Eksogen Wnt1 forhindrer akutt nyreskade og dens påfølgende progresjon til kronisk nyresykdom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5og Liangxiang Xiao^3*

¹State Key Laboratory of Organ Failure Research, National Clinical Research Center of Kidney Disease, Division of Nephrology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Kina,²Department of Nephrology, Xiamen Hospital tilknyttet Beijing University of Chinese Medicine, Xiamen, Kina,³Department of Nephrology, Zhongshan Hospital tilknyttet Xiamen University, Xiamen, Kina,⁴Institutt for endokrinologi og diabetes, det første tilknyttede sykehuset ved Xiamen University, Xiamen, Kina,⁵Institutt for patologi, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, USA

Studier tyder på at Wnt/ -cateninagonister er gunstige i behandlingen avakutt nyreskade(AKI); den forblir imidlertid unnvikende om sin rolle i forebygging av AKI og dens progresjon til kronisk nyresykdom (CKD). I denne studien ble renal Wnt/-catenin-signalering enten aktivert ved overekspresjon av eksogen Wnt1 eller hemmet ved administrering med ICG-001, en liten molekylhemmer av -catenin-signalering, før mus ble utsatt for iskemi/reperfusjonsskade (IRI) for å indusere AKI og påfølgende CKD. Resultatene våre viste at in vivo-ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR-beskyttet mus mot AKI, og hindret progresjonen av AKI til CKD hos mus, vist ved både biokjemiske blod- og nyrehistologiske analyser. I motsetning til dette hadde forbehandling av ICG-001 før IR ingen effekt på renal Wnt/-catenin-signalering eller progresjon av AKI til CKD. Mekanistisk undertrykte in vivo-ekspresjon av eksogen Wnt1before IR uttrykket av proapoptotiske proteiner i AKI-mus og reduserte inflammatoriske responser i både AKI- og CKD-mus. I tillegg hemmet eksogen Wnt1 apoptose av tubulære celler indusert av hypoksi-reoksygenering (H/R) behandling in vitro. For å konkludere, gir denne studien bevis for å støtte den forebyggende effekten av Wnt/-catenin-aktivering på IR-relatert AKI og dens påfølgende progresjon til CKD.

Nøkkelord: akutt nyreskade, kronisk nyresykdom, Wnt1, -catenin, iskemi-reperfusjonsskade

Behandlingen avakutt nyreskade(AKI): cistanche

INTRODUKSJON

Akutt nyreskade (AKI)er en klinisk tilstand på grunn av raskt tap av nyrefunksjon ved ulike skader, som medikamenter, iskemi, sepsis og toksiner (Chawla og Kimmel, 2012; Scholz et al., 2021). AKI er assosiert med høy forekomst av sykelighet og dødelighet, ansvarlig for omtrent 2 millioner dødsfall hvert år over hele verden (Belayev og Palevsky, 2014). Spesielt er AKI en godt anerkjent uavhengig prediktor for utvikling av kronisk nyresykdom (CKD) eller end-stage renal disease (ESRD), som har lagt en enorm økonomisk byrde på helsevesenet (Leung et al., 2013; Belayev og Palevsky, 2014; Kurzhagen et al., 2020). Dessverre finnes det ingen effektive medisiner for forebygging og behandling av AKI.

Wnt/-catenin-signalering spiller en grunnleggende rolle inorganogenese, vevshomeostase og utvikling av forskjellige sykdommer, inkludert nyresykdommer (Soni, 2021). -Catenin har doble roller ved å tjene som både et strukturelt protein og en transkripsjonsregulator (MacDonald et al., 2009). Det membranbundne -cateninet er en del av adherensjunction-komplekset og bidrar til celle-celle-interaksjon, mens det cytosoliske -catenin er fosforylert av glykogensyntase-kinase-3 (GSK-3) og målrettet for ubiquitinering og proteasomal nedbrytning. Imidlertid kan slik nedbrytning av -catenin reddes av Wnt-liganden, en familie av utskilte glykoproteiner med forskjellige biologiske aktiviteter. Bindingen av Wnt stabiliserer -catenin, som translokerer inn i kjernen og fungerer som en transkripsjonsfaktor for generregulering. Spesielt er Wnt/-catenin-signalering relativt dempet i uskadde voksne nyrer, men reaktiveres under akutt og kronisk nyreskade (Huffstater et al., 2020). Aktivering av Wnt/-catenin på et tidlig stadium av AKI reduserer nyreskade og favoriserer utvinning av nyrefunksjon, mens vedvarende Wnt/-catenin-aktivering kan drive progresjonen fra AKI til CKD (Xiao et al., 2016; Huffstater et al., 2020). Derfor er Wnt/-catenin-signalering et tveegget sverd ved nyreskade og garanterer en bedre forståelse. Spesielt er det fortsatt unnvikende om rollen til Wnt/-cateninaktivering i forebyggingen av AKI og dens påfølgende AKI-CKD-progresjon.

Renal iskemi-reperfusjonsskade (IRI) regnes som hovedårsaken til AKI. Derfor har den renale IRI-dyremodellen blitt ofte brukt til forskning på AKI og AKI-CKD-progresjon (Bonventre og Yang, 2011). Både farmakologiske og genetiske tilnærminger har blitt brukt for å belyse rollen til Wnt/-catenin-aktivering i IRI-modeller av henholdsvis AKI og CKD. Litium- og GSK-3-hemmere brukes ofte til farmakologisk aktivering av Wnt/-catenin-signalering i prekliniske AKI-modeller, men det bør bemerkes om deres -catenin-uavhengige effekter (Bao et al., 2014). Genetiske modifikasjoner av GSK{{9 }}, -catenin eller Wnt-ligander (Wnt1 og Wnt9a) har blitt brukt for å belyse rollen til Wnt/-catenin-aktivering i AKI og CKD (Bonventre og Yang, 2011; Bao et al., 2014; Zhou et al., 2013, 2018; Liuet al., 2020). Ikke desto mindre er studier på rollen til Wnt/-cateninsignalering i forebygging av AKI ganske begrenset. Denne studien hadde som mål å belyse rollen til Wnt/-catenin-signalering i forebygging av AKI og dens påfølgende progresjon til CKD.

FIGUR 1|In vivo ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR forhindrer AKI og aktiverer nyre-catenin hos mus

(A)Musebehandlingsgrupper. Mus ble behandlet med enten pcDNA3 (IRI pluss pcDNA3) eller PHA-Wnt1 (IRI pluss PHA-Wnt1) plasmid via hydrodynamisk haleveneinjeksjon 2 dager før BIRI. Serumkreatininnivåer(B)og urea nitrogen (BUN) nivåer i blodet(C) ble målt. (D) Representative mikrofotografier av nyremorfologi 1 dag etter BIRI. Nyreseksjoner ble utsatt for periodisk syre-Schiff-farging. Innrammede områder er forstørret. Piler indikerer nyretubuli. Målestokk, 200 µm.(E, F)Western blot-analyse av aktivt -catenin i nyrer av mus. *P < 0.05="" versus="" sham-kontroller="" (n="5)." †p="">< 0,05="" versus="" iri="" injisert="" med="" pcdna3-plasmid="" (n="">

Cistanche forbedrer nyrefunksjonen

MATERIALER OG METODER

Dyrestudie

C57BL/6 hannmus som veide omtrent 22–25 g ble kjøpt fra Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, Kina), og holdt i dyreanlegget (temperatur: 22 ± 2◦C, fuktighet: 60 ± 5 prosent, 12 timer mørkt/lyssyklus ) ved Southern Medical University (Guangzhou, Kina) med vann og mat ad libitum. Dyrestudier ble godkjent av Animal Ethical and Welfare Committee ved Southern MedicalUniversity. Alle dyrene ble behandlet i samsvar med veiledningen for stell og bruk av forsøksdyr.

Induksjonen av AKI og CKD hos mus ble beskrevet i våre tidligere studier (Xiao et al., 2016; Zhou et al., 2018). Bilateral nyreiskemi/reperfusjonsskade (BIRI) har blitt mye brukt for å indusere AKI hos mus, mens det øker dødeligheten under progresjonen av AKI toCKD. Derfor brukes unilateral renal ischemi/reperfusion injury (UIRI) for forskning på progresjon av AKI til CKD. Kort fortalt ble et abdominalt snitt i midtlinjen laget i musen under generell anestesi, og bilaterale eller venstre nyrepedikler ble klippet i 30 minutter ved bruk av mikroaneurismeklemmer (varenr. 18051-35; Fine ScienceTools, Cambridge, Storbritannia). Under operasjonen ble kroppstemperaturen holdt på omtrent 37–38◦C ved bruk av et temperaturkontrollert varmesystem.

For å evaluere den forebyggende effekten av Wnt/-catenin-aktivering på AKI, ble mus injisert med 1 mg/kg hemagglutinin(HA)-merket Wnt1-ekspresjonsvektor (PHA-Wnt1, UpstateBiotechnology) eller tom vektor (pcDNA3) 2 dager før BIRI ved bruk av hydrodynamisk- basert genoverføringsteknikk som rapportert tidligere (Xiao et al., 2016). Blod- og nyrevev ble samlet 1 dag etter nyre-BIRI.

For å evaluere effekten av tidlig Wnt/-catenin-aktivering på progresjonen av AKI til CKD, ble mus enten utsatt for daglig hydrodynamisk haleveneinjeksjon av Wnt1-ekspresjonsplasmider med 1 mg/kg eller daglig intraperitoneal injeksjon av ICG-001({{4 }}, Chembest, Shanghai, Kina) ved 5 mg/kg i 3 dager før UIRI. Blod- og nyrevev ble samlet 11 dager etter UIRI. I vår foreløpige studie kunne 2 dager med Wnt1-injeksjon indusere uttrykket av Wnt1 i AKI-mus (data ikke vist). Det skal bemerkes at 3 dager med Wnt1-injeksjon ble valgt for å sikre og forlenge uttrykket av Wnt1 under progresjonen av AKI til CKD.

Akutt nyreskade (AKI) er en klinisk tilstand på grunn av raskt tap av nyrefunksjon

Cellekultur og behandling

Human proksimal tubulær epitelcellelinje (HKC-8) ble levert av Dr. L. Racusen ved Johns Hopkins University (Baltimore, MD, USA). Cellekulturer ble utført som tidligere beskrevet (Zhou et al., 2013). HKC-8-celler ble behandlet med human rekombinant Wnt1 (SRP4754; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) ved 100 ng/mL eller ICG-001 (847591-62-2, Chembest, Shanghai , Kina) ved 10 µM i 4 timer. Celler ble deretter inkubert i en hypoksi-arbeidsstasjon (X3-CK, Biospherix) ved 1 prosent pO2 i 48 timer. Deretter ble celler oksygenert på nytt i 2 timer før innsamling for forskjellige analyser.

FIGUR 2|In vivo ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR reduserer tubulær celle apoptose og NF-KB aktivering i AKI mus

(A) Representative mikrofotografier viser TUNEL-positive celler i forskjellige grupper som angitt. Piler indikerer positiv farging. Målestokk, 100 µm.(B)Den grafiske presentasjonen viser TUNEL-positive cellsper high power field (HPF) i forskjellige grupper som angitt.(C–F)Representative Western blot-analyser viser nyreekspresjon av FasL, p53 og Bax i forskjellige grupper som angitt. *P < 0.05="" versus="" sham-kontroller;="" †p="">< 0,05="" versus="" iri="" injisert="" med="" pcdna-plasmider="" (n="">(G) Representativ Western blot av p65 og p-p65 proteiner i forskjellige grupper som angitt.

Apoptoseanalyse

Celler ble trypsinisert, samlet og vasket med PBS.PE Annexin V-farging ble utført i henhold til produsentens protokoll. Cytometrisk analyse ble utført med et flowcytometer (BD FACSCanto II, San Jose, CA, USA) for å måle apoptosehastighetene ved å påvise den relative mengden av PE Annexin V positive og 7-AAD negative celler. Hver analyse ble utført i triplikat.

Kreatinin og blod urea nitrogenanalyse

Kreatininnivåer i serum og urin samt blod ureanitrogen (BUN) nivåer ble målt ved hjelp av en automatisk biokjemisk analysator (AU480, Beckman-Coulter Inc., Brea, CA, USA).

Histologi og immunhistokjemisk farging

Nyreseksjoner og immunhistokjemisk farging ble utført som tidligere beskrevet (Liu et al., 2020). Primære antistoffer inkluderte kanin polyklonal anti–Wnt1(ab15251; Abcam, Inc.), kanin polyklonalt anti- -catenin (ab15180; Abcam, Inc. .), og kanin polyklonalt anti-fibronektin (F3648; Sigma-Aldrich).

Western blot-analyse

Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere (Zhou et al., 2019). Primære antistoffer inkluderte kaninpolyklonalt anti-fibronektin (F3648; Sigma-Aldrich), musemonoklonalt anti- -catenin-antistoff (610154; BD TransductionLaboratories), musemonoklonalt anti- -SMA-antistoff (A2547;Sigma-Albitdrich), polyklonalt anti-Wnt1 (ab15251; Abcam), muse anti- -tubulin (T9026; Sigma-Aldrich), muse anti PAI-1 antistoff (AF3828;R&D Systems), anti-aktivt -catenin(#05 –665; EMD Millipore), anti-Fas-ligand (FasL) (SC -6237; Santa Cruz, CA, USA), p53 (#2524S; CST), Bax (SC 20067; Santa Cruz), p65 ( #8242S; CST), p-p65 (#3033S; CST), PCNA (#2586S; CST).

RNA-ekstraksjon og qPCR-analyse

Total RNA-isolering og qPCR ble utført som tidligere beskrevet. mRNA-nivåene til forskjellige gener ble normalisert med -aktin. Primersekvensene til genene er oppført i tilleggstabell 1.

FIGUR 3|In vivo ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR forhindrer progresjon av AKI til CKD hos mus

(A)Musebehandlingsgrupper. Mus ble utsatt for enten hydrodynamisk haleveneinjeksjon av 1 mg/kg pcDNA3 (IRI pluss pcDNA3) eller PHA-Wnt1 (IRI pluss PHA-Wnt1) plasmid, eller intraperitoneal injeksjon av 5 mg/kg ICG-001 3 dager før UIRI . Blod og vev ble samlet 11 dager etter UIRI. Serumkreatininnivåer(B) og blod urea nitrogen (BUN) nivåer(C) ble målt.(D) Representative mikrofotografier av nyremorfologi 11 dager etter UIRI. Nyreseksjoner ble utsatt for periodic acid-Schiff-farging. Innrammede områder er forstørret. Piler indikerer nyretubuli. Målestokk, 100 µm. *P < 0,05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Statistisk analyse

Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Dataene ble statistisk analysert ved bruk av Sigma Stat-programvare (Jandel ScientificSoftware, San Rafael, CA, USA). Sammenligning mellom grupper ble gjort ved å bruke enveis ANOVA, etterfulgt av Student-Newman-Keuls-testen. P < 0.05="" ble="" ansett="" som="">

CISTANCHE URTE FORDEL NYRE

RESULTATER

In vivo uttrykk for eksogent Wnt1Før IR forhindrer akutt nyreskade og aktiverer nyre-Catenin hos mus

For å bestemme rollen til Wnt/-catenin-aktivering i AKI-prevensjon, ble mus administrert med enten HA-merket Wnt1-ekspresjonsvektor (PHA-Wnt1) eller tom vektor (pcDNA3) via hydrodynamisk haleveneinjeksjon 2 dager før BIRI(Figur 1A). Serumnivåer av kreatinin og BUN, to biomarkører for nyreskade, ble signifikant økt hos mus 1 dag etter BIRI, noe som tyder på eksistensen av AKI (figur 1B, C). Konsekvent var fremtredende nyremorfologiske lesjoner, slik som astubulære skader i det kortikomedullære krysset, observert i AKI-mus(Figur 1D). Spesielt ble disse endringene i serumnyreskadebiomarkører og morfologiske lesjoner hos AKI-mus markant svekket av eksogen Wnt1. Western blot-analyser avslørte at eksogen Wnt1 fremmet uttrykket av nyre-catenin i AKI-mus(Figur 1E, F). Til sammen antyder disse funnene at forbehandling av eksogent Wnt1 aktiverer renal-catenin og forhindrer AKI hos mus.

In vivo uttrykk for eksogen Wnt1Before IR reduserer tubulær celleapoptose og hemmer NuclearFactor-Kappa B-aktivering

For å utforske om regulering av apoptose er mekanismen som ligger til grunn for den beskyttende effekten av eksogen Wnt1 på AKI, ble TUNEL-farging utført for å identifisere apoptose i nyrevev til AKI-mus. Sammenlignet med sham-mus økte IRI markant apoptosehastigheten så vel som nivåene av apoptose-relaterte proteiner, som FasL, p53 og Bax, nyrer til mus(Figur 2A–F). Slike endringer i nyrene til AKI-mus ble markant redusert ved in vivo-ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR. Nukleær faktor-kappa B (NF κB), spesielt dens heterodimere form p65/p50, spiller en kritisk rolle i å regulere den inflammatoriske responsen i nyrene til AKI-mus. Western blot-analyse viste at både p65 og dens fosforylerte form (p-p65) var markert økte nyrer hos mus etter IRI, mens slike endringer ble forhindret av eksogen Wnt1(Figur 2G). Disse funnene antyder at in vivo-ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR forhindrer apoptose og hemmer NF-KB-aktiveringsnyrer til AKI-mus.

FIGUR 4|In vivo ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR nedregulerer endogen Wnt1 og -catenin i nyrene til mus etter AKI-CKD progresjon

(A)Representative mikrofotografier viser Wnt- og -catenin-proteinekspresjon i forskjellige grupper som angitt. Målestokk, 50 µm.(B–E)Representative Western blotanalyser av Wnt1, -catenin og aktive -catenin proteinnivåer i forskjellige grupper som angitt.(F) mRNA-ekspresjon av TGF- i forskjellige grupper som angitt.*P < 0.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

In vivo uttrykk for eksogent Wnt1Before IR forhindrer progresjon av akutt nyreskade til kronisk nyresykdom

Vi undersøkte deretter om aktivering av Wnt/-cateninbefore IR kan forhindre progresjon av AKI til CKD. Som vist iFigur 3A, gjennomgikk mus enten hydrodynamisk haleveneinjeksjon av Wnt1-ekspresjonsplasmid (PHA-Wnt1) eller intraperitoneal injeksjon av ICG-001 3 dager før UIRI. Både serumkreatinin og BUN-nivåer ble økt hos mus 11 dager etter UIRI(Figur 3B, C). I tillegg avslørte Masson trikromfarging fremtredende renal kollagenavsetning og fibrotiske lesjoner hos mus 11 dager etter UIRI(Figur 3D). Disse observasjonene indikerer progresjonen av AKI til CKD hos mus etter UIRI. Spesielt ble de observerte endringene av serumnyreskadebiomarkører og nyrefibrose hos CKD-mus nesten fullstendig forhindret ved forbehandling av eksogent Wnt1, men ikke ICG-001. Derfor forhindrer in vivo-ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR progresjonen av AKI til CKD hos mus.

In vivo uttrykk for eksogent Wnt1 før IR nedregulerer endogent Wnt1 og -Catenin i nyrene

Vi undersøkte videre effekten av eksogen Wnt1 onendogen Wnt/-catenin-signalering i nyrene til CKD-mus. Som vist i figur 4A avslørte immunhistokjemisk farging at både endogen Wnt1 og -catenin var markert oppregulert i nyrene til mus 11 dager etter IRI. Proteinnivåene deres ble kraftig redusert ved forbehandling av eksogent Wnt1, men ikke ICG-001. Western blot-analyser bekreftet den hemmende effekten av eksogen Wnt1, men ikke ICG-001, onendogen ekspresjon av Wnt1, -catenin og aktive -catenininyrer fra CKD-mus (figur 4B–E). Wnt/ -catenin og TGF- signalveiene krysstale ved nyrefibrose. MRNA-ekspresjonen av TGF- ble indusert i nyrene til CKD-mus, og slik induksjon ble redusert av eksogen Wnt1, men ikke ICG-001 (Figur 4F). Derfor hemmer forbehandling av eksogen Wnt1 endogen nyre Wnt/-catenin-signalering hos CKD-mus.

FIGUR 5|In vivo ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR nedregulerer renale Wnt/-catenin målgener hos mus etter AKI-CKD progresjon

(A, B) mRNA-uttrykk av PAI-1 og MMP-7 i forskjellige grupper som angitt.(C–E)Representative Western blot-analyser av PAI-1- og Klotho-proteinnivåer.(F)mRNA-uttrykk av Klotho. *P < {{0}}.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

In vivo-uttrykk av eksogent Wnt1Før IR nedregulerer RenalWnt/-Catenin-målgener i mus

Sammenlignet med Sham-mus ble mRNA-ekspresjonen av PAI-1og MMP-7, to direkte nedstrømsmål for Wnt/-cateninsignalering, signifikant oppregulert i nyrene til mus 11 dager etter UIRI(Figur 5A, B). Forbehandling av eksogent Wnt1, men ikke ICG-001, hemmet PAI-1 og MMP-7 mRNA-ekspresjon i CKD-mus. Western blot-analyse viste at PAI-1-proteinnivået ble økt i nyrene til CKD-mus, der de ble fjernet ved forbehandling av eksogent Wnt1, men ikke ICG-001(Figur 5C, D). Klotho er anendogen Wnt-antagonist ved binding og sekvestrering av Wnt-ligander. Sammenlignet med Sham-mus ble både mRNA- og proteinnivåer av Klotho redusert i nyrene til mus 11 dager etter UIR(Figur 5E, F). Forbehandling av eksogent Wnt1, men ikke ICG-001, gjenopprettet nesten fullstendig Klotho-mRNA og proteinekspresjon i nyrene til CKD-mus. Disse funnene antyder videre den hemmende effekten av eksogen Wnt1 på endogene Wnt/-catenin-signalerende nyrer til CKD-mus.

In vivo uttrykk for eksogen Wnt1Before IR reduserer nyrefibrose hos mus etter akutt nyreskade - kronisk nyresykdomsprogresjon

Vi undersøkte deretter effekten av Wnt/-catenin-aktivering før IR på nyrematrisegener og fibrotiske lesjoner hos CKD-mus. Sammenlignet med Sham-mus ble mRNA-ekspresjonen av fibronektin(FN), kollagen I, kollagen III og -SMA markert indusert i nyrer av mus 11 dager etter UIR(Figur 6A–D).Slike endringer ble redusert ved forbehandling av eksogent Wnt1, men ikke ICG-001. Western blot-analyse viste at proteinnivåene av FN og -SMA var signifikant økte nyrer hos CKD-mus, og slike endringer ble opphevet ved forbehandling av eksogen Wnt1, men ikke ICG-001(Figur 6E–G). Effektene av eksogen Wnt1 og ICG-001 på FN-proteinekspresjon i CKD-mus ble validert ved nyreimmunfarging med et FN-antistoff(Figur 6H). Disse funnene tyder på at forbehandling av eksogen Wnt1 forhindrer nyrefibrogenese hos IR-induserte CKD-mus.

FIGUR 6|In vivo ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR reduserer nyrefibrose hos mus etter AKI-CKD progresjon

(A–D)mRNA-ekspresjon av fibronektin, kollagen I, kollagen III og -SMA.(E–G)Representative Western blot-analyser av fibronektin- og -SMA-SMA-proteinnivåer.(H)Immunfarging av fibronektin nyreseksjoner. *P < {{0}}.05;="" **p="">< 0,01;="" †p="">< 0,05.="" n="5." skalastang,="" 50="">

In vivo uttrykk for eksogent Wnt1Før IR demper nyrebetennelseEtter akutt nyreskade-kronisk nyresykdomsprogresjon

Sammenlignet med Sham-mus var mRNA-ekspresjonen av inflammatoriske gener, slik som IL-1, IL-6 og TNF-, betydelig oppregulert i nyrene til mus 11 dager etter UIR(Figur 7A–C). Slike endringer ble nesten fullstendig opphevet ved forbehandling av eksogen Wnt1, men ikke ICG-001. Western blot-analyse viste at proteinnivåene til både P65 og dens fosforylerte form (p-p65) var markant økte nyrer hos mus etter 11 dager etter UIRI, som indikerer aktivering av NF-KB-signalering i CKD-mus(Figur 7D–F). Spesielt reduserte forbehandling av eksogen Wnt1, men ikke ICG-001 signifikant p65- og p-p65-proteinnivåer i nyrene til CKD-mus. Disse funnene indikerer at forbehandling av eksogen Wnt1 forhindrer nyreinflammatoriske responser hos CKD-mus.

FIGUR 7|In vivo ekspresjon av eksogen Wnt1 før IR demper nyrebetennelse hos mus etter AKI-CKD progresjon

(A–C) mRNA-ekspresjon av IL-1, IL-6 og TNF- i nyrene til mus. (D–F)Representative Western blot-analyser av p65- og p-p65-proteinnivåer. *P < 0.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Eksogen Wnt1 beskytter tubulære celler mot apoptose indusert av hypoksi-reoksygeneringsskade in vitro

For ytterligere å identifisere rollen til Wnt1 i AKI, etablerte vi HKC-8 tubulære cellemodeller av AKI ved bruk av hypoksi-reoksygenering (H/R) behandling. Flowcytometri ble brukt for å oppdage apoptose og avslørte økningen av apoptosehastigheten i HCK 8-celler etter H/R-behandling(Figur 8A, B). Eksogen Wnt1 reduserte markant apoptose i HCK-8-celler etter H/R-behandling. Western blot-analyser viste at H/R-behandling betydelig økte nivåene av apoptose-relaterte proteiner, slik som FasL,p54, Bax og Parp{{4} } i HCK-8-celler(Figur 8C–G). Slike endringer ble redusert av eksogen Wnt1. Disse dataene antyder at eksogen Wnt1 beskytter mot H/R-indusert apoptose i tubulære celler.

FIGUR 8|Eksogen Wnt1 beskytter tubulære celler mot apoptose indusert av hypoksi-reoksygenering (H/R) skade in vitro

(A)Representative FACS-analyser viser at Wnt1 hemmet hypoksi/reoksygenering (H/R)-indusert celleapoptose. HKC-8-celler ble forhåndsuttrykt med eksogen Wnt1, etterfulgt av inkubasjon av inhypoksiske forhold i 48 timer og deretter reoksygenering i 2 timer.(B) Grafikkenpresentasjonen viser prosentandelen av apoptotiske celler i forskjellige grupper som angitt. De PE-merkede Annexin V-positive celler ble talt ved flowcytometri. *P < 0.05="" kontra="" kontroller;="" †p="">< 0,05="" versus="" h/r="" (n="">(C) Representative Western blot-analyser viser proteinekspresjon av FasL, p53, Bax og Parp-1 i HKC-8-celler.(D–G)Grafiske presentasjoner viser den relative mengden av FasL, p53, Bax og Parp-1 i HKC-8-celler. *P < 0.05="" kontra="" kontroller;="" †p="">< 0,05="" versus="" h/r="" (n="">

DISKUSJON

Selv om AKI øker i forekomst og er den største risikofaktoren for progresjon til CKD, finnes det ingen effektive terapier for AKI-forebygging og behandling. En rekke situasjoner, som hjertekirurgi, intra-tubulære avleiringer og administrering av nefrotoksiske legemidler, kan føre til utvikling av AKI (Mas-Font et al., 2017). Dette fremhever behovet for forebyggende tiltak av AKI.

Selv om tallrike studier støtter de gunstige effektene av Wnt/-catenin-aktivering i patogenesen til AKI, forblir det uklare om den forebyggende effekten av Wnt/-catenin agonistson AKI. Et nytt funn i denne studien er at in vivo-uttrykk av eksogen Wnt1 før IR kunne beskytte mus mot AKI og forhindre progresjon av AKI til CKD. In vivo-ekspresjon av eksogen Wnt1 2 dager før renal bilateral IR var i stand til å aktivere renal-catenin, noe som førte til redusert renal apoptose og betennelse i AKI-mus (1 dag etter IR). I tillegg in vivo ekspresjon av eksogen Wnt1 3 dager før nyre-unilateral IR hemmet endogen Wnt/-cateninsignalering og forhindret utvikling av nyrefibrose i CKD-mus (11 dager etter IR). I motsetning til dette ble in vivo-ekspresjon av eksogen Wnt1 5 dager etter nyre-IR vist å indusere -catenin-aktivering og akselerere AKI til CKD-progresjon (Xiao et al., 2016). Disse studiene tyder på at tidspunktet for Wnt/-cateninagonister er en viktig faktor når de brukes til forebygging og behandling av AKI.

Studier tyder på at vedvarende aktivering av Wnt/-cateninsignalering kan drive utviklingen av AKI til CKD. ICG 001 hemmer selektivt Wnt/-catenin/CREB-bindende protein(CBP)-signalering og er for tiden i en klinisk studie for ulike kreftformer. Vi har tidligere vist at administrering av ICG -0115 dager etter IR gjenopprettet nyrefunksjonen og hindret progresjonen av AKI til CKD, noe som fremgår av redusert nyrefibrose (Xiao et al., 2016). I tillegg var ICG-001-administrasjon som startet 3 dager etter unilateral ureteral obstruksjon (UUO) i stand til å svekke nyrefibrotiske lesjoner i UUO-modeller av CKDmus (Hao et al., 2011). Den nåværende studien viste imidlertid at forbehandling av ICG-001 3 dager før IR ikke hadde noen effekt på renal Wnt/-catenin-signalering eller progresjon av AKI tilCKD. Dette er ikke overraskende fordi Wnt/-catenin-signalering uttrykkes ved svært lave nivåer i uskadde voksne nyrer (Tanet al., 2014). Ikke desto mindre tyder funnene våre på at tidspunktet og varigheten av ICG{15}}-administrasjon er avgjørende for å bestemme dets terapeutiske utfall.

Mekanismer som ligger til grunn for den beskyttende effekten av Wnt/-catenin kan involvere modulering av apoptose og overlevelsesveier. Genetisk ablasjon av tubulus-catenin fremmer tubulær apoptose etter IRI- eller folsyrebehandling, mens aktivering av Wnt/-catenin undertrykker pro-apoptotiske proteiner (Wnt/-catenin). ,2009; Zhou et al., 2012). I denne studien hemmet eksogenWnt1 markant tubulær celleapoptose i både IRImusemodeller av AKI og H/R-induserte cellemodeller av AKI. Dette antyder at apoptose kan være en potensiell mekanisme som ligger til grunn for den forebyggende effekten av eksogen Wnt1 på AKI og AKI til CKD-progresjon. Denne studien demonstrerte også en hemmende effekt av eksogen Wnt1 på NF-KB-aktivering i både AKI og CKD, noe som indikerer undertrykkelse av inflammatorisk respons. Det skal imidlertid bemerkes at hvorvidt redusert betennelse er en sekundær effekt til beskyttelse eller beskyttelsesmekanismene mediert av eksogen Wnt1 gjenstår å bestemme. Ytterligere studier er nødvendig for å belyse den eksakte mekanismen for eksogen Wnt{12}}mediert beskyttelse mot AKI og forebygging av AKI til CKD-progresjon.

Bruk Wnt/-catenin-modulatorer for å forebygge og behandle AKI og CKD

KONKLUSJON

Som konklusjon gir denne studien bevis for å støtte den forebyggende effekten av Wnt/-catenin-aktivering på IR-relatert AKI og CKD, selv om mer arbeid er nødvendig for å belyse de nøyaktige mekanismene som eksogen Wnt1 beskytter mot AKI og CKD. Gitt den doble rollen til Wnt/-catenin-signalering i AKI og CKD, fremhever denne studien viktigheten av timing ved bruk av Wnt/-catenin-modulatorer for forebygging og behandling av AKI. Fremtidige studier som bruker mer farmakologiske og genetiske tilnærminger samt optimal behandlingstid og varighet er garantert for å undersøke effekten av Wnt/-cateninagonister i AKI-forebygging og behandling.

FRA: Exogenous Wnt1 forhindrer akutt nyreskade og dens påfølgende progresjon til kronisk nyresykdom, Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5og Liangxiang Xiao^{3 *}

Front. Physiol., 08. november 2021|https://doi.org/10.3389/fphys.2021.745816