Cistanche for å behandle betennelse og nyresykdom: Hva er årsaken til den patogene rollen til betennelse i nyreinvolvering i cystinopati?

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com

Interaksjon mellom galectin-3 og cystinosin avdekker en patogen rolle av betennelse i nyrenes involvering av cystinose

Tatiana Lobry^1,2 et al

Betennelseer involvert i patogenesen av mange lidelser. Imidlertid er de underliggende mekanismene ofte ukjente. Her tester vi omcystinose, proteinet som er involvert icystinose, er en kritisk regulator av galectin^-3, et medlem av b-galaktosidase-bindende proteinfamilien, underbetennelse. Cystinoseer en lysosomal lagringsforstyrrelse og, til tross for det allestedsnærværende uttrykket av cystinose, ernyreer det primære organet som er påvirket av sykdommen.Cystinoseble funnet å forbedre lysosomal lokalisering og nedbrytning av galectin-3. I Ctns^–/–mus, en musemodell avcystinose, er galectin-3 overuttrykt inyre. Fraværet av galectin-3 hos cystinotiske mus forbedrer patologisk nyrefunksjon og struktur og reduserer makrofag/monocyttinfiltrasjon i nyrene til Ctns^–/–Gal3^–/–mus sammenlignet med Ctns^–/– mus. Disse dataene tyder sterkt på at galectin-3 mediererbetennelseinvolvert inyresykdomsprogresjon i cystinose. Videre ble galectin-3 funnet å interagere med det pro-inflammatoriske cytokinet MonocyteChemoattractant Protein-1, som stimulerer rekrutteringen av monocytter/makrofager, og viste seg å være betydelig økt i serumet til Ctns–/– mus og også pasienter medcystinose. Derfor fremhever funnene våre en ny rolle for cystinose og galektin-3-interaksjon i betennelse og gir en ekstra mekanistisk forklaring pånyresykdom av cystinose. Dette kan føre til identifisering av nye legemiddelmål å utsettecystinoseprogresjon.

SØKEORD:Kronisk nyre sykdom; cystinose; galectin-3;betennelse; monocyttkjemoattraktant protein–1

cistanche kan behandle kronisk nyresykdom og cystinose

Grunnårsaken til betennelse er at nitrogenoksid kan føre til produksjon av betennelsesceller.Cistancheer en verdifull kinesisk urtemedisin. Dens aktive ingredienser kan hemme utskillelsen av nitrogenoksid og spille en rolle i å forebygge og behandle betennelse og nyresykdom.

Oversettelseserklæring

Til tross for behandling utvikler pasientene seg fortsatt til nyresvikt i sluttstadiet. I denne studien viste vi at fraværet avcystinoseresulterer i svekket galectin-3 (Gal-3) lysosomal nedbrytning, noe som fører tilbetennelseog progresjonen avKronisk nyre sykdomicystinose. Disse funnene åpner nye perspektiver på potensielle terapeutiske mål som kan begrense eller forsinke nyredegenerasjon hos pasienter medcystinose. Som sådan kan antiinflammatoriske legemidler og hemmere av Gal-3 som ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler eller indometacin forbedre nyrepatogenesen ved cystinose.

Betennelseer en normal akutt respons fra en organisme på skade eller infeksjon,¹men kroniskbetennelseer assosiert med vevsskade. Ved kroniske sykdommer, som diabetes, aktiverer skadet vev immunsystemet, noe som fører til en kontinuerlig inflammatorisk respons og til slutt vevsdegenerasjon.² Cytokiner er nøkkelmodulatorer avbetennelseog er i stand til å aktivere eller løse problemetbetennelseprosess.3 Hos pasienter medKronisk nyre sykdom(CKD), forhøyet plasmakonsentrasjon av cytokiner (interleukin [IL]-6 og tumornekrosefaktor-a) ogbetennelsemarkører (C-reaktivt protein, IL-6, hyaluronan og neopterin) er assosiert med progresjon til sluttstadium nyresykdom.4 Å forstå de spesifikke mediatorene som utløser inflammatoriske responser letter oppdagelsen av passende medikamentmål for å forhindre degenerativ skade .

Cystinoseer en autosomal-recessiv metabolsk sykdom som tilhører familien lysosomale lagringsforstyrrelser og er preget av akkumulering av cystin i alle organer.⁵ Genet er defekt icystinoseCTNS, koder for den lysosomale cystin/proton-kotransportøren, cystinose.^6,7 Selv om CTNS er allestedsnærværende uttrykt, er detnyreer det første organet som påvirkes hos personer medcystinose. Pasienter har vanligvis Fanconis syndrom i sitt første leveår, preget av alvorlige væske- og elektrolyttforstyrrelser, dårlig vekst og rakitt.⁸CKD utvikler seg deretter, som utvikler seg til nyresykdom i sluttstadiet og krevernyretransplantasjon. Cystinakkumulering i alt vev fører til slutt til multiorgan dysfunksjon; pasienter opplever fotofobi og blindhet, hypotyreose, hypogonadisme, diabetes, myopati og forverring av sentralnervesystemet.⁹ I C57BL/6-bakgrunnen, en knockout-musemodell (Ctns^–/–) 10 replikerer nyrefenotypen til cystinotiske pasienter,¹¹ samt avsetning av cystinkrystaller i hornhinnen¹²og skjoldbrusk dysfunksjon.¹³

I denne studien avslører vi en ny rolle forcystinoseibetennelsegjennom samspillet med Gal-3. Gal-3 er medlem av lektin- og b-galaktosid-bindende proteinfamilien ²¹ og er involvert i flere biologiske funksjoner, inkludertbetennelse.²²I sammenheng mednyresykdommer, ble Gal-3-hemming vist å redusere pro-inflammatorisk markøruttrykk og nyrefibrose og forhindre nedgang i glomerulær filtrasjonshastighet i hyperaldosteronisme-, hypertensjon- eller fedmemodeller.^23–26Her gir vi bevis på at icystinose, fraværet avcystinosefører til Gal-3 overuttrykk inyrer, som forbedrer makrofaginfiltrasjon og CKD-progresjon. I tillegg identifiserer vi monocyttkjemoattraktant protein–1 (MCP-1) som en potensiell mediator, og avslører nye genmål for medikamentell behandling.RESULTATER Gal-3 interagerer med cystinose via sitt karbohydratgjenkjenningsdomene For å identifisere spesifikk interaksjon partnere som bruker kvantitativ massespektrometri, Madin-Darby hundnyre(MDCK) celler ble transdusert med en lentiviral konstruksjon for å stabilt uttrykke cystinose-grønt FL fluorescerende protein (GFP) fusjonsprotein. I tillegg til de 9 underenhetene av vakuolær type Hþ adenosintrifosfatase publisert tidligere,¹⁹Gal-3 ble identifisert som et av proteinene som interagerte medcystinose(Figur 1a). Denne interaksjonen ble ytterligere bekreftet ved ko-immunutfelling etterfulgt av Western blotting (figur 1b og c). I tillegg viste vi at interaksjonen mellom Gal-3 ogcystinoseble mediert av Gal-3 karbohydratgjenkjenningsdomenet (CRD) lokalisert i den C-terminale halen av proteinet. Interaksjonen ble hemmet av tiodigalaktosid, en potent hemmer av galektin-karbohydrat-interaksjoner (figur 1d). Som alle galektiner har Gal-3 en affinitet for glykosylerte proteiner,21 så det er sannsynlig at interaksjonen med Gal-3 skjer gjennom den cystinoseglykosylerte delen lokalisert i den intralysosomale N-terminale halen av proteinet.²⁷

Cystinosin forbedrer Gal-3 lysosomal lokalisering og nedbrytning

For å bekrefte den potensielle lysosomale lokaliseringen av Gal-3 når den samhandler medcystinose, viste vi at Gal-3, i likhet med cathepsin D (en intralysosomal protease), ble beskyttet mot fordøyelse av proteinase K, mens begge proteinene ble fordøyd når lysosomer ble permeabilisert med Triton X- 100 (Figur 2a og tillegg Figur S1). Lignende data ble oppnådd i lysosomer isolert fra muselever, som bekrefter lysosomal lokalisering av Gal-3 in vivo (figur 2b og c). På grunn av fraværet av et pålitelig antistoff å oppdagecystinose, ble immunfarging utført påcystinose-GFP – som uttrykker MDCK-cellelinjer med et anti-Gal-3-antistoff. Det bekreftet tilstedeværelsen av Gal-3 i lysosomenes lumen, mens cystinosis-GFP og Lamp-2 (et lysosomalt transmembranprotein) bare ble funnet ved membranen til vesiklene (Figur 2d).

For å undersøke omcystinosinvar involvert i Gal-3-trafikk, analyserte vi dynamikken til beggecystinoseog Gal-3-positive vesikler ved bruk av tofargede levende celler total intern refleksjon FL fluorescensmikroskopi i museembryonale fibroblaster (MEF) fra villtype (WT) og Ctns^–/–mus som uttrykker både CTNS-DsRed og Gal-3–GFP. Vår analyse bekreftet detcystinoseog Gal-3 gjennomgår ekte kolokalisering i Ctns–/– MEFs som validert av den lignende spatiotemporale fordelingen av disse molekylene i den totale interne refleksjons-FL-fluorescensmikroskopi-sonen (Figur 2e). Data i WT MEF-er var like (data ikke vist). Dessuten, når MEF-er transfektert bare med Gal- 3-GFP ble analysert, ble Gal-3-GFP funnet i cytoplasmaet og ingen distinkt vesikulær struktur ble observert, i motsetning til co-transfeksjonen med CTNS-DsRed ( data vises ikke).

Disse dataene ble bekreftet i 293T-celler, der et sterkt GFP-signal i cytoplasmaet ble observert i celler som bare uttrykker Gal-3–GFP, mens i celler som uttrykker både Gal-3–GFP ogcystinosin-DsRed, Gal-3–GFP var hovedsakelig lokalisert innenfor cystinose-DsRed-uttrykkende lysosomer (figur 3a). Videre kvantifisering av Gal-3-proteinekspresjon i celler transfektert med Gal-3–GFP alene eller Gal- 3–GFP og CTNS-DsRed, og Gal-3–GFP og DsRed som kontroll, viste signifikant mindre Gal-3-GFP-proteiner i celler co-transfektert med CTNS-DsRed sammenlignet med celler transfektert med Gal-3-GFP alene eller co-transfektert med DsRed (figur 3b). Alt i alt tyder disse resultatene på detcystinosinforbedrer den lysosomale lokaliseringen og nedbrytningen av Gal-3. Cystinosin ble vist å være involvert i CMA.28 Varmesjokk 70 kDa protein (Hsc70) deltar i CMA ved å hjelpe til med utfolding og translokasjon av substratproteiner over membranen inn i det lysosomale lumen på en LAMP2A-avhengig måte.29,30 Fordi Gal{ {8}} ble foreslått degradert av CMA,31 vi undersøkte lokaliseringen av Gal-3 i forhold til Hsc70 i cystinotiske MEF-er. Konfokal mikroskopianalyse bekreftet kolokaliseringen av Gal-3–GFP ved Hsc70- positive strukturer i både WT (data ikke vist) og Ctns^–/–celler (figur 3c), som støtter samtransporten av Gal-3 med Hsc70 og antyder at lysosomal internalisering, men ikke Gal-3-gjenkjenning av chaperonen er defekt icystinose.

Gal-3 er involvert i nyrebetennelse i Ctns^–/–mus

For å studere rollen til Gal-3 icystinosein vivo genererte vi en dobbel knockout-musemodell som var mangelfull i beggecystinosinog Gal-3 (Ctns^–/–Gal-3^–/–mus). WT, Ctns^–/–, og Gal-3^–/–mus ble brukt som kontrollpersoner. I C57BL/6 Ctns^–/–mus, nyreanomalier vises rundt 10 måneders alder.11 Derfor ble studier utført etter 8 til 9 måneder, danyreanomalier begynner å bli oppdaget, og etter 12 til 15 måneder når nyreavvik har utviklet seg. Fordi cystininnholdet ble funnet å være forskjellig i mannlige og kvinnelige Ctns^–/– nyrer, ble de analysert separat. Hvis cystininnholdet øker med alderen i begge genotypene, ble det ikke observert noen signifikant forskjell i hann- og hunnnyrer mellom Ctns–/– Gal-3–/– musene og Ctns^–/– mus ved 8 til 9 måneder og 12 til 15 måneder gamle (figur 4a).

Nyrefunksjonen ble vurdert i serum og urin og ingen signifikant forskjell ble observert mellom WT og Ctns^–/–mus ved 8 til 9 måneder (data ikke vist), men ved 12 til 15 måneder, Ctns^–/–mus viste signifikant høyere serumkreatinin- og ureanivåer sammenlignet med WT-mus. Interessant nok, Ctns^–/–Gal-3^–/–mus viste forbedret nyrefunksjon sammenlignet med Ctns^–/–mus ved 12 til 15 måneder, med lavere serumkreatinin (P < 0.05) og urea (P < 0,05; Tabell 1).

Histologiske studier av 8- til 9-måned gammel og 12- til 15-måned gammel musnyreseksjoner avdekket tilstedeværelsen av alvorlige anomalier i Ctns^–/– nyrer, inkludert tubulær atrofi, tilbaketrukne glomeruli og mononukleære infiltrater. Blind analyse av nyreseksjoner varierte omfanget av kortikal skade fra 1 (bevart vevsstruktur) til 6. Gjennomsnittlig poengsum for Ctns^–/–mus var 2.64 - 0.36 ved 9 måneders alder (n ¼ 7) og 4.12 0.37 ved 12 til 15 måneders alder (n ¼ 16). I nyrene til Ctns^–/–Gal-3^–/–mus på samme alder, var disse anomaliene betydelig mindre omfattende: 1.62 - 0.11 etter 9 måneder (n ¼ 21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" test)="" og="" 3.04="" -="" 0.22="" ved="" 12="" til="" 15="" måneder="" (n="" ¼="" 33;="" p="">< 0,05,="" mann-whitney="" t-test)="" (figur="" 4b="" og="" tilleggsfigur="" s2).="" dessuten="" ble="" en="" prosentandel="" av="" tubulær="" atrofi="" tildelt="" hvert="" vev,="" og="" gjennomsnittet="" for="">^–/–mus og Ctns^–/–Gal-3^–/–mus var henholdsvis 66 prosent og 42 prosent etter 12 til 15 måneder (P ¼ 0.01). Videre en slående forskjell mellom Ctns^–/–og Ctns^–/– Gal-3^–/– nyreseksjoner var tilstedeværelsen av få mononukleære infiltrater i Ctns^–/–Gal-3^–/–seksjoner, mens tunge infiltrater konsekvent ble observert i Ctns^–/– nyre(Figur 4b).

Vi karakteriserte de mononukleære infiltratene observert ved histologisk undersøkelse i 8- til 9-måned gamle Ctns^–/– nyrersom makrofager/monocytter ved co-immunfarging med CD68 og CD45 og med CD68 og hovedhistokompatibilitetsklasse II (tilleggsfigur S3), men ikke med CD68 og CD163, noe som tyder på at disse makrofagene har en M1--lignende proinflammatorisk profil.32 ,33 Kvantifisering av CD68- positive celler avslørte betydelig færre makrofager/monocytter i WT, Gal-3^–/–, og Ctns^–/–Gal-3^–/– nyrersammenlignet med Ctns^–/– nyrer(Figur 4c), som bekrefter de histologiske dataene (Figur 4b).

Til sammen antyder disse funnene at Gal-3 er involvert i rekruttering av makrofager/monocytter i cystinotiskenyrerog at dets fravær forbedrer nyresykdominCtns^–/–mus. Derfor tyder det på detbetennelseer ansvarlig, i det minste delvis, for nyreforringelse i Ctns^–/– mus.

Ctns-mangelfulle nyrer viser Gal-3 overuttrykk

Ved å bruke Western blot-analyse fant vi at Gal-3-uttrykket ble betydelig økt inyrerav 12-måned gammel Ctn^s–/–mus sammenlignet med WT-mus (figur 5a og b). For å undersøke om dette økte uttrykket av Gal-3 er spesifikt for Ctns^–/– nyrer, kvantifiserte vi Gal-3-uttrykk ved transkripsjons- og proteinnivåene inyrerfra mus med CKD indusert ved standard subtotal 2-trinns nefrektomioperasjon og fra dyrene som gjennomgikk en falsk operasjon. WT og Ctns^–/–mus ble brukt som kontrollpersoner. Gal-3 transkripsjoner var signifikant økt i Ctns–/– og sham nyrer, men sterkt økt i CKDnyrersammenlignet med WT-mus (Figur 5c). I kontrast, på proteinnivå, ble Gal-3 bare påvist i Ctns^–/–nyrer, noe som tyder sterkt på at bare Ctns^–/–nyrene var ikke i stand til å bryte ned Gal-3-protein (figur 5d). Immunfluorescerende farging av Gal-3 i murinnyreved 8 til 9 måneder viste også overekspresjon av Gal-3 i Ctns^–/– nyrersammenlignet med WTnyrer(Figur 5e). Dessuten ble Gal-3 uttrykt av CD68þ makrofager, så vel som nyreceller i Ctns^–/– nyrerved 8 til 9 måneder (tilleggsfigur S4). Til sammen stemmer disse dataene med redusert Gal-3-nedbrytning i fravær avcystinosesom vist in vitro (figur 3a og b), som fører til akkumulering av Gal-3-protein i Ctns^–/– nyrer.

Fraværet av cystinosin fører til økt serum MCP-1 via Gal-3 oppregulering

Gal-3 regulererbetennelsegjennom ulike mekanismer.34 Altså for å få ytterligere innsikt i mekanismen icystinose, undersøkte vi uttrykket av forskjellige pro-inflammatoriske eller anti-inflammatoriske cytokiner i serumet til 12- til 15-måned gamle WT, Ctns^–/–, Gal-3^–/–, og Ctns^–/–Gal- 3^–/–mus. Seks cytokinnivåer ble målt med musecytometrisk perlearray, MCP-1, interferon-g, tumornekrosefaktor og IL-10, IL-6 og IL-12p70. Bare MCP-1-ekspresjon ble signifikant økt i Ctns–/– museserum sammenlignet med WT og Gal-3–/– mus og også til Ctns^–/–Gal-3^–/–mus, hvis MCP-1-serumnivåer var sammenlignbare med WT-mus (figur 6a). MCP-1 produseres av forskjellige celletyper, hvor hovedkilden til MCP-1 er makrofager og monocytter,35 og fungerer som en kjemoattraktant for monocytter og makrofager som regulerer deres migrasjon og infiltrasjon. I motsetning til samme alder ble Gal-3-ekspresjonen funnet å være lik i serumet til Ctns–/–-mus (44,33 9,81 ng/ml; n ¼ 5) og WT-mus (40.{{12} },41 ng/ml; n ¼ 7).

Forholdet mellom Gal-3 og MCP-1 ble videre undersøkt ved co-immunutfelling ved bruk av Gal-3–GFP og MCP-1–DsRed– eller Gal-3– GFP og CTNS-DsRed – (som en positiv kontroll) som uttrykker 293T-celler. Interaksjon mellom Gal-3 og MCP-1 ble observert (figur 6b), noe som tyder på en direkte induksjon av MCP-1 av Gal-3. Inkubasjon med N-Acetyl-D-laktosamin (LacNAc), en hemmer av Gal-3 CRD, viste at i motsetning tilcystinosininteraksjon, CRD er ikke involvert i interaksjonen mellom Gal-3 og MCP-1 (figur 6c).

For å vurdere om dette funnet er relevant hos mennesker, målte vi Gal-3 og MCP-1-nivåer hos pasienter medcystinosesom ikke gjennomgikk immunsuppressiv behandling eller tok betennelsesdempende medisiner. Selv om Gal-3-nivået ble funnet å være litt økt i serumet til pasienter med cystinose sammenlignet med friske donorer, var forskjellen ikke signifikant (figur 6e), noe som bekrefter resultatene våre oppnådd i Ctns^–/–mus. Bare 2 pasienter hadde et høyt Gal-3-nivå (25,34 og 39,54 ng/ml); de ble ansett som uteliggere og ble dermed ikke inkludert i figur 6e. I motsetning til dette, ved bruk av en enzymkoblet immunosorbentanalyse rettet mot humant MCP-1 (Figur 6d), ble serum-MCP-1-nivåer funnet å være betydelig økt hos pasienter medcystinose(252.1 - 18,4 pg/ml; n ¼ 19; aldersgruppe 1–23 år) til tross for cysteaminbehandling sammenlignet med friske kontrollpersoner (166.9 -13,5 pg/ml; n ¼ 1 0; aldersgruppe 8–63 år) (P < 0,001).="" det="" er="" ikke="" funnet="" noen="" sammenheng="" mellom="" alder="" og="" mcp-="" 1-nivå="" hos="" begge="" pasientene="">cystinoseog friske givere (data ikke vist).

Cistancheharanti-inflammatoriskeiendommer

DISKUSJON

Til tross for at cystin akkumuleres i alt vev hos pasienter som er rammet medcystinose, nyrer er de organene som er mest sårbare for skade. Derfor tror vi at cystinakkumulering ikke alene er ansvarlig for nyredegenerasjon. Her beskriver vi en ny rolle forcystinosini reguleringen avbetennelseinvolvert i utviklingen av kronisk nyresykdom icystinose. Denne studien kan forklare hvorfor pasienter utvikler seg til nyresvikt i sluttstadiet til tross for at de gjennomgår cysteaminbehandling.

Studien av molekylære partnere i cystinose avslørte en direkte interaksjon med Gal-3, som kan hemmes av inhibitorer av Gal-3 CRD. Nyere studier viste at Gal-3 kunne interagere med glykaner lokalisert i det lysosomale lumen etter lysosomale skader som krystalloppbygging.36 I vår studie er interaksjonen mellom Gal-3 ogcystinosinble studert i friske celler som uttrykkercystinosinog derfor ikke akkumulerer cystein eller cystinkrystaller. I tillegg modifiserte overekspresjon av både Gal-3 og cystinosin i friske celler den subcellulære lokaliseringen av Gal-3, som deretter ble lokalisert til lysosomene, sammenlignet med overekspresjon av kun Gal-3, som var lokalisert i cytoplasmaet. Disse resultatene tyder sterkt på at interaksjon mellom Gal-3 og cystinosin skjer uavhengig av lysosomal skade, og at cystinosin er aktivt ansvarlig for Gal-3 lysosomal lokalisering. Tidligere har Gal-3 vist seg å bli nedbrutt gjennom lysosomavhengig proteolyse i fravær av Abl og Arg, 2 tyrosinkinaser.³¹

I tillegg viste vi detcystinoseog Gal-3 samlokaliseres ved dynamiske vesikulære strukturer og mobiliseres sammen på en spatiotemporal måte.Cystinosintidligere har vært assosiert med menneskehandelsmekanismene til den lysosomale LAMP2A, den eneste kjente CMA-reseptoren, som er feillokalisert icystinose.²⁸Gal-3-degradering har tidligere vist seg å være mediert av CMA.³¹Konfokal mikroskopianalyse bekreftet kolokaliseringen av Gal-3 ved Hsc70-positive strukturer i begge Ctns^–/– og WT-celler, som støtter samtransporten av Gal-3 med Hsc70 for presentasjon ved lysosomet og nedbrytning av CMA da Hsc70 hjelper translokasjonen av substratproteiner over membranen inn i lysosomlumen.^29,30En mulig tolkning av resultatene våre er detcystinosinregulerer handel og levering av Gal-3 til CMA-aktive lysosomer for nedbrytning.

Denne nye veien tilcystinosin-avhengig Gal-3 lysosomal lokalisering og nedbrytning støttes in vivo asCtns-mangelfulle mus viser overekspresjon av Gal-3 inyre. Dessuten, mens økt Gal-3 mRNA var begrenset i Ctns^–/–nyrer sammenlignet med en annen modell av CKD, ble en stor mengde Gal-3-protein kun påvist inCtns^–/– nyrer. Disse dataene støtter sterkt konklusjonen om atcystinosiner involvert i nedbrytningen av Gal-3-protein, som kan kontrollere overekspresjonen av Gal-3-mRNA under stresstilstander som CKD.

Gal-3 har flere biologiske roller, inkludert roller ved akutt og kroniskbetennelseved å tiltrekke monocytter og makrofager.^37,38I Ctns^–/– mus, observerte vi tunge mononukleære infiltrater hovedsakelig inyresom tidligere beskrevet,^11,39som ble karakterisert som monocytter/makrofager. I kontrast, nyrer fra den doble knockout Ctns^–/–Gal-3^–/–mus viste svært få monocytter/makrofaginfiltrater, noe som tyder sterkt på at Gal-3 er involvert ibetennelsei nyrene til Ctns^–/–mus. I sammenheng med gjentatt vevsskade kan Gal-3 utløse overgangen til kroniskbetennelseog fibrose.³⁴I samsvar med disse funnene viser dataene våre involveringen av Gal-3 i progresjonen av CKD icystinose. Faktisk, den doble knockout Ctns^–/– Gal-3^–/–mus viste bedrenyrefunksjon og struktur sammenlignet med Ctns^–/–mus. På samme måte viser Gal-3-mangelfulle mus mindre nyrefibrose inyresammenlignet med WT-mus etter ensidig ureterisk obstruksjon,⁴⁰ og Gal-3 knockout-mus utsatt for iskemi-reperfusjonsskade hadde en bedre nyrefunksjon sammenlignet med WT-mus utsatt for iskemi-reperfusjonsskade.⁴¹

Selv om det ble funnet en korrelasjon mellom nivåer av Gal-3 i plasma og utvikling av CKD42, ble det ikke observert noen forskjell i Gal-3-ekspresjon i serumet til mus og mennesker påvirket avcystinoseog friske kontrollpersoner. Ved å måle forskjellige cytokinnivåer i serumet fant vi en betydelig økning av MCP-1 i Ctns^–/–mus, mens Ctns^–/–Gal-3^–/–mus hadde nivåer som var sammenlignbare med de for WT-mus. MCP-1 er et cytokin som kan frigjøres i serumet og danner en gradient for å tiltrekke monocytter og makrofager til skadestedet.35 Økningen av MCP-1 i sera av Ctns^–/–mus sammenlignet med Ctns^–/–Gal-3^–/–mus var uavhengig av cystinakkumulering pganyrecystininnholdet var likt i begge genotyper. Videre, til tross for cysteaminbehandling som tillot cystin ut av lysosomene, ble MCP-1 funnet å være betydelig økt i sera fra pasienter medcystinosesammenlignet med friske givere. Disse dataene tyder sterkt på at fraværet avcystinosin, snarere enn cystinakkumulering, er ansvarlig for MCP-1 økningen i serum. I tillegg viste vi en direkte interaksjon mellom Gal-3 og MCP-1, som nylig ble foreslått av Gordon-Alonso et al.43, men som ikke ble studert videre. Mekanismen for Gal-3-mediert MCP-1-aktivering ble ikke studert her. En hypotese er tilstedeværelsen av et signalpeptid i det humane MCP-1, som kan spaltes for å øke dets sekresjon.44 Dessuten kan plasmin spalte C-terminalen til MCP-1, noe som øker dets kjemoattraktant potens.45 I tillegg, i samsvar med våre data, forhindret hemming av MCP-1 i en musemodell av diabetisk nefropati nyremakrofaginfiltrasjon og forbedret nyrefunksjon.46,47 Icystinose, våre data tyder sterkt på at fraværet avcystinosinfører til økning av Gal-3, som aktiverer MCP-1 blodmobilisering, og forbedrer nyrenebetennelseog progresjonen avKronisk nyre sykdom.

Disse funnene åpner nye perspektiver på potensielle terapeutiske mål som kan begrense eller forsinke nyredegenerasjon hos pasienter medcystinose. Faktisk har ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler som aspirin og indometacin blitt funnet å hemme Gal-3-ekspresjon ved å hemme transkripsjonen.48 Indometacin brukes faktisk til å regulere polyuri og polydipsi icystinose,49 og en fersk studie av 307 europeiske pasienter med cystinose viste et forbedret nyreresultat hos pasienter behandlet med indometacin.50 I lys av vår studie viser bruken av indometacin eller ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler forcystinosepasienter kan vurderes på nytt.

METODER

Dyreforsøk

C57BL/6 Ctns^–/–mus ble levert av Dr. Antignac (Inserm U1163, Paris, Frankrike). C57BL/6 galectin-3 null (Gal-3^–/–) mus ble levert av Dr. Fu-Tong Liu (University of California, Davis) og Dr. Jerrold M. Olefsky (University of California, San Diego). Avlsstrategien for å generere WT, Ctns^–/–, Gal-3^–/–, Ctns–/– og Gal- 3^–/–mus er beskrevet i Supplerende metoder.

Cellelinjer

rotet ble generert fra nyfødte hudbiopsier av WT og Ctns^–/–mus. MEF, 293T og MDCK type II cellelinjer (ATCC, Manassas, VA) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium som inneholdt 10 prosent føtalt kalveserum eller føtalt bovint serum, 100 enheter/ml penicillin, 0,1 mg/ml streptomycin og 2 mM L-glutamin.

Samimmunutfelling og massespektrometrianalyse

For å studere protein-protein-interaksjoner, ble MDCK-celler transdusert ved bruk av lentiviral pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE vektorryggrad for å stabilt uttrykkecystinosin-GFP.⁵¹Samimmunutfelling ble utført som beskrevet i Supplerende metoder. Ko-immunutfelte proteiner ble løst ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og analysert ved massespektrometri, LTQ Orbitrap som allerede beskrevet.¹⁹

293T-celler som uttrykker Gal-3–GFP og MCP-1–DsRed eller Gal-3– GFP og CTNS-DsRed ble brukt for samtidig immunutfelling som beskrevet i Supplerende metoder. Ko-immunutfelte proteiner ble løst ved SDS-PAGE, og Gal-3-bindende MCP-1 ble påvist ved bruk av et anti-DsRed antistoff (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).

Subcellulær fraksjonering

Åtte lever ble oppnådd fra C57BL/6-mus og fremstilt som beskrevet tidligere.52 Betingelsene for gradienten var i hovedsak de samme som beskrevet i den opprinnelige publikasjonen,52 bortsett fra at Nycodenz ble brukt i stedet for metrizamid.

Gal-3–hemmere og proteinase K-behandlinger

Lysater fracystinosin-GFP MDCK-celler og 293T som uttrykker Gal-3–GFP og CTNS-DsRed eller Gal-3–GFP og MCP-1–DsRed ble inkubert med eller uten 5 mM tiodigalaktosid eller 5 mM N -Acetyl-D-Laktosamin, henholdsvis 2 hemmere av Gal-3 CRD. Etter 30 minutters inkubering ved 4 - C med konstant risting, ble lysater inkubert med 50 ml anti-GFP-mikrokuler, og immunutfelling ble utført som nevnt tidligere. Utfelte proteiner ble løst ved SDS-PAGE på 10 prosent gel.

Lysater fracystinosin-GFP MDCK-celler og muselever lysosom-anrikede fraksjoner ble inkubert med eller uten 2 prosent Triton X-100 i 10 minutter ved 4 - C og deretter inkubert 30 minutter med eller uten 2,5 mg/ml og 25 mg hhv./ml proteinase K. Etter enzyminaktivering med 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid i 5 minutter ved 4 - C, ble proteiner løst ved SDS-PAGE på 10 prosent gel.

Immunfluorescensanalyse

Faste MDCK-celler ble inkubert med anti-Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) og anti-Gal-3 antistoff (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Canada) 2 timer ved romtemperatur, etterfulgt av Alexa Fluor 555 sekundært antistoff (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 1 time ved romtemperatur. Konfokale bilder ble tatt med et Zeiss LSM 700 mikroskop (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Tyskland).

293T-celler som forbigående uttrykker Gal-3–GFP alene, Gal-3–GFP og DsRed eller Gal-3–GFP ogcystinosin-DsRed ble dyrket på et dekkglass før de ble montert på et objektglass. Celler ble avbildet ved bruk av et Keyence BZ-X700-instrument (Keyence Corp., Osaka, Japan).

Fiksetnyreseksjoner ble inkubert over natten ved 4 - C med anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) eller anti-Gal-3 antistoff (BioLegend), etterfulgt av Alexa Fluor 488 sekundært antistoff (Invitrogen), 1 time i romtemperatur. Bilder ble tatt med et Keyence BZ-X700-instrument. Kvantifisering av CD68-ekspresjon er beskrevet i Supplerende metoder.

MEF-er som uttrykker Gal-3–GFP ble farget med et anti-Hsc70-antistoff (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) og avbildet som beskrevet tidligere.⁵³

Total intern refleksjon FL fluorescensmikroskopi

WT og Ctns^–/–MEF som uttrykker Gal-3–GFP og CTNS-DsRed ble sådd på en 4-kammer 35- mm borosilikatbunnskål (Cellvis, Mountain View, CA). Etter 2 dager i kultur ble MEF-er analysert ved total intern refleksjon FL fluorescensmikroskopi som beskrevet tidligere⁵⁴og i Supplerende metoder. Bilder ble analysert ved hjelp av ImageJ-programvare.

Gal-3 uttrykksanalyse

293T-celler som uttrykker Gal-3–GFP, Gal-3–GFP og DsRed, eller Gal-3–GFP og CTNS-DsRed og eksplantertnyrerble lysert i radioimmunutfellingsanalysebuffer inneholdende en proteinasehemmercocktail. Proteiner ble separert på en 4 prosent til 15 prosent gel og avslørt ved bruk av anti-Gal-3 (Abcam, Cambridge, Storbritannia) eller anti-glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) antistoff .

Nyrerble homogenisert i RLT-buffer inneholdende b-merkaptoetanol ved bruk av Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Frankrike). RNA ble isolert og Gal-3-spesifikk dråpe digital polymerasekjedereaksjon ble utført som beskrevet i Supplerende metoder. Gal-3 transkriptuttrykk ble uttrykt som et forhold sammenlignet med den endogene kontrollen 18S. En enzymkoblet immunosorbentanalyse (Abcam) ble brukt til å påvise Gal-3-nivået i mus og menneskesera, i henhold til produsentens instruksjoner.

Nyrefunksjon

Serum- og urinfosfat-, serumkreatinin- og ureanivåer ble estimert ved bruk av QuantiChrom Phosphate Assay Kit, Quanti Chrom Creatinine Kit og QuantiChrom Urea Assay Kit (BioassaySystems, Hayward, CA). Proteinnivåer i urin ble målt ved å bruke Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL).

Histologi

På det tidspunktet musene ble drept,nyrerble samlet, fiksert i formalin og innebygd i parafin. Seksjoner farget med hematoxylin og eosin ble gjennomgått på en blind måte av Dr. Marie Claire Gubler som beskrevet i Supplementary Methods.

Måling av cystininnhold

Vevscystinmåling ble utført ved massespektrometri (LC-ESI-MS/MS) som beskrevet tidligere.³⁹

Standard nefrektomi og falsk operasjon

Mus CKD ble indusert av standard subtotal 2-stadium nefrektomioperasjon som beskrevet tidligere.^55,56Den falske gruppen av mus gjennomgikk samme prosedyre, men uten å kutte noennyrevev.

Cytokinnivå i serum

For å måle cytokinnivåer i museserum, en musbetennelsekitcytometrisk perlearray (BD Biosciences, San Jose, CA) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. MCP-1-konsentrasjon i humant serum ble bestemt ved å bruke en enzymkoblet immunosorbentanalyse rettet mot MCP-1 (Abcam, Cambridge, Storbritannia) i henhold til produsentens instruksjoner.

Statistisk analyse

Verdier er uttrykt som gjennomsnitt - SEM. Betydningen av resultatet ble vurdert ved uparet 2-halet t-test eller uparet 2-halet t-test med Welchs korreksjon. Gruppesammenligninger av 3 tilstander eller flere ble gjort med parametriske variansanalyser, etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest for parvise sammenligninger. Histologiske skårer ble sammenlignet med Mann-Whitney-testen. Analyser ble utført ved bruk av Prism 6-programvare (GraphPad, San Diego, CA). En P-verdi mindre enn 0.05 ble ansett som signifikant.

Studiegodkjenning

Museksperimenter ble utført i samsvar med InstitutionalAnimal Use Committee-protokoller. Bruken av humant vev i denne studien ble godkjent av University of California, San Diego, HumanResearch Protections Program.

FORMIDLING

SC er et vitenskapelig styremedlem og medlem av forstanderskapet tilcystinoseForskningsstiftelsen. SC er medgründer, aksjonær og medlem av både det vitenskapelige styret og styret for GenStem TherapeuticsInc. Vilkårene for denne ordningen er gjennomgått og godkjent av University of California–San Diego i samsvar med retningslinjene for interessekonflikter. Alle de andre forfatterne erklærte ingen konkurrerende interesser.

gir Galen-3^–/–mus. Vi takker Lou Devanneaux og NicholeFlerchinger for deres tekniske hjelp og Elizabeth Souter for gjennomgang av manuskriptet. Vi anerkjenner Christopher Alfonso fra BDBioscience for å ha levert musenbetennelsecytometrisk perlearray og for hans hjelp med tolkningen av resultatene. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants RO1-DK090058 og R01-DK110162,CystinoseResearch Foundation og California Institute of Regenerative Medicine (CIRM, CLIN-09230). TL er støttet av et stipendiat fra Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB og JZ støttes av et stipend fracystinoseForskningsstiftelsen. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility ble finansiert av National Institute of neurological disorders and Stroke (NINDS)-stipend P30-NS047101.

REFERANSER

1. Medzhitov R. Opprinnelse og fysiologiske rollerbetennelse. Natur. 2008;454:428–435.

2. Donath MY. Rettet motbetennelsei behandling av type 2 diabetes. Diabetes Obes Metab. 2013;15(suppl 3):193–196.

3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Cytokines in the systemic inflammatory response syndrome: a review. HSR Proc Intensiv Care Cardiovasc Anest. 2010;2:161–175.

4. Pecoits-Filho R, Heimburger O, Barany P, et al. Assosiasjoner mellom sirkulerende inflammatoriske markører og gjenværende nyrefunksjon hos CRF-pasienter. Am JNyreDis. 2003;41:1212–1218.

5. Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.Cystinose. N Engl J Med. 2002;347: 111–121.

6. Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. Målrettingen avcystinosintil den lysosomale membranen krever et tyrosinbasert signal og et nytt sorteringsmotiv. J Biol Chem. 2001;276:13314–13321.

7. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.Cystinosin, proteinet defekt icystinose, er en H( )-drevet lysosomal cystintransportør. EMBO J. 2001;20:5940–5949.

8. Cherqui S, Courtoy PJ. Det renale Fanconi-syndromet icystinose: patogen innsikt og terapeutiske perspektiver. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.

9. Nesterova G, Gahl W. Nephropathiccystinose: senkomplikasjoner av en multisystemisk sykdom. Pediatr Nephrol. 2008;23:863–878.

10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, et al. Intralysosomal cystinakkumulering hos mus manglercystinosin, proteinet defekt icystinose. Mol Cell Biol. 2002;22:7622–7632.

11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, et al. Renal fenotype avcystinosemusemodell er avhengig av genetisk bakgrunn. Nephrol-skivetransplantasjon. 2010;25:1059–1066.

12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, et al. De okulære anomaliene i encystinosedyremodell etterligner sykdomspatogenese. Pediatr Res. 2007;62:156–162.

13. Guide Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. En musemodell foreslår to mekanismer for endringer i skjoldbruskkjertelen hos spedbarncystinose: redusert tyroglobulinsyntese på grunn av endoplasmatisk retikulumstress/utfoldet proteinrespons og nedsatt lysosomal prosessering. Endokrinologi. 2015;156:2349–2362.

14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, et al. Cysteaminbehandling forsinker progresjonen av nefropatiskcystinosehos sene ungdommer og voksne.NyreInt. 2012;81:179–189.

15. Cherqui S. Cysteaminterapi: en behandling forcystinose, ikke en kur.NyreInt. 2012;81:127–129.

16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Nephropathiccystinosehos voksne: naturhistorie og effekter av oral cysteaminbehandling. Ann Intern Med. 2007;147:242–250.

17. Cherqui S, Courtoy PJ. Det renale Fanconi-syndromet icystinose: patogen innsikt og terapeutiske perspektiver. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.

18. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Svekkelse av chaperone-mediert autofagi fører til selektive lysosomale nedbrytningsdefekter i lysosomal lagringssykdomcystinose. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.

19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.Cystinosiner en komponent av det vakuolære H-ATPase-regulator-rag-komplekset som kontrollerer pattedyrmålet for rapamycinkompleks 1-signalering. J Am Soc Nephrol. 2016;27: 1678–1688.

20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, et al. Aktivering av transkripsjonsfaktoren EB redder lysosomale abnormiteter hos cystinotiskenyreceller.NyreInt. 2016;89:862–873.

21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: en åpen historie. Biochim Biophys Acta. 2006;1760:616–635.

22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Galectin-3: ett molekyl for et alfabet av sykdommer, fra A til Å. Int J Mol Sci. 2018;19(2).

23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M, et al. Virkningen av galectin-3-hemming på aldosteron-induserte hjerte- og nyreskader. JACC hjertesvikt. 2015;3:59–67.

24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR, et al. Farmakologisk hemming av galectin-3 beskytter mot hypertensiv nefropati. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F500–F509.

25. Kolatsi-Joannou M, Price KL, Winyard PJ, Long DA. Modifisert sitruspektin reduserer galektin-3-ekspresjon og sykdomsgrad ved eksperimentell akuttnyreskade. PloS One. 2011;6:e18683.

26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. Galectin-3-blokade reduserer nyrefibrose i to normotensive eksperimentelle modeller for nyreskade. PloS One. 2016;11:e0166272.

27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C, et al. Virkningen avcystinoseglykosylering på proteinstabilitet ved differensiell dynamisk stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekultur (SILAC). Mol Cell Proteomics. 2017;16:457–468.

28. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Svekkelse av chaperone-mediert autofagi fører til selektive lysosomale nedbrytningsdefekter i lysosomal lagringssykdomcystinose. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.

29. Majeski AE, Dice JF. Mekanismer for chaperone-mediert autofagi. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:2435–2444.

30. Xie W, Zhang L, Jiao H, et al. chaperone-mediert autofagi forhindrer apoptose ved å degradere BBC3/PUMA. Autofagi. 2015;11:1623–1635.

31. Li X, Ma Q, Wang J, et al. c-Abl og Arg tyrosinkinaser regulerer lysosomal nedbrytning av onkoproteinet Galectin-3. Celledød er forskjellig. 2010;17:1277–1287.

32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A, et al. Overvekt av M2-polariserte makrofager i blærekreft påvirker angiogenese, tumorgrad og invasivitet. Oncol Lett. 2016;11:3403–3408.

33.Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Mye mer enn M1 og M2 makrofager, det er også CD169( ) og TCR( ) makrofager. Front Immunol. 2015;6:263.

34. Henderson NC, Sethi T. Reguleringen avbetennelseav galectin-3. Immunologic Rev. 2009;230:160–171.

35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Monocytt kjemoattraktant protein-1 (MCP-1): en oversikt. J Interferon Cytokine Res. 2009;29:313–326.

36. Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. Utløst rekruttering av ESCRT-maskineri fremmer endolysosomal reparasjon. Vitenskap. 2018;360(6384).

37. MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, et al. Regulering av alternativ makrofagaktivering med galectin-3. J Immunol. 2008;180: 2650–2658.

38. Sano H, Hsu DK, Yu L, et al. Humant galectin-3 er et nytt kjemoattraktant for monocytter og makrofager. J Immunol. 2000;165:2156–2164.