Ultralydassistert ekstraksjon av fenolsyrer, flavonoler og flavanoler fra Muscadine drueskall og frø ved bruk av naturlige dypeutektiske løsemidler og prediktiv modellering ved kunstig nevrale nettverk

Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon

AbstraktMålet med denne studien var å undersøke ekstraksjonseffektiviteten til 9 naturlige dypeutektiske løsningsmidler (NDES) ved hjelp av ultralyd forfenolsyrer, flavonoler, og flavan-3-oler i skall og frø av muskadindruer (Carlos) sammenlignet med 75 prosent etanol. Kunstig nevrale nettverk (ANN) ble brukt for å optimalisere NDES-vanninnhold, ultralydbehandlingstid, forhold mellom faststoff og løsemiddel og ekstraksjonstemperatur for å oppnå de høyeste ekstraksjonsutbyttene for ellaginsyre, katekin og epicatechin. En nyformulert NDES (#1) består av kolinklorid:levulinsyre: etylenglykol 1:1:2 og 20 prosent vann ekstraherte den høyeste mengden ellaginsyre i huden med 22,1 mg/g. Dette utbyttet var 1.73- ganger av det med 75 prosent etanol. En modifisert NDES (#3) bestående av kolinklorid: prolin: eplesyre 1:1:1 og 30 prosent vann ekstraherte den høyeste mengden katekin (0.61 mg/g) og epicatechin (0,89 mg/g) i huden, og henholdsvis 2,77 mg/g og 0,37 mg/g i frøet. Det optimale utbyttet av ellaginsyre i huden ved bruk av NDES #1 var 25,3 mg/g (observert) og 25,3 mg/g (spådd). Det optimale utbyttet av (katechin pluss epicatechin) i frø ved bruk av NDES #3 var 9,8 mg/g (observert) og 9,6 mg/g (spådd). Denne studien viste den høye ekstraksjonseffektiviteten til utvalgte NDES for polyfenoler under optimaliserte forhold.

Klikk her for å vite mer

Introduksjon

Naturlige dypeutektiske løsningsmidler (NDES) fremstilles ved å blande hydrogenbindingsgivere med hydrogenbindingsakseptorer i et passende molforhold [1]. Smeltepunktet til den ene komponenten bør være lavere enn smeltepunktet til den andre [1]. Etter oppvarming og blanding blir dette mediet en væske ved romtemperatur. Vann tilsettes for å stabilisere og polarisere blandingen. Forskning innen fytokjemisk ekstraksjon ved bruk av NDES har utvidet seg på grunn av deres effektive ekstraherbarhet og løselighet. Ikke desto mindre spiller flere faktorer en betydelig rolle når man sammenligner NDES med organiske løsningsmidler, inkludert utbytte, kostnad, utvinning og toksisitet. Tidligere forskning undersøkte NDES på utvinning av forskjellige polyfenoler fra forskjellige matmatriser. For eksempel, Bubalo et al. (2016) sammenlignet 5 NDES, vann, 70 prosent metanol (v/v) og surgjort 70 prosent metanol (v/v) for å ekstrahere antocyaniner, katekin og quercetin-3-O-glukosid fra røde drueskall. En NDES bestående av kolinklorid: oksalsyre (1:1) med 25 prosent vann (v/v) ble funnet å være det mest effektive ekstraksjonsløsningsmidlet [2]. I en annen studie har Pani´c et al. (2019) testet 8 NDES og surgjorde 70 prosent av etanol og observerte kolinklorid: sitronsyre (2:1) med 30 prosent vann (v/v) som den beste NDES for å trekke ut antocyaniner fra druerester [3]. Muscadinedruer (Vitis rotundifolia) er hjemmehørende i de sørøstlige statene og den første dyrkede ville druen i USA [4]. Muscadinedruer produseres i 12 stater og utgjør totalt rundt 5000 dekar [5]. Det er 100 varianter av muskadinedruer og hver varierer i fysiske, sensoriske eller kjemiske egenskaper [4]. Blant dem er Carlos en mye plantet muskadinedrue på grunn av dens høye avling og voksende konsistens [4]. Carlos muscadinedruen er middels stor, bronse i fargen, tykkere i skallet og inneholder i gjennomsnitt fire frø [6]. Muscadinedruer inneholder betydelige mengderpolyfenolersom er kjent for å redusere betennelse [7], hemme prostatasvulstvekst [8], og forbedre metabolske responser hos diabetikere [9]. Muscadine druepresser, et biprodukt av muscadine druejuicing eller vinproduksjon, består av skall og frø. En tidligere forskningsstudie brukte aceton: vann: eddiksyreblanding (70:29.7:0.3, v/v) for å trekke ut fenoliske forbindelser fra frøene, skinnet og fruktkjøttet fra åtte kultivarer av Florida-dyrket muskadindrue, inkludert Carlos [10]. Imidlertid hindret bruken av brennbare organiske løsningsmidler og deres lave ekstraksjonseffektivitet praktiske anvendelser. Det meste av muskadine-druepresset blir fortsatt kastet som avfall. Artificial neural networking (ANN) er et ikke-lineært kartleggingssystem som består av ulike grunnleggende prosesseringsenheter koblet sammen med vektede assosiasjoner. Disse prosesseringsenhetene kalles "nevroner" [11]. Kunstig nevrale nettverk er en maskinlæringsmetode for å forutsi eller forutsi en respons basert på flere innganger [11]. Tidligere forskning har brukt responsoverflatemetoder (RSM) for ekstraksjonsoptimalisering og prediksjon. Det er imidlertid få studier som har brukt ANN til samme formål. For eksempel, Sinha et al. (2013) antydet at ANN har bedre prediksjonsytelse enn RSM på utvinning av naturlig fargestoff fra frø av Bixa Orellana (Annatto) [12]. I en lignende studie har Ciric et al. (2020) rapporterte at ANN-modellen var bedre enn RSM for å forutsi ekstraksjoner av fenolforbindelser fra hvitløk [13]. Målet med denne forskningen var å undersøke ekstraksjonseffektiviteten til 9 NDES for fenolsyrer, flavonoler og flavan-3-oler sammenlignet med 75 prosent etanol ved hjelp av ultralyd. ANN ble brukt for å forutsi og optimalisere ekstraksjonsforholdene på fenolutbytte. Hypotesen var at NDES med spesifikke sammensetninger ekstraherer høyere mengder fenolsyrer, flavonoler og flavan-3-oler enn 75 prosent etanol, og den høyeste ekstraksjonseffektiviteten kan oppnås ved ANN-basert prediktiv modellering.

2. Materialer og metoder 2.1. Kjemikalier og reagenser Kolinklorid, levulinsyre, 1,2-propandiol, DL-eplesyre, oksalsyre, saltsyre og maursyre ble hentet fra Acros Organics (Morris Plains, NJ, USA). Melkesyre, etylenglykol, glycin, HPLC-grade acetonitril, metanol og etanol ble kjøpt fra Fishers Scientific (Waltham, Massachusetts, USA). L-prolin og betainhydroklorid ble kjøpt fra Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). HPLC-grade standarder for ellaginsyre, gallussyre, ferulinsyre, (pluss)-katekin, (− )-epikatekin, myricetin, quercetin og kaempferol ble anskaffet fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.2. Design av NDESNDES #1–2 i tabell 1 ble designet i vår forrige studie [14]. Kolinklorid i NDES #1–2 ble valgt som en hydrogenakseptor, mens to forskjellige hydrogendonorer ble valgt for hver nye NDES. Molare forhold mellom hydrogengivere og akseptor- og vanninnhold ble bestemt i foreløpige eksperimenter. NDES #3–9 i tabell 1 ble valgt fra litteraturen da tidligere studier har utnevnt dem til effektive NDES for å ekstrahere polyfenoler. Vanninnholdet i NDES #3 ble modifisert fra den siterte litteraturen. En oppvarmingsmetode ble brukt for å forberede NDES [15]. Kort fortalt ble hydrogenbindingsakseptoren blandet med hver av hydrogenbindingsdonorkomponentene i Erlenmeyer-kolber med en rørestav. Blandingen i kolben ble lukket og oppvarmet til 50 ◦C i ca. 30 minutter eller inntil en klar væske ble dannet og holdt seg stabil ved romtemperatur. Vanninnhold i tabell 1 ble beregnet i henhold til sluttvolumet av NDES-blandinger. pH-verdien til NDES oppført i tabell 1 ble målt ved bruk av et pH-meter (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 2.3. Prøveforberedelse / Ultralydassistert ekstraksjon Frosne muskadindruer (Vitis rotundifolia) skall og frø (kultivar: Carlos) ble levert av Paulk Vineyards (Wray, Georgia, USA). Etter å ha fjernet skrog, blader eller bladstilker, ble avfallet skilt i frø og skinn. Prøvene ble deretter tørket ved bruk av en vakuumovn (Isotemp, modell 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) ved 60 ◦C og et vakuumtrykk lavere enn -30 in.Hg. Deretter ble prøvene homogenisert til et fint pulver ved bruk av en kimær kvern (A1{{105}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, Kina). Ved å bruke et innledende forhold mellom faststoff og løsemiddel på 1:20 (g: ml), ble 0,50 g av enten muscadine drueskall eller frø blandet i 10 ml NDES eller 75 prosent etanol i tre eksemplarer. Prøvene ble deretter plassert i et vannbad (60 ◦C) og sonikert (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500-Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, USA) i 30 minutter ved 100 prosent amplitude for to runder (15 min/runde). Deretter ble prøvene umiddelbart sentrifugert (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, Kina) ved 3 260 g inntil en klar supernatant ble oppnådd. Til slutt ble supernatantene samlet og lagret i en -20 ◦C fryser for HPLC-analyse av fenolsyrer (ellaginsyre, gallussyre, ferulinsyre), flavonoler (myricetin, quercetin og kaempferol) og flavan-3-oler (katekin og epikatekin). 2.4. HPLC-analyser av fenolsyrer, flavonoler og flavan-3-oler Fenolsyrer, flavonoler og flavan-3-oler ble analysert på et HPLC-system (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, Tyskland) i henhold til metoden beskrevet i Sandhu og Gu (2013) [16]. HPLC-systemet består av en binær pumpe, en autosampler, et termostatert kolonnerom, en diodearray-detektor og en fluorescensdetektor. Drueskinn eller frøekstrakter ble hydrolysert før analysene av fenolsyrer og flavonoler. Hydrolysen ble utført ved å blande 1 ml av ekstraktet med 4 ml hydrolyseløsning (1,2 M HCI inneholdende 50 prosent metanol) og plassert i et vannbad (Precision, modell 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta , OH, USA) ved 90 ◦C i 80 min. Deretter ble prøvene avkjølt til 25 ◦C etterfulgt av sonikering i 5 minutter. Hydrolysen av ekstraktet var ikke nødvendig for analyse av katekin og epicatechin. De hydrolyserte og ikke-hydrolyserte ekstraktene ble filtrert gjennom en 0,45 μm polytetrafluoretylen (PTFE)-membran før HPLC-analyser. For å analysere ellaginsyre, gallussyre, ferulinsyre, myricetin, quercetin, kaempferol, catechin og epicatechin, ble 10 µL injisert i en SB-C18-kolonne (4,6 × 250 mm, 5 µm, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA, CA, USA). De mobile fasene var (A) 0,5 prosent maursyre og (B) 100 prosent acetonitril. Strømningshastigheten var 1 ml/min med 25 min modifisert gradient som følger: 0–5 min, 10–30 prosent B; 5–10 min, 30–40 prosent B; 10–20 min, 40–50 prosent B; 20–25 min, 50–10 prosent B; etterfulgt av 5 min ekvilibrering. Kolonnens temperatur ble satt til 30 ◦C. Deteksjonsbølgelengden var 260 nm for ellaginsyre, gallussyre og ferulinsyre og 360 nm for myricetin, quercetin og kaempferol på en fotodiodearraydetektor. Eksitasjonen og emisjonen for katekin og epicatechin var henholdsvis 230 nm, 321 nm, ved bruk av en fluorescensdetektor. Polyfenolforbindelser ble kvantifisert ved å bruke standardkurver for ellaginsyre, gallussyre, ferulinsyre, myricetin, quercetin, kaempferol, katekin og epicatechin. Alle standardkurver hadde 7 punkter og R2 > 0,99. 2.5. Tilpasset design for kunstig nevrale nettverk Fire uavhengige ekstraksjonsvariabler med fire nivåer: vanninnhold (15–60 prosent), ultralydbehandlingstid (5–35 minutter), forhold mellom faststoff og løsemiddel (1:5–1:20) og ekstraksjon temperatur (30–60 ◦C) (tabell S1) ble brukt for å optimalisere ekstraksjonsutbyttet av fenolsyrer, flavonoler og flavanoler. I motsetning til de klassiske designene som responsoverflatedesignen, krever ikke ANN-basert design gjentatte kjøringer og foretrekker en annen datastruktur. I vår forrige studie [14] var ANN en mer pålitelig metode for å forutsi utvinningsutbytte enn RSM. Derfor ble ANN valgt i denne studien for å forutsi ekstraksjonsutbyttet av ellaginsyre, katekin og epikatekin. Et tilpasset design med 40 kjøringer (tabell S2) ble generert på JMP Pro (versjon 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) for å gi data spesifikt for ANN-prediktiv modellering. Randomisering av de 40 kjøringene ble brukt for å eliminere enhver skjevhet. Hovedligningen til ANN er vist som følger:=∑jj=1 wh jpg pluss bhk, k=1toK (1) der h er antall nevroner i det skjulte laget, j og k er henholdsvis antall inngangsvariabler og skjulte nevroner, p er inngangsvariabelen, bh er skjevheten til det skjulte laget, og wh er vekten i det skjulte laget. Ekstraksjonsutbytte av ellaginsyre, katekin og epicatechin i forhold til de fire uavhengige variablene ble analysert ved å bruke ANN ved å trene dataene først og deretter velge den beste aktiveringstypen og et antall nevroner som resulterer i en tilstrekkelig tilpasning av dataene. For å evaluere suksessen til prediksjonsmodeller har tre verdier blitt vurdert: R-kvadrat, kvadratroten av den gjennomsnittlige kvadratiske prediksjonsfeilen (RASE) (ligning (2)), og den gjennomsnittlige absolutte feilen (AAE). RASE er RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) Der SSE donerer for kvadrat og summerer prediksjonsfeilene (forskjeller mellom de faktiske svarene og de anslåtte svarene) og n for en rekke observasjoner. R-kvadrat nær 1 med RASE og AAE nær null betyr en høyere tilpasning av dataene til modellen. 2.6. Statistikk Ekstraksjonsutbytte av fenolsyrer, flavonoler og flavan-3-oler ble sammenlignet med enveis ANOVA etterfulgt av Students t-test ved p Mindre enn eller lik 0,05 ved bruk av JMP Pro (versjon 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Hver nde og 75 prosent etanol ble sammenlignet ved bruk av Dunnetts tester ved p Mindre enn eller lik 0,05. Prinsippkomponentanalyse (PCA) ble utført på JMP Pro (versjon 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) for fenolforbindelsene ekstrahert fra muscadine drueskall og frø. 3. Resultater og diskusjon 3.1. Polyfenoler ekstrahert av NDES fra muscadine drueskall Ni NDES og 75 prosent etanol ble brukt for utvinning av polyfenoler fra muscadine drueskall. Tabell 2 viser ekstraksjonsutbyttet av ellaginsyre, gallussyre, ferulinsyre, myricetin, quercetin, kaempferol, katekin og epicatechin. Ellaginsyre var den mest utvinnbare polyfenolen i drueskall, etterfulgt av henholdsvis gallussyre og ferulinsyre. Dette funnet stemte overens med tidligere studier [17,18]. NDES #1, #8, #7, #3, #2 og #9 ekstraherte betydelig høyere mengder ellaginsyre i drueskall enn 75 prosent etanol. Det høyeste ekstraksjonsutbyttet av ellaginsyre ble oppnådd av NDES #1 etterfulgt av NDES #8 ved henholdsvis 22,1 ± 2,2 mg/g og 21,3 ± 2,5 mg/g (tabell 2). Imidlertid var det ingen signifikant forskjell mellom NDES #1 og NDES #8 i henhold til Students t-test. Interessant nok ble NDES #1 funnet å være den minst effektive NDES for å trekke ut antocyaniner fra

tranebærrester [14]. Dette antydet at NDES #1 selektivt kan trekke ut ellaginsyre eller ellagitanniner fra matmatrise som også inneholder antocyanidiner. Slik selektivitet kan tilskrives forskjeller i de molekylære interaksjonene mellom NDES og spesifikke fenoliske klasser. Figur S1 (panel A) viser HPLC-kromatogrammet av gallussyre, ellaginsyre og ferulinsyre ekstrahert fra drueskall av NDES #1 og detektert ved 260 nm. 75 prosent etanol ekstraherte 12,7 ± 1,2 mg ellaginsyre per gram drueskall. Det laveste ekstraksjonsutbyttet av ellaginsyre ble observert i NDES #4 ved 7,44 ± 0,6 mg/g. Ekstraksjonsutbyttet av gallussyre ved NDES #9, #8, #1, #4, #7 og #3 var sammenlignbare og betydelig høyere enn 75 prosent etanol. Den høyeste mengden gallussyre ble ekstrahert av NDES #9 ved 10,4 ± 0,5 mg/g, mens den laveste mengden på 5,55 ± {{40}} 0,1 mg/g ble ekstrahert med NDES #5. Den høyeste mengden ferulsyre ble ekstrahert av NDES #1 ved 6,32 ± 0,7 mg/g og den laveste mengden ble ekstrahert av NDES #5 ved 3,11 ± 0.{{5{{52 }}}} mg/g. Videre var det ingen signifikant forskjell mellom NDES #1 og 75 prosent etanol ved ekstrahering av ferulsyre (tabell 2). Den høyeste mengden katekin og epicatechin ble ekstrahert av NDES #3 ved 0.61 ± 0.1 mg/g og 0.89 ± 0.1 mg/ g, henholdsvis (tabell 2). I mellomtiden ekstraherte NDES #3 og #6 betydelig større mengder epicatechin enn 75 prosent etanol. Figur S2 (panel A) viser HPLC-kromatogrammet av katekin og epicatechin ekstrahert av NDES #3 fra drueskallet. Katekin ble imidlertid ikke påvist i 75 prosent etanolekstraktet. De laveste mengdene av katekin (0.02 mg/g) og epicatechin ({{90}},14 mg/g) ble ekstrahert av NDES #2 og NDES # 5, henholdsvis. Myricetin var den mest tallrike flavonolen og kaempferol var minst. Dunnetts test avslørte at NDE og 75 prosent etanol var sammenlignbare når det gjaldt å ekstrahere myricetin, quercetin og kaempferol (tabell 2). Den høyeste myricetinmengden ble ekstrahert med NDES #1 (1,84 mg/g), etterfulgt av 75 prosent etanol (1,73 mg/g), og deretter NDES #8 (1,67 mg/g). Den høyeste mengden quercetin ble ekstrahert med 75 prosent etanol (0,41 mg/g), NDES #1 (0,40 mg/g) og NDES #8 ({ {143}},38 mg/g). Derimot ble de laveste mengdene myricetin og quercetin ekstrahert av NDES #5 ved henholdsvis 0.87 mg/g og 0.27 mg/g. Dette funnet understreker ytterligere en generell svak evne til NDES #5 til å trekke ut polyfenoler fra drueskallet. Den høyeste kaempferolmengden ble ekstrahert med 75 prosent etanol (0.05 mg/g), og den laveste ble ekstrahert med NDES #5 og NDES#6 (0,03 mg/g). Figur S1 (panel B) viser HPLC-kromatogrammet av myricetin, quercetin og kaempferol ekstrahert fra drueskall ved NDES #1 detektert ved 360 nm. Den høyeste summen av fenolsyrer, flavonoler og flavanoler var 40,7 mg/g ekstrahert med NDES #1 etterfulgt av 39,8 mg/g ekstrahert med NDES #8, mens den laveste summen var 18,4 mg/g ekstrahert av NDES #5 (tabell 2). pH til NDES varierte mellom 0,3 og 3,3 (tabell 1). Rsquared-korrelasjonen mellom pH til NDE-er og fenolsyrer, flavonoler og flavanoler ble oppført i tabell 2. Mangelen på korrelasjon mellom pH og ekstraksjonsutbytte antydet at pH ikke påvirket ekstraksjonseffektiviteten. 3.2. Polyfenoler ekstrahert av NDES fra muskadin-druefrø. Det samlede ekstraksjonsutbyttet av fenolsyrer, flavonoler og flavanoler fra druefrø var merkbart lavere enn fra skall (tabell 3). De vanligste ekstraherbare polyfenolene i frøene var katekin og epicatechin, mens kaempferol ikke ble påvist. Den komplekse frømatrisen som inneholder olje (13 prosent, w/w tørr base) er en mulig forklaring på den lave ekstraherbarheten til fenolforbindelser fra druefrøene [19]. Den høyeste mengden katekin ble ekstrahert med NDES #3 ved 2,77 mg/g (tabell 3). Dette utbyttet var betydelig høyere enn alle andre NDES og 75 prosent etanol. Figur S2 (panel B) viser HPLC-kromatogrammet av katekin og epicatechin ekstrahert av NDES #3 fra druefrø. Den laveste mengden katekin ble ekstrahert med NDES #5 ved 0,30 mg/g. Alle NDES unntatt NDES #1, #2 og #9 ekstraherte signifikant høyere mengder epicatechin enn 75 prosent etanol (tabell 3). De høyeste epicatechinkonsentrasjonene ble ekstrahert med NDES #4 (0,71 mg/g) og NDES #5 (0,68 mg/g), mens den laveste ble ekstrahert med 75 prosent etanol (0,11 mg/g). Gallussyre var den mest utvinnbare fenolsyren i druefrøene, etterfulgt av henholdsvis ferulsyre og ellaginsyre. Den høyeste mengden gallussyre ble ekstrahert av NDES #4 ved 0,45 mg/g, etterfulgt av NDES #9 og NDES #8. Disse NDE-ene ekstraherte betydelig høyere mengder gallussyre enn 75 prosent etanol. Den laveste mengden gallussyre (0,2 mg/g) ble ekstrahert med NDES #3. Det høyeste uttaket

utbytte av ellaginsyre ble oppnådd ved NDES #9 (0.26 mg/g) etterfulgt av NDES #6 (0.17 mg/g), som var signifikant høyere enn 75 prosent etanol. Tilsvarende ekstraherte NDEs #3 den laveste ellaginsyremengden ved 0.05 mg/g. I tillegg ekstraherte NDES #6, #7 og #3 betydelig høyere mengder ferulsyre enn 75 prosent etanol. Det laveste ferulsyreekstraksjonsutbyttet var 0,5 mg/g ved NDES #5. Videre ble ikke ferulsyre påvist i NDES #9-ekstrakt. Dette var sannsynligvis fordi løseligheten til ferulsyre var lavere i NDES #9 enn i andre NDEer. Det høyeste myricetinekstraktet ble oppnådd med 75 prosent etanol og NDES #7 ved 0.18 mg/g, som var høyere enn alle NDE. Det høyeste quercetinekstraksjonsutbyttet var ved NDES #6 (0,14 mg/g) og NDES #3 (0,13 mg/g), og begge NDES var bedre enn 75 prosent etanol. På samme måte påvirket ikke pH til NDES ekstraksjonsutbyttet som indikert av den lave korrelasjonen (R-kvadrat) mellom pH til NDE og utbytte av fenolsyrer, flavonoler og flavanoler oppført i tabell 3. 3.3 . Hovedkomponentanalyse (PCA) ble utført for å assosiere ekstraksjonsutbyttet av forskjellige fenolforbindelser i drueskall og frø med NDE-er og 75 prosent etanol (fig. 1). PCA ble utført på en korrelasjonsmatrise for å oppdage en mulig selektivitet av noen NDE-er for å ekstrahere spesifikke fenoliske forbindelser eller grupper. Omtrent 85 prosent av variansen av huddata ble forklart av hovedkomponentene 1 og 2. Lasteplottet (fig. 1B) viser en høy korrelasjon mellom fenolsyrer (ellaginsyre, gallussyre, ferulinsyre) og flavonoler (myricetin, quercetin, og kaempferol). For å trekke ut disse gruppene er de beste løsningsmidlene NDES #1, #8, #7 og 75 prosent etanol som vist i poengsummen (fig. 1A). I mellomtiden så catechin og epicatechin ut atskilt fra resten av fenolgruppene. Som vist i fig. 1A var NDES #3 selektiv for å ekstrahere katekin og epicatechin fra drueskall. Dette var en interessant observasjon fordi NDES #3 var blant de minst effektive NDES for å ekstrahere proanthocyanidiner, som er oligomerer og polymerer av katekin og epicatechin [14]. Dette antydet at NDES #3 kan være selektiv for proantocyanidiner med mindre molekylstørrelser. Klynger av fenoliske forbindelser på belastningsplottet av skallet (fig. 1B) var forskjellig fra frøet (fig. 1D) uavhengig av de lave utbyttene av disse forbindelsene i druefrøene. Den første og andre hovedkomponenten forklarte omtrent 73 prosent av variansen til frødata. Quercetin, myricetin og ferulsyre ble ekstrahert mer effektivt av NDES #6, #7 og 75 prosent etanol, som vist i poengsummen (fig. 1C). Ellaginsyre og gallussyre ble ekstrahert mer effektivt av NDES #9. Nok en gang ble katekin ekstrahert med den høyeste effektiviteten av NDES #3 som var lik det som ble observert med drueskall. Epicatechin ble ekstrahert med høyere effektivitet av NDES #5, #4 og NDES #8.

3.4. Ekstraksjonsoptimalisering av fenolsyrer og flavonoler fra muskadindrueskall og ANN prediksjonsmodellering Kolinklorid: levulinsyre: etylenglykol 1:1:2 (NDES #1) viste det høyeste ekstraksjonsutbyttet for ellaginsyre, og ble derfor valgt for ytterligere optimalisering og forutsigelse. Virkningene av fire faktorer, inkludert vanninnhold, ultralydbehandlingstid, forhold mellom faststoff og løsemiddel og ekstraksjonstemperatur ble vurdert for ekstraksjon av fenolsyrer og flavonoler. Videre ble fire nivåer for hver ekstraksjonsfaktor brukt i totalt 40 randomiserte kjøringer. Det eksperimentelle ekstraksjonsutbyttet av ellaginsyre, gallussyre, ferulinsyre, myricetin og quercetin, sammen med summen av disse fem, er vist i tabell 4. Samlet sett var forskjellen i ekstraksjonsutbyttet mellom den laveste og den høyeste relativt stor for fenolsyrer. For eksempel var det laveste utbyttet for ellaginsyre 9.03 mg/g (kjøring #17) og det høyeste var 25,3 mg/g (kjøring #15), noe som resulterte i en forskjell på 16,2 mg/g (kjør #17). Dessuten var den laveste summen av utbytte 20,7 mg/g, og den høyeste var 71,5 mg/g. Dette illustrerer de betydelige virkningene av de ulike nivåene av hver ekstraksjonsfaktor på utvinningsutbyttet. Kjøre #15 ekstraherte den høyeste mengden ellaginsyre. Ekstraksjonsbetingelsen for kjøring #15 var 45 ml /10{{130}} ml vanninnhold, 25 minutter med ultralydbehandling, 1:10 (g: ml) forhold mellom faststoff og løsemiddel og ekstraksjonstemperatur på 60 ◦C. Figur S3 viser HPLC-kromatogrammet av optimaliserte fenolsyrer ekstrahert fra drueskall ved NDES #1 (kjøring #15 i tabell 4). Den høyeste gallussyren (18,7 mg/g) ble oppnådd ved bruk av ekstraksjonsbetingelsene i kjøring #24 og den laveste var 6,63 mg/g ved bruk av kjøring #40. For ferulsyre ekstraherte kjøring #22 den høyeste mengden ved 19,2 mg/g, mens ingen ferulsyre ble påvist i kjøring #14, #17, #29 og #34. Forsøk #22 ble ekstrahert med 60 ml/100 ml vanninnhold, 5 minutter med ultralydbehandling, 1:5 for forhold mellom faststoff og løsemiddel og ekstraksjonstemperatur på 60 ◦C. Forsøk #2 ekstraherte det høyeste myricetinet (10,1 mg/g) og quercetin (1,87 mg/g). Ekstraksjonsbetingelsene for kjøring #2 var 60 ml/100 ml vanninnhold, 35 minutter med ultralydbehandling, 1:20 for forhold mellom faststoff og løsemiddel og ekstraksjonstemperatur på 60 ◦C. Det laveste min sikre utbytte (3,79 mg/g) ble ekstrahert ved kjøring #40. Konturplottene i fig. 2 viser effekten av ekstraksjonsparametere (X1, X2, X3 og X4) på ​​det forutsagte utbyttet av ellaginsyre ekstrahert av NDES #1 fra drueskallet. De forutsagte utbyttene av ellaginsyre i tabell 4 ble benyttet for å konstruere disse telleplottene. Hvert panel illustrerer virkningen av 2 ekstraksjonsparametere. Konturlinjene er merket med utbyttet av ellaginsyre (mg/g). Det optimale forutsagte vanninnholdet var omtrent 35–45 mL/100 mL NDES, som vist i fig. 2B og 2C. Lengre ultralydbehandlingstid økte utbyttet av ellaginsyre (fig. 2D og 2E), noe som indikerer en kritisk rolle for sonikering i NDES-ekstraksjon. Under ekstraksjonen introduserte blanding av drueskall eller frø med NDES partikler og gass, noe som la til akustiske kavitasjonssteder for ultralyd for å generere mange små bobler i NDES. Imploderingen av disse boblene førte til ekstrem temperatur, trykkforskjell, høy skjærkraft, makroturbulenser og mikroblanding, som effektivt agiterte NDES for å akselerere massediffusjon og overføring. Når kavitasjonsbobler imploderte på overflaten av druefrø- eller skallpartikler, førte de resulterende mikrostrålene og inter-partikkelkollisjonene til overflateavskalling, erosjon, partikkelnedbrytning, sonoporasjon og celleforstyrrelse [20]. Alle disse mekaniske effektene av ultralyd-indusert kavitasjon intensiverte penetrasjonen av NDE-er til cellens indre slik at intercellulære fenoler fra matmatrisen ble overført til løsemidler. Det optimale forholdet mellom faststoff og løsemiddel var 1:10, som indikert av fig. 2B, 2D og 2F. Til slutt ser høyere ekstraksjonstemperaturer opp til 60 ◦C ut til å ha en positiv effekt på ellaginsyreekstraherbarheten som vist i fig. 2C, 2E og 2F. Dette antyder en direkte sammenheng mellom ekstraksjonstemperatur og utbyttet av ellaginsyre ekstrahert fra drueskallet. Ellaginsyreekstraksjonsutbytte (tabell 4) ble analysert for prediksjonsmodellering ved bruk av kunstig nevrale nettverk. De eksperimentelle dataene ble tilfeldig delt inn i et treningssett og et valideringssett. Grunnen til å inkludere en validering satt av den statistiske programvaren er å undertrykke overfitting. For å forutsi ellaginsyreutbytte (Y), ble de samme fire uavhengige ekstraksjonsfaktorene (X1, X2, X3 og X4), 1–2 skjulte lag med et annet antall nevroner og tre aktiveringsfunksjoner vurdert. De anvendte aktiveringsfunksjonene var hyperbolsk tangent, lineær og gaussisk. Deretter ble datasettene trent til en høy R-kvadratverdi for både trening og validering ble nådd. Prediksjonsdataene og en modell ble generert. Den beste ANN-strukturen ble valgt ved å analysere de fire inngangene (X1, X2, X3 og X4) med ett skjult lag ved å bruke den Gaussiske funksjonen med ti nevroner (Figur S5). R-kvadraten for trenings- og valideringssett var 0,99, mens RASE og AAE for modellen var henholdsvis 0,062 og 0,044. R-kvadraten for ANN-valideringen av ellaginsyre i denne studien (0,99) var høyere enn ANN-valideringen av procyanidiner (0,95) og antocyaniner (0,91) i en tidligere studie [14]. Imidlertid kan denne økningen i R2 tilskrives den bedre genererte modelltilpasningen til dataene i denne studien, noe som kan skyldes de mindre eksperimentelle feilene. De prediktive ANN-modellene for utvinning av ellaginsyre ved bruk av NDES #1 ble vist som ligning 3–13:

Cistanche for å forbedre immuniteten

Konklusjon

Nåværende funn presenterte ytterligere bevis på effektiviteten til NDES-evner til å trekke ut polyfenoler fra biprodukter fra næringsmiddelindustrien. Resultatene støttet hypotesen om en overlegen ultralydsassistert ekstraksjon av NDES over 75 prosent etanol. NDES ekstraherte effektivt tre fenolsyrer, to flavonoler og tre flavan-3-oler fra drueskall og frø. NDES #1 var den mest effektive NDES for å ekstrahere ellaginsyre, mens NDES #3 var spesielt selektiv for å ekstrahere katekin og epicatechin. En merkbar ulempe med NDES er deres høye viskositet, som byr på utfordringer under håndtering og gjenvinning. I denne studien demonstrerte kunstig nevrale nettverk, uavhengig av utfallsbegrensninger, en praktisk tilnærming for prediktiv modellering. NDE-er er robuste medier for å gjenvinne fytokjemikalier fra matsystemer. Noen NDE-er presenterer også et mindre giftig løsningsmiddel for å studere disse fytokjemikaliene i levende celler [21,22]. Endelig er naturlige dypeutektiske løsemidler effektive alternative ekstraksjonsmedier til organiske løsemidler.

Referanser

[1] W. Bi, M. Tian, ​​KH Row, Evaluering av alkoholbasert dypeutektisk løsningsmiddel ved ekstraksjon og bestemmelse avflavonoidermed responsoverflatemetodikkoptimalisering, J. Chromatogr. A 1285 (2013) 22–30, https://doi.org/10.1016/j. chroma.2013.02.041.
[2] M. Cvjetko Bubalo, N. ´ Curko, M. Tomaˇsevi´c, K. Kovaˇcevi´c Ghani's, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, Grønn ekstraksjon av drueskallfenoler ved bruk av dypeutektiske løsemidler, Food Chem. 200 (2016) 159–166, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2016.01.040.
[3] M. Panic, V. Gunjevi´c, G. Cravotto, I. Radojˇci´c Redovnikovi´c, muliggjørende teknologier for utvinning av antocyaniner av druerester ved bruk av naturlige dype eutektiske løsemidler i partier på opptil en halv liter utvinning av antocyaniner av druerester ved bruk av NADES, Food Chem. 300 (2019) 125185, https://doi.org/ 10.1016/j.foodchem.2019.125185.
[4] M. Hoffmann, et al., Muscadine Grape Production Guide for the Southeast, North Carolina State University, NC State Extension Publications, 2020 https://content. ces.ncsu.edu/muscadine-grape-production-guide (åpnet 18. januar 2021). [5] Cline, B. og C. Fisk, Oversikt over muscadinedrueareal, kultivarer og produksjonsområder i det sørøstlige USA. Muscadine Grape Workshop for Cooperative Extension Agents, i The Southern Region Small Fruit Consortium. 2006: Sør-regionen småfruktkonsortium.
[6] PC Andersen A. Sarkhosh D. Huff J. Breman 2020 6 10.32473/edis-hs100-2020.
[7] P. Greenspan, et al., Antiinflammatoriske egenskaper til muskadinedruen (Vitis rotundifolia), J. Agric. Mat. Chem. 53 (22) (2005) 8481–8484, https://doi.org/ 10.1021/jf058015.
[8] DN Ignacio, KD Mason, EC Hackett-Morton, C. Albanese, L. Ringer, WD Wagner, PC Wang, MA Carducci, SK Kachhap, CJ Paller, J. Mendonca, L. Li Ying Chan, Bo Lin, DK Hartle, JE Green, CA Brown, TS Hudson, Muscadine drueskallekstrakt hemmer prostatakreftceller ved å indusere cellesyklusstans og redusere migrasjon gjennom varmesjokkprotein 40, Heliyon 5 (1) (2019) e01128, https://doi .org/10.1016/j.heliyon.2019.e01128.