
Farging
Periodic acid–Schiff-farging. De 1.5-mmnyreseksjoner ble inkubert i ren eller 1:100 PBS-fortynnet perjodsyre-Schiff i 5 minutter ved romtemperatur før klargjøring.
Immunhistokjemi på tynne parafininnstøpte seksjoner. Fire mikrometer seksjoner av parafininnstøpte nyrer ble oppvarmet for antigenhenting og inkubert over natten ved 44 gradermed flfluorokrom-koblede lektiner for å spore tubuli (rhodamin peanøttagglutinin [RL-1072-5] og rhodamin hvetekim agglutinin [RL-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, fortynnet ved 1:200) og segment- spesifikt primært antistoff for å avbilde distinkte tubulære segmenter (biotinylert Lotus tetragonolobus lektin [B-1325], Vector Laboratories, fortynnet ved 1:100; muse-anti-Calbindin D28K[D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Tyskland, fortynnet ved 1:200; geit-anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, fortynnet ved 1:200). Neste dag ble seksjonene inkubert med det sekundære antistoffet i 1 time ved romtemperatur (Alexa Fluor 488 konjugat [S32354], Invitrogen; anti-geit Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-mus AlexaFluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; alle fortynnet ved 1:500) før de ble farget med 40,6-diamidino-2-fenylindol. Alle bildene ble tatt med et Nikon Eclipse E800-mikroskop (Champignysur Marne, Frankrike) og forberedt med Fiji-programvare (versjon 1.50). Lektinfarging på tykke seksjoner. Den 1.5-mm tykkenyreseksjoner ble inkubert ved 44 graderi 1 måned i Texas Red eller flfluorescein-isotiocyanat-koblede lektiner: peanøttagglutinin (RL-1072-5) og hvetekimagglutinin (RL-1022-5), fortynnet 1:100 i 0,1 prosent PBS-azid og 0,1 prosent Triton-X. Snittene ble deretter vasket hver dag i 2 uker med PBS før rensing.
Cistanche-nyrefunksjon
Optisk clearing
For skalering, 1.5-mmnyreseksjoner ble inkubert i ScaleA2 (4 M urea, 0,1 prosent Triton X-100, 10 prosent glyserol) eller ScaleB4 (8 Murea, 0,1 prosent Triton X-100 ) i 2 uker, opptil 1 år, ved 4grad.
For BABB-rensing ble 1,5-mm nyreseksjoner dehydrert i sekvensielle skyllinger med etanol ved romtemperatur. Prøvene ble deretter inkubert i BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) i et 1:2-forhold i minst 2 dager ved 4 grader.
To-foton mikroskopi bildeinnsamling
Vev ble avbildet med vandig gel på et invertert multifotonmikroskop (LaVision BioTec) utstyrt med en Mai Tai HP Titanium-Sapphire Laser (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (tilleggsfigur S1A). Eksitasjonsbølgelengden var 815 nm ved 8 prosent av effekten. Vi brukte en 20Xvannnedsenkningsobjektiv (XLUMPLFL20XW,Olympus [Tokyo, Japan]; numerisk blenderåpning, 0.95; arbeidsavstand, 2.0 mm). For fluorescensopptak brukte vi en ikke-deskannet detektor på 80 prosent med et båndpassfilter på 593/40 nm.
Det første trinnet besto av 2D-mosaikkbildeinnsamling ved den midterste z-stabelen ved å bruke suboptimale innhentingsparametere (400 mm X400 mm og 1011X1011 piksler, med 10 prosent overlapping og en lineavering ved 2) for å veilede valget av de mest relevante sentrale feltene (tilleggsfigur S9A) ). Når XY-rutenettet og z-feltene av interesse var definert, ble parametere justert for å få bilder av høy kvalitet. En slik tilnærming reduserte interesseområdet til 5X12 felt per z-stabel. Deretter kjøpte vi 850 z stabler/optiske skiver (1-mm trinnstørrelse) rundt nyrehilum i den midtre delen avnyreseksjon.
Bildesammenføyning, prosessering og sporing Hver stabel ble flislagt i henhold til metoden utviklet av Preibischet al.,43 som gjør det mulig å sy sammen en stor samling bilder ved å bruke "Grid/Collection stitching"-pluginen til Fiji-programvaren (HTTP://Fiji. sc/Fiji). Fordi vi observerte et viktig skifte mellom 2 tilstøtende bilder etter sammenføyning, skrev vi et tilpasset matchende program i Python. Dette programmet kompenserer for bildeforskyvningen, slik at bildene kan justeres riktig (tilleggsfigur S9B). Sammensatte korrigerte bilder ble analysert med Imaris versjon 8.4.2 (Bitplane, Zürich, Sveits). Tubuli og kar ble sporet ved hjelp av den manuelle modusen for filamentsporingspakken til Imaris og sammen med en Imaris Xtension som vi utviklet med MATLAB(https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Bli med_ Filament_Tool.zip?dl=0) (tilleggsfigur S9C). Glomeruli og cyster ble 3D-rekonstruert ved å bruke den manuelle modusen til overflatepakken til Imaris. 3D-en (Tredimensjonal) romlig organisering av glomeruli ble vist ved hjelp av den manuelle modusen til spotpakken til Imaris.
Morfometri
Lengde på rørsegment, nefronlengde og retthet ble bestemt ved å bruke filamentsporingspakken til Imaris. I følge Imaris-programvaren ble rettheten kvantifisert som forholdet mellom avstanden mellom 2 punkter og lengden på nefronsegmentbanen. Trettien PT-er og 12 helenefronerble rekonstruert og målt i 3 villtype mus, mens 37 PT-er og 17 wholenephrons ble rekonstruert og målt i 4 jack-mus. Cyste- og glomerulære volumer ble bestemt ved å bruke "overflatepakken" til Imaris. Trettien og 34 glomeruli ble målt i henholdsvis villtype- og jackmus. Syttifire cyster ble målt totalt.
"Ut av planet"-vinklene til rørformede svinger (indikert som "beta") ble målt mellom planet (definert av 3 påfølgende punkter) og retningen med det neste påfølgende fjerde punktet i rommet (figur 5b). For å evaluere den statistiske signifikansen av den observerte skjevheten, simulerte vi fordelingen av beta-vinkler med tilfeldig rotasjon av beta-vinkler (Monte Carlo-simulering) i strukturer som var sammensatt av de samme segmentene med samme sett av alfa-vinkler.
For beregning av sannsynligheten for å utvikle en cystisk lesjon sammen med nefronsegmenter, representerte vi hvert nefron med et sett med punkter i rommet. Hvert punkt ble kommentert med hensyn til tilstedeværelsen av cyste versus normal struktur og typen segment. Sannsynligheten for hver standardisert lengde (sett til 50 binger) ble beregnet som forholdet mellom antall punkter med cystisk annotering og totalt antall punkter i bingen.
For beregning av den gjennomsnittlige glomerulære interdistansen, vurderte vi for hver glomerulus den gjennomsnittlige glomerulære interdistansen beregnet på de nærmeste 5 glomeruli.
Dataanalyser og statistikk
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Forskjeller mellom de eksperimentelle gruppene ble evaluert ved bruk av variansanalyse fulgt, når signifikant (P < {{0}}.05),="" av="" tukey-kramer-testen.="" når="" kun="" 2="" grupper="" ble="" sammenlignet,="" ble="" mann-whitney-testen="" brukt.="" statistiske="" analyser="" ble="" utført="" ved="" bruk="" av="" graph="" prism-programvare="" (sandiego,="" ca,="" versjon="">
FORMIDLING
Alle forfatterne erklærte ingen konkurrerende interesser.
TAKK
Vi takker Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese(LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative deRecherche Necker for teknisk assistanse. Vi takker Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler og Nicolas Kuperwasser for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Institut National de laSanté et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de laRecherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, RochePharma Research and Early Development (Basel, Sveits) , og Institutt Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Paris, Frankrike).
FORFATTERBIDRAG
TB, NG og MZ designet og utførte eksperimentene og analyserte dataene. FB, LT, MGT og SG utførte også noen eksperimenter og analyserte dataene. MB og CN utførte museeksperimentene. TB og MZ bidro også til å skrive manuskriptet. GF reviderte manuskriptet. FT og MP ga den konseptuelle rammen og designet studien, overvåket prosjektet og skrev papiret.
Cistanche-Tredimensjonal arkitektur av nephrons nyre
TILLEGGSMATERIALE
Tilleggsfil (PDF)
Figur S1. Eksperimentelt oppsett, anskaffelsesprosedyre og bildebehandling.
Figur S2. Grenser for autofluorescenssignal i XY- og z-oppløsninger.
Figur S3. Et todimensjonalt bilde av overgangen mellom PT og TL på 4-mm parafininnstøptnyreseksjoner.
Figur S4. Et todimensjonalt bilde av overgangen mellom TAL og DCT på 4-mm parafininnstøpte nyreseksjoner.
Figur S5. Et todimensjonalt bilde av overgangen mellom DCT og CNT på 4-mm parafininnstøpte nyreseksjoner.
Figur S6. Tredimensjonal rekonstruksjon avslører 3 forskjellige former av proksimale tubuli.
Figur S7.Tredimensjonalrekonstruksjon avslører at lengden og segmenteringen avnefronerer ikke påvirket av cyster.
Figur S8. Tettheten av glomeruli i kontroll og cystisknyrer.
Figur S9. Anskaffelsesprosedyre og bildebehandling etter behandling. Tabell S1. Sammenligning av clearingmetoder.Supplerende fil (filmer)
Film S1. Lektinfarging forbedrer oppløsningen og signal-til-bakgrunnsforholdet markant.
Film S2. Sporing av banen til en tubuli.
Film S3. Tredimensjonal rekonstruksjon av en ryddet nyre som viser krysset mellom den proksimale tubuli og den tynne limboven i Henle-løkken.
Film S4. Tredimensjonal rekonstruksjon av en ryddet nyre som viser krysset mellom den tykke stigende delen av Henleloop og den distale kronglete tubuli.
Film S5.Tredimensjonalrekonstruksjon av en ryddetnyresom viser krysset mellom det distale viklede røret og koblingsrøret.
Film S6. Formen og størrelsen på proksimale tubuli varierer i henhold til deres dybde.
Film S7. Tredimensjonal nefronrekonstruksjon i kontrollmus.
Film S8. Sporing av banen til et kar fra et bueformet kar til akortikalt strålekar.
Film S9. De bueformede karene modellerer formen til de juxtamedullaryproksimale tubuli.
Film S10.Nefronerhar en tendens til å ligge i et fly.
Film S11. Tredimensjonal nefronrekonstruksjon viser et spesifikt mønster for cysteutvikling.
Film S12.Tredimensjonalnefronsegmentering avslører at cyster utvikler seg i spesifikke nefronsegmenter.
Film S13. Romlig ordning og innbyrdes sammenheng avnefronerog kar i en polycystisknyre.
REFERANSER
1. Rik AR. En hittil ubeskrevet sårbarhet av juxtamedullaryglomeruli ved lipoid nefrose. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Heterogenitet av nefronanatomi. Nyre Int Suppl. 1987;20:S25–S39.
3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al.Tredimensjonalrekonstruksjon av rottenefronet. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.
4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, et al. Digital tredimensjonal rekonstruksjon og ultrastruktur av musens proksimale tubuli. J Am Soc Nephrol.2003;14:611–619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Tredimensjonal rekonstruksjon av musens nefron. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Vi kan se klart nå: optisk clearing ognyremorfometri. Curr Opin Nephrol Hypertens.2017;26:179–186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Ryddings- og merkingsteknikker for biologiske vev i stor skala. Mol celler. 2016;39:439–446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang:Über Knochenfärbung. Leipzig, Tyskland: S. Hierzel; 1914.
9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Skala: en kjemisk tilnærming for fluorescensavbildning og rekonstruksjon av den gjennomsiktige musehjernen.Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.
10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al.Tredimensjonalavbildning av løsemiddelklarerte organer ved hjelp av 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: en rensemiddel- og løsemiddelfri rensemetode for nevronalt og ikke-nevronalt vev. Utvikling. 2013;140:1364–1368.
12. Ke MT, Imai T. Optisk clearing av fikserte hjerneprøver ved bruk av SeeDB. CurrProtoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY for kartlegging av nervesystemet. NatMethods. 2013;10:508–513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY for rask og høyoppløselig avbildning av intakt vev. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.
15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. Encellet fenotyping i gjennomsiktig intakt vev gjennom helkroppsrensing. Celle. 2014;158:945–958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Helhjerneavbildning med enkeltcelleoppløsning ved bruk av kjemiske cocktailer og beregningsanalyse. Cell.2014;157:726–739.
17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Tomografisk molekylær avbildning og 3D-kvantifisering i voksne museorganer. Nat Methods.2007;4:31–33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et al. Multifotonmikroskopi av ryddede museorganer. J Biomed Opt. 2010;15:036017.
19. Renier N, Wu Z, Simon DJ, et al. iDISCO: en enkel, rask metode for å immunmerke store vevsprøver for volumavbildning. Celle. 2014;159:896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Forbedret anvendelse av elektroforetisk vevsrensende teknologi, CLARITY, på intakte faste organer inkludert hjerne, bukspyttkjertel, lever,nyre, lunge og tarm. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.
21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. Økt glomerulært kapillærtrykk og størrelse medierer glomerulosklerose i SHR juxtamedullarycortex. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Avbildning av nyrene: fra lys til superoppløsningsmikroskopi. Nephrol Dial Transplant.2021;36:19–28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Validering av en tredimensjonal metode for telling og dimensjonering av podocytter i wholeglomeruli. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Rollen tiltredimensjonalearkitektur i urinkonsentreringsmekanismen til den indre nyremargen. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. Optisk clearing i nyren avslører spotassium-mediert tubuli-remodellering. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. Kombinert strukturell og funksjonell avbildning av nyrene avslører store aksiale forskjeller i proksimal tubulus endocytose. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol.2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Polycystisknyresykdom. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.
29. Wilson PD. Polycystisk nyresykdom. N Engl J Med. 2004;350:151–164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Endringer i glykosyleringsmønsteret under embryonal utvikling av musenyre som avslørt med lektinkonjugater. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.
31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Utvikling av polycystickidneysykdom hos juvenile cystiske nyremus: innsikt i patogenese, ciliære abnormiteter og vanlige trekk ved menneskelig sykdom. J AmSoc Nephrol. 2006;17:2821–2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T, et al. En defekt i en ny kinase fra Nek-familien forårsaker cystisk nyresykdom hos mus og sebrafisk. Utvikling.2002;129:5839–5846.
33. Franke M, Baeßler B, Bechtel J, et al. Magnetisk resonans T2 kartlegging og diffusjonsvektet avbildning for tidlig påvisning av cystogenese og respons på terapi i en musemodell av polycystisk nyresykdom.NyreInt. 2017;92:1544–1554.
34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Molekylære determinanter av nefron vaskulær spesialisering inyre. Nat Commun. 2019;10:5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Endotel-epitelkommunikasjon i polycystisknyresykdom: rollen til signalering av vaskulær endotelvekstfaktor. Cellesignal. 2020;72:109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Mange gener-en sykdommer? Genetikk av nefronoftise (NPHP) og NPHP-assosierte lidelser.Front Pediatr. 2017;5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Cellesyklusregulering av NEK-familien av proteinkinaser. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. NEK8-mutasjoner påvirker ciliær og sentrosomal lokalisering og kan forårsake nefronoftise. J Am SocNephrol. 2008;19:587–592.
39. Wilson PD. Apico-basal polaritet i polycystisk nyresykdom epithelia.Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.
40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. Toksisk tubulær skade i nyrer fra Pkd1-delesjonsmus akselererer cystogenese ledsaget av dysregulert plancellepolaritet og kanoniske Wnt-signalveier. Hum Mol Genet. 2009;18:2532–2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. En kritisk utviklingsbryter definerer kinetikken for nyrecystedannelse etter tap av Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490–1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mekanismen for den unike mottakelighet av dype kortikale glomeruli for å modnesnyrertil alvorlig fokal glomerulær sklerose. Pediatr Res. 1990;28:270-276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Globalt optimal søm av flislagt 3D (Tredimensjonal) mikroskopiske bildeopptak. Bioinformatikk. 2009;25:1463–1465.