Whitening aktivitet av bestanddeler isolert fra Trichosanthes-massen

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Rongchao Zhang,1,2Xiuqin Hu,1Bo Zhang,1ZhenWang,1Chunxiang Hao,1 Jie Xin,1og Qingmei Guo 2

Abstrakt: Blekingenkosmetikkmarkedet har en lys fremtid, og rene naturlige blekingsprodukter av tradisjonell kinesisk medisin har alltid vært et forskningshotspot. I denne forskningen ble den blekende aktive ingrediensen i kinesisk medisin Trichosanthes-masse isolert og renset for første gang, og densblekingmekanismen ble avklart. Kromatografiske metoder som silikagel, ODS og HPLC ble brukt for å isolere og rense dem. B16-celler ble brukt til å måle antioksidantaktiviteten,tyrosinaseaktivitet og melaninfjerningsaktivitet. Totalt 20 forbindelser ble isolert, inkludert p-hydroksybenzaldehyd (1), salisylsyre (2), vanillinsyre (3), isovanillinsyre (4), protokatekuat (5), transkanelsyre (6), {{9 }}kumarsyre (7), transferulsyre (8), drechslerol-B (9), cykloheksanol 3-palmitat (10), 5-acetoksymetyl-2-furaldehyd (11), 5-hydroksymetylfurfural (12), diosmetin (13), apigenin (14), krysoberyl (15), luteolin (16), 4'-hydroksyscutellarin (17), quercetin (18), 3',{{31} }dihydroksy-7-(-D-glukopyranosyloksy)-4'-metoksyflavon (19) og ciprofloksacin-7-O- -D-glukosid (20). Blant dem har forbindelsene 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 og 20 gode antioksidantreparerende effekter; forbindelsene 3, 4, 5, 6 og 7 har høy svart-inhibering; forbindelsene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 og 20 har åpenbar tyrosinoksidaseinhibitorisk aktivitet. 1e resultater la grunnlaget for videre utvikling og utnyttelse av Trichosanthes masseressurser og gir også grunnlag for utvikling av naturligeblekingkosmetikk.

Cistanche herbaer ennaturlig blekingsingrediens.

1. Introduksjon

Trichosanthes kirilowii Maxim. er en flerårig klatreurt fra Cucurbitaceae-familien. Dens frukt, frø, skall og rot brukes ofte som tradisjonelle kinesiske medisiner. I lang tid blir massen av Trichosanthes ofte kassert i produksjonen og behandlingen av Semen Trichosanthis og Pericarpium Trichosanthis, noe som resulterer i betydelig avfall. For tiden er rapporter om Trichosanthes-masse hovedsakelig fokusert på innholdssammenlikning av sukker, aminosyrer, vitaminer og andre næringsstoffer [1–4]. Det er ingen rapport om den kjemiske sammensetningen av Trichosanthes-masse. Derfor er det nødvendig å studere de kjemiske bestanddelene i massen systematisk.

Samtidig, med den raske utviklingen av økonomien, er kosmetikk ikke bare livsstilsprodukter med høyt forbruk, men blir også de mest populære "nødvendigheter" for kvinner. Mange bøker om klassisk kinesisk medisin eller materiamedica har registrert at Trichosanthes-masse har funksjonenblekingog rynkefjernende effekter [5–7]. 1e tidligere resultater fra vår forskningsgruppe viser at vannekstraktet av Trichosanthes-masse hadde høyeretyrosinasehemmende aktivitet, og tyrosinaseinhiberingsgraden var omtrent 70 prosent. 1evanligblekingmidler vitamin C (VC) og arbutin ble brukt som kontrollstoffer [8]. Det ble foreløpig bevist at ekstraktet av Trichosanthes-masse hadde en viss blekende effekt ved å hemme aktiviteten til tyrosinase. Derfor er det av stor betydning å studere de kjemiske bestanddelene og blekingsmekanismen til Trichosanthes-masse.

Deblekingmekanismen kan oppsummeres som å hemme syntesen av melanin og akselerere overføringen av melanin. 1e prosessen med melanindannelse i melanocytter er som følger:tyrosinaseoksiderer tyrosin til polymorf BA (DOPA); deretter oksideres det til dopakinon.Etter en rekke metabolske reaksjoner produseres melanin.Tyrosinase er det eneste hastighetsbegrensende enzymet i reaksjonsprosessen, og dets aktivitet bestemmer mengden melanin som syntetiseres. Når tyrosinaseaktiviteten økes, øker melaninsyntesen; når tyrosinaseaktiviteten hemmes, reduseres melaninsyntesen [9]. 1e aktive senter av tyrosinase har et dobbelt kobberaktivt sted, og hvert kobberion kombineres med 3 histidinrester med henholdsvis 1 eller 2 valenser. 1 derfor kan reduksjonen med antioksidanteffekter interagere med kobberatomet på det aktive stedet oftyrosinase eller redusere mellomproduktet i prosessen med melaninsyntese for å hemme dannelsen av melanin[10, 11]. I tillegg kan hemming av overføringen av modne melanocytter til keratinocytter også spille en rolle ved bleking.

Cellekulturteknologi brukes til å bestemme effekten avblekingaktive ingredienser påtyrosinaseaktivitet og melaninproduksjon i melanocytter in vitro. 1e musemelanomcellelinje (B16-celler) er avledet fra hudmelanomceller fra mus, og dens grunnleggende struktur, spesielt når det gjelder melaninsyntese, er i utgangspunktet den samme som for humannormale melanomceller. Siden det er svært vanskelig å dyrke menneskelige primære hudmelanomceller, kan musemodellen brukes som en testcelle for å bestemmeblekingaktive ingredienser. Derfor ble B16-celler brukt til å måle antioksidantaktivitet, tyrosinaseaktivitet og melaninfjerningsaktivitet, og de blekende aktive komponentene og den relaterte mekanismen ble bestemt foreløpig. Resultatene la grunnlaget for videre utvikling og utnyttelse av Trichosanthes-masseressurser og gir også grunnlag for utvikling av naturlig blekekosmetikk.

2. Eksperimenter

2.1. Materialer.

Trichosanthes trichosanthis ble samlet inn fra Hebao plantebase for urtemedisin i Pinyin, Jinan. 1e prøver ble identifisert av professor QingmeiGuo ved Shandong University of Traditional Chinese Medicine. Etter å ha fjernet skallet og frøene, ble fruktkjøttdelen av frukten oppnådd. Etter frysetørking ble massen knust, blandet og til slutt plassert i en eksikkator for videre bruk.

fersk cistanchemedechinacosideeffekter

2.2. Cellelevedyktighet.

B-16-celler (musemelanomceller) ble kjøpt fra KeyGEN og holdt i DMEM-medium supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (FBS), ved 37 grader i en fuktet atmosfære med 5 prosent CO2. 1en, B-16-celler ble sådd i 96-brønnplater (10 × 104 celler/brønn) i 24 timers inkubasjon.

2.3. Fremstilling av forskjellige ekstrakter.

Råmaterialet til massen av Trichosanthes kirilowii var 4,5 kg. 1e masse ble bløtlagt i 10 ganger mengden 95 prosent etanol 3 ganger. 1 ekstrakter ble kombinert og konsentrert til ca. 3,0 1. Anetylacetatekstrakt ble oppnådd ved å dispergere etanolekstraktet i 15 1 vann, ekstrahere det med etylacetat inntil ekstraktet var fargeløst. 1e ekstrakter ble kombinert og konsentrert under redusert trykk.

Etylacetatekstraktet ble blandet med silikagel (100–200 mesh) i et forhold på 1:2 (ekstrakt: silikagel, v/ v). Løsningsmidlet ble fordampet, og gelen ble reservert. 1e glasskromatografikolonne (8{{30}} mm × 1200 mm) ble pakket med 200–300 mesh silikagel og D101 makroporøs harpiks, og deretter ble kolonnen eluert med etylacetat, petroleumseter (10 prosent, 25 prosent, 50 prosent, 75 prosent og 100 prosent), og metanol, etylacetat (5 prosent, 10 prosent, 25 prosent, 50 prosent) , 75 prosent og 100 prosent ), for å samle hver flyt. Til slutt ble hver fraksjon samlet og konfigurert til følgende konsentrasjoner: 0,003125 mg/ml, 0,00625 mg/ml, 0,0125 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,25 mg/mL, 0,20 mg/ml ml, 1,0 mg/ml og 2,0 mg/ml, og deretter brukt til å behandle de dyrkede cellene. På slutten av behandlingen ble 20 μL MTT-løsning (5 mg/ml) tilsatt hver brønn. 1e celler ble inkubert i 20 minutter ved 37 grader. 1 esupernatant ble kastet, og 100 μL DMSO ble tilsatt til hver brønn. 1e absorbans ble målt ved 490 nm. 1 eksperiment ble gjentatt 3 ganger. 1e overlevelsesrate ble beregnet som følger:

overlevelsesrate prosent=(eksperimentell gruppe blank gruppe)/(kontrollgruppe - blank gruppe) × 100 prosent .

Den optimale konsentrasjonen (C1) av hver fraksjon ble beregnet i henhold til det funksjonelle forholdet mellom overlevelsesraten og hver fraksjonskonsentrasjon. C1 ble fortynnet 2, 4, 6 og 8 ganger for å oppnå konsentrasjonene C2, C3, C4 og C5, henholdsvis. 1e forskjellige ekstrakter av massen er vist i tabell 1.

Tabell 1: Polare ekstrakter av Trichosanthes-masse og optimal konsentrasjon.

2.4. Whitening eksperiment

2.4.1. Antioksidanttest.

En MTT-analyse ble brukt for å bestemme cellelevedyktighet (MTT Kit, Kaiji Biology). 1en, B-16-celler ble sådd i 96-brønnplater (10 × 104 celler/brønn) i 24 timer og behandlet med forskjellige ekstrakter eller forbindelser i 24 timer. Etterbehandling ble kulturmediet kastet og vasket to ganger med PBS. 1en ble 0,05 prosent H2O2 tilsatt, og cellene ble dyrket i 4 timer. Etter det ble B-16-celler inkubert i 20 µL MTT-løsning (5 mg/ml) ved 37 grader i 4 timer. 1en ble kultursupernatanten fjernet, og resten ble oppløst i 100 µL DMSO. 1e-absorbansen ble detektert ved 490 nm ved bruk av en mikroplateleser (Tecan Trading AG). 1eeksperimenter ble utført parallelt 3 ganger.

2.4.2. Hemming av melaninproduksjon.

Produksjonen av melanin ble bestemt ved å påvise melanininnholdsceller ved NaOH-pyrolyse [12]. Celler ble sådd i 96-brønnkulturplater i 24 timer ved en celletetthet på 10 ×104 celler/brønn.1en, cellene ble behandlet med forskjellige ekstrakter eller forbindelser i 24 timer. Deretter ble cellekultursupernatanten (300 µL) fjernet, og resten ble oppløst i NaOH (1 ml, 1,0 mol/L) i 24 timer ved romtemperatur. 1eabsorbansen ble målt ved 475 nm, ved bruk av en mikroplateleser (Tecan Trading AG). 1e eksperimenter ble utført parallelt med 3 replikater. 1e IC50 ble bestemt av GraphPad Prism 5-programvare (GraphPad Software, Inc., San Diego, California), og arbutin ble brukt som en positiv kontroll (IC50 =15.6 µL).

2.4.3. Tyrosinaseaktivitetsbestemmelse.

Cellekultursupernatanten ble fjernet, og resten ble oppløst i Tritonx-100 (90 µL) ogtyrosinase(10 µL, 1,0 mg/ml, Sigma, T3824 25ku). Etter blanding ble blandingen inkubert ved 37 grader i 30 minutter. 1e-absorbansen ble målt ved 475 nm ved bruk av en mikroplateleser (Tecan Trading AG). 1eeksperimenter ble utført parallelt 3 ganger. 1e IC50 ble bestemt av GraphPad Prism 5-programvare (GraphPadSoftware, Inc., San Diego, California), og arbutin ble brukt som en positiv kontroll (IC50 =15.6 µL).

2.5. Ekstraksjon og isolasjon. Etylacetatekstraktet ble oppløst i metanol, og kolonnen ble pakket med 200–300 mesh silikagel, som ble ekvilibrert med petroleumseter. 1en, en gradienteluering bestående av petroleumseter og etylacetat i forhold på 2:1, 1:1 og 1:2; etylacetat; etylacetat og metanol i forhold på 2:1, 1:1 og 1:2; og metanol ble brukt i forbindelse med TLC for å oppnå forbindelsene A (11,5 g), B (10,4 g), C (12,1 g), D (5,2 g) og E (6,1 g).

A ble separert ved polyamidkolonnekromatografi ved bruk av diklormetan og metanol i forhold på 2:1, 1:1 og 1:2 som elueringsløsningsmiddel. 1e eluat ble overvåket med TLC. Flekker med samme retensjonsfaktor (rf ) ble kombinert, og A1 og A2 ble oppnådd. 1en, A1 ble fremstilt ved TLC, ved bruk av diklormetan og metanol i et forhold på 1:1 som fremkallingsmiddel, og renset flere ganger med gelkolonnen. Til slutt ble forbindelse 1 (17 mg) og forbindelse 2 (27 mg) oppnådd. A2 ble renset ved silikagelkolonnekromatografi ved bruk av diklormetan og metanol som elueringsmiddel i forhold på 1:1 og 1:2. Forbindelse 3 (11 mg), forbindelse 4 (12 mg) og forbindelse 5 (23 mg) ble oppnådd. B ble separert ved omvendt-fase C18 middels trykkkromatografi (RP-C18), ved bruk av metanol, vann i en gradienteluering som følger: 0 prosent ,10 prosent , 15 prosent , 20 prosent , 25 prosent , 30 prosent , 35 prosent, 40 prosent, 50 prosent, 75 prosent, 90 prosent og 100 prosent. 1e strømningshastighet var 10 mL·min−1. 1e strømningsfraksjoner med samme rf ble kombinert, og B1 og B2 ble oppnådd. B1 ble gjentatte ganger renset av gelkolonnen, med metanol som et elueringsmiddel. Forbindelse (24 mg), 7 (21 mg) og 8 (18 mg) ble oppnådd etter gjentatt eluering. B2 ble renset med gelkolonnen og metanol, og forbindelse 9 (11 mg) ble oppnådd. C ble separert med RP-C18 og eluert med metanol og vann med en strømningshastighet på 10 mL·min−1. 1e strømningsfraksjoner med samme rf ble kombinert, og Cl, C2 og C3 ble oppnådd. Cl ble fremstilt av gelkolonnen og eluert med metanol, og forbindelse 10 (13 mg) ble oppnådd. C2 ble separert med silikagelkolonne og eluert med etylacetat og metanol, med en gradienteluering i forhold på 2:1, 1:1 og 1:2. C2 ble renset ved preparativ væskefaseekstraksjon, og forbindelsene 11 (15 mg) og 12 (14 mg) ble oppnådd. C3 ble separert med polyamidkolonnen, eluert med metanol og vann og renset ved HPLC. Forbindelser 13 (34 mg), 14 (42 mg) og 15 (38 mg) ble oppnådd. D ble separert med RP-C18 og eluert med metanol og vann.1e strømningshastigheten var 10 mL·min−1. Forbindelser 16 (36 mg), 17 (19 mg) og 18 (37 mg) ble oppnådd ved HPLC. Forbindelsene 19 (29 mg) og 20 (34 mg) ble oppnådd ved gradienteluering ved bruk av etylacetat og metanol i forhold på 1:1 og 1:2, etterfulgt av 100 prosent metanol på en silikagelkolonne.

herba epimedium sagittatum på huden

3. Resultater og diskusjon

3.1. Bestemmelse av aktive ekstrakter (E1–E11).

1e optimal konsentrasjon (nemlig C1) av hvert ekstrakt ble beregnet og er vist i tabell 1. 1e antioksidanteksperiment viser at alle ekstrakter har antioksidantreparasjonseffekt, men sammenlignet med VC er antioksidanteffekten til hver gruppe svak. 1eantioksidantaktiviteten til E1, E3, E4, E7 og E11 ble redusert innen økende konsentrasjon, som vist i figur 1. 1e melanininhiberingstest viste at alle polare komponenter i pulpof Trichosanthes kirilowii hemmet melaninsyntese. Spesielt var melanin-hemmingshastigheten betydelig høyere for E2, E3 og E4 enn for den positive kontroll-arbutin, som vist i figur 2. 1e-resultater avtyrosinaseaktivitet viser at alle polare komponenter i massen av Trichosanthes kirilowiii hemmet tyrosinaseaktivitet, og hemmingstrenden var lik den for melaninhemming. 1e-hemming av tyrosinaseaktivitet var signifikant høyere for E2, E3, E4 og E8 enn for den positive kontrollen. Generelt har ekstraktene fra petroleumseter en lav inhiberende effekt på tyrosinase.1e ekstrakter fra etylacetat har en høy hemmende effekt på tyrosinase, spesielt de polare komponentene fra etylacetat. 1e-ekstrakter fra n-butanol har også en høy hemmende effekt på tyrosinase, som vist i figur 3.

3.2. Isolering og identifikasjon av monomerkomponenter.

20 forbindelser ble separert med silikagel- og ODS-kromatogramkolonner samt preparativ HPLC. På grunnlag av NMR- og MS-dataanalyse ble deres strukturer belyst.1e 20 forbindelser er vist i tabell 2, og de spesifikke analytiske dataene for monomerer er vist i vedlegg 1.

3.3. Valideringsanalyse av effektive forbindelser

3.3.1. Valideringsanalyse av antioksidantforbindelser.

E1, E2, E3, E4 og E5 har antioksidanteffekter. 1e hovedforbindelser isolert fra komponentene ovenfor var drechslerol-B (forbindelse 9), cykloheksanol 3-palmitat (forbindelse 10), 5-acetoksymetyl-2-furaldehyd (forbindelse 11), 5-hydroksymetylfurfural ( forbindelse 12), diosmetin (forbindelse 13), apigenin (forbindelse 14), chrysoberyl (forbindelse 15), luteolin (forbindelse 16), 4'-hydroksy-scutellarin (forbindelse 17), quercetin (forbindelse 18), 3',{{ 25}}hovedforbindelsene var glykosider, noe som indikerer at glykosider har gode antioksidantaktiviteter. Fenolsyrer, som 5-acetoksymetyl-2-furaldehyd (forbindelse 11), 5-hydroksymetylfurfural (forbindelse 12), diosmetin (forbindelse 13), apigenin (forbindelse 14), krysoberyl (forbindelse 15) ,luteolin (forbindelse 16), 4'-hydroksyscutellarin (forbindelse 17), quercetin (forbindelse 18) og 3',5-dihydroksy-7-(-Dglucopyranosyloksy)-4'-metoksyflavon, har også gode antioksidantaktiviteter, på grunn av den fenoliske hydroksylgruppen og umettede dobbeltbindinger [26, 27]. 1e resultater er vist i figur 4.

Figur 4: Celleoverlevelsesrate (prosent) av antioksidanteksperimentet av forskjellige forbindelser fra Trichosanthes-ekstrakter

3.3.2. Valideringsanalyse av melaninhemmende forbindelser.

E11, E12, E13, E16, E17 og E18 har god hemmende effekt på melaninsyntesen. 1e hovedforbindelser isolert fra komponentene ovenfor er vist i tabell 2. I henhold til metoden i seksjon 2.4.2 ble effekten av hver forbindelse på syntesen av melanin bestemt. Hver forbindelse ble evaluert ved følgende konsentrasjoner: 1000 ug/ml, 800 ug/ml, 400 ug/ml, 200 ug/ml og 100 ug/ml. Hver måling ble utført i tre eksemplarer, og inhiberingshastigheten for melaninsyntese ble beregnet.

Protokatekuat (forbindelse 5), 5-acetoksymetyl-2-furaldehyd (forbindelse 11), 5-hydroksymetylfurfural (forbindelse 12), diosmetin (forbindelse 13), p-hydroksybenzaldehyd (forbindelse 1), salisylsyre (forbindelse 2), vanillinsyre (forbindelse 3), isovanillinsyre (forbindelse 4), trans-kanelsyre (forbindelse 6), 4- kumarsyre (forbindelse 7), apigenin (forbindelse 14), chrysoberyl (forbindelse 15 ), luteolin (forbindelse 16), 4'-hydroksyscutellarin (forbindelse 17), quercetin (forbindelse 18), 3',5-dihydroksy-7-(-D-glukopyranosyloksy)-4′ -metoksyflavon (forbindelse 19), ofloksacin-7-O- -D-glukosid (forbindelse 20) kan hemme melaninproduksjonen [28]. Spesielt har vanillinsyre (forbindelse 3), isovanillinsyre (forbindelse 4), protokatekuat (forbindelse 5), transkanelsyre (forbindelse 6) og 4-kumarsyre (forbindelse 7) høy melaninhemming. 1e resultater er vist i figur 5.

3.3.3. Verifikasjon og analyse av forbindelser som hemmer tyrosinaseaktivitet.

E2, E3, E4, E7, E8 og E9 har gode hemmende effekter påtyrosinaseaktivitet. 1e hovedforbindelser isolert fra komponentene ovenfor er vist i tabell 2. I henhold til metoden presentert i seksjon 2.4.3 ble arbutin brukt som kontroll, og forbindelseskonsentrasjonen var 1000 µg/ml, 800 µg/ml, 400 µg/mL 200 µg/ml og 100 µg/ml. Hver måling ble utført 5 ganger, og inhiberingshastigheten for tyrosinase ble beregnet. 1e-resultatene er vist i figur 6.

1e resultater viser at diosmetin (forbindelse 13), apigenin (forbindelse 14), chrysoberyl (forbindelse 15), luteolin (forbindelse 16), 4'-hydroxyscutellarin (forbindelse 17), quercetin (forbindelse 18), 3', {{10} }dihydroksy-7-(-D-glukopyranosyloksy)-4′-metoksyflavon (forbindelse 19), ciprofloksacin-7-O- -D-glukosid (forbindelse 20), p-hydroksybenzaldehyd (forbindelse 1), salisylsyre (forbindelse 2), vanillinsyre (forbindelse 3), isovanillinsyre (forbindelse 4), protokatekuat (forbindelse 5), trans-kanelsyre (forbindelse 6), 4- kumarsyre (forbindelse 7 ), og trans-ferulsyre (forbindelse 8) har alle åpenbaretyrosinasehemmende aktiviteter.

Cistanche-plante hemmer tyrosinaseaktivitet.

Klikk på bildet og få flere detaljer.

Hydroksylsubstituerte forbindelser på benzenringen, slik som p-hydroksybenzaldehyd (forbindelse 1), salisylsyre (forbindelse 2), vanillinsyre (forbindelse 3), isovanillinsyre (forbindelse 4), protokatekuat (forbindelse 5), transkanelsyre ( forbindelse 6), 4-kumarsyre (forbindelse 7), trans-ferulsyre (forbindelse 8) og flavonoider, viste høy tyrosinaseinhibering, og inhiberingshastigheten for para-substituerte forbindelser var betydelig høyere enn for orto-substituerte forbindelser . For eksempel var den hemmende aktiviteten til p-hydroksybenzaldehyd betydelig høyere enn den til salisylsyre, og den hemmende aktiviteten til vanillinsyre var betydelig høyere enn den til isovanillicacid. Dessuten var den hemmende aktiviteten til p-hydroksybenzaldehyd betydelig høyere enn den til salisylsyre, vanillinsyre, isovanillinsyre og protokatekuat. Årsaken kan være at de nukleofile gruppene rundt det aktive senteret avtyrosinase, slik som –SH, −NH2 og –OH, opptar plassen rundt det aktive senteret og forhindrer dermed tyrosin i å angripe det aktive senteret. Til slutt ble syntesen av melanin hemmet [28]. Den hemmende aktiviteten til forbindelser som inneholder o-dihydroksy var sterkere enn den til parahydroksyforbindelser, og den hemmende aktiviteten til protokatekuat var betydelig høyere enn for vaniljessyre. 1e ovenfor fenomener finnes også i flavonoider. 1-hemmende hastigheten for flavonoider som inneholder 7 og 4' hydroksylgrupper var signifikant høyere enn hvis 7 og 4' hydroksylgruppene byttes ut. For eksempel var den hemmende aktiviteten til chrysoberyl betydelig høyere enn den til diosmetin, mens den hemmende aktiviteten til diosmetin var høyere enn den til 3',5-dihydroksy-7-(-D-glukopyranosyloksy)-4 ′- metoksyflavon og ciprofloksacin-7-O- -D-glukosid. 1inhiberingshastigheten for flavonoider som inneholder 3-hydroksy var signifikant høyere enn for forbindelser uten 3-hydroksy eller hvis 3-hydroksyen ble erstattet. For eksempel var den hemmende aktiviteten til quercetin signifikant høyere enn den til 4'-hydroksyscutellarin, men den hemmende aktiviteten til 4'-hydroksyscutellarin var høyere enn den til quercetin-3-o glukosid. I tillegg er den hemmende aktiviteten til koellin-vasker høyere enn den til apigenin, men lavere enn den til luteolin. Det er foreslått at B-ringsubstituentene, spesielt hydroksylgruppen, kan forsterketyrosinaseinhiberende aktivitet, og ortodihydroksygruppen i B-ringen hadde større hemmende aktivitet [29].