Yishen Qingli Heluo Granule i behandling av kronisk nyresykdom: Nettverksfarmakologianalyse og eksperimentell validering

Bakgrunn:Kronisk nyre sykdom(CKD) regnes som et globalt folkehelseproblem med høy sykelighet og dødelighet. Yishen Qingli Heluo granule (YQHG) er en representantTradisjonell kinesisk medisin(TCM) rettsmiddel forklinisk behandling av CKD. Denne studien tar sikte på å utforske mekanismen til YQHG på CKD gjennom nettverksfarmakologi og eksperimentell validering.

Metoder:Tradisjonelle kinesiske medisinsystemerFarmakologi (TCMSP) database og storskala litteraturutvinning ble brukt for å screene aktive forbindelser av YQHG. Flere bioinformatiske verktøy og online databaser ble brukt av oss for å oppnå relevante mål for YQHG og CKD. Skjæringsmålene mellom YQHG og CKD ble betraktet som kandidatmål. Sammensatt-mål-, urtekandidat-målet og protein-protein-interaksjonsnettverk ble konstruert og visualisert for topologiske analyser. GO- og KEGG-anrikningsanalyser ble utført for å bestemme de biologiske prosessene og signalveiene. Molekylær dokking ble brukt for å verifisere påliteligheten til nettverksfarmakologi. Til slutt ble farmakologisk evaluering utført for å utforske mekanismen til YQHG mot CKD på en 5/6 nefrektomimodell.

Resultater:Syttini kandidatmål, ti biologiske kjerneprosesser og en nøkkelsignalvei (p53) ble screenet. PTGS2 ble identifisert som et nøkkelmål basert på H-CT-nettverket. Den molekylære dokkingen viste at Quercetin, Kaempferol, Luteolin var tre nøkkelforbindelser med den beste bindingsaktiviteten. I tillegg kan IL6 og Quercetin danne et stabilt kompleks med høy bindingsaffinitet (-7,29 kcal/mol). In vivo-eksperimenter viste at YQHG forbedret nyrefunksjon og fibrose hos 5/6 nefrektomiserte rotter. Dessuten ble det reduserte uttrykket av PTGS2, IL6 og det økte uttrykket av p53 observert i nyrevev. Spesielt ble tarmmikrobiotaen til rotter behandlet med YQHG omformet, noe som var preget av et redusert forhold mellom Firmicutes/Bacteroidota.

Konklusjon: Resultatene våre forutså og bekreftet de potensielle målene for YQHG påCKDfra et helhetlig perspektiv, og ga verdifull retning for den videre forskningen til YQHG.

Nøkkelord:Yishen Qingli Heluo granulat, nettverksfarmakologi,Kronisk nyre sykdom, 5/6 nefrektomi, tarmmikrobiota

FÅ NATURLIG ORGANISK CISTANCHE EKSTRAKT MED 25 % ECHINACOSIDE OG 9 % ACTEOSIDE FOR NYRESINFEKSJON

Introduksjon

Kronisk nyre sykdom(CKD) blir i økende grad anerkjent som et globalt folkehelseproblem med høy sykelighet (8724 per 100,000 personer) og dødelighet (15,9 per 100,000 personer).1 Risikofaktorene og sykdomsveiene som føre til kompromittert nyrefunksjon er mangfoldige og dårlig avklart. Følgelig er få strategier tilgjengelig for å forsinke progresjonen av CKD, med de fleste nåværende behandlingsstrategier sentrert rundt å redusere proteinuri og senke blodtrykk og urinsyre. For eksempel er renin-angiotensin-systemhemmere de viktigste terapeutiske legemidlene for behandling av CKD når det gjelder å redusere proteinuri og beskytte nyrefunksjonen.2,3 Studien rapporterte imidlertid at disse legemidlene kanskje ikke hjelper til å forhindreprogresjon av CKDtilnyresykdom i sluttstadiet(ESRD);4 dessuten kan de forårsake en rekke bivirkninger, som økt serumkalium-, kreatinin- og kreftrisiko.5–8 For tiden har antallet personer som får nyreerstatningsterapi oversteget 2,6 millioner og forventes å dobles til 5,4 millioner på verdensbasis innen 2030.9 Når CKD utvikler seg til ESRD, vil det ikke bare medføre økonomisk belastning for pasientene, men også påvirke deres livskvalitet i stor grad. Følgelig er det et presserende behov for å utforske potensielle terapeutiske legemidler for å forebygge og behandle CKD på dette feltet.

Tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har blitt anerkjent som et potensielt behandlingsalternativ for CKD på grunn av dens beviste effektivitet, brede spekter av bruksområder og få bivirkninger. Mange tilfeller har vist at TCM-urter anses som en alternativ kilde for å forsinke utviklingen av CKD på grunn av konvensjonell erfaring og multi-target-karakteristikker.10–12 Yishen Qingli Heluo granulat (YQHG) ble uavhengig utviklet av Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine som TCM-middel for klinisk behandling av CKD. De kliniske studiene viste at YQHG kunne forbedre kliniske symptomer og redusere nivået av serumkreatinin (Scr). Videre kan progresjonen av CKD3 til CKD4 også bli forsinket av YQHG.13,14 Vår forrige studie viste at YQHG kunne dempe nyreskade ved å regulere autofagi, apoptose og inflammatorisk respons.15 Imidlertid var de fleste studier på granulen hovedsakelig sentrert rundt noen klassiske signalveier som MAPK, TGF- og relaterte veier, som var mangel på helhet. På grunn av fraværet av effektive systematiske metoder i det siste, er forskningen på de effektive forbindelsene, målene og tilsvarende farmakologiske mekanismene til YQHG mot CKD begrenset. Derfor har forskningen vært fokusert på mekanismen til en monomer eller aktiv forbindelse av YQHG ved behandling av CKD. Imidlertid er YQHG som et sofistikert orkester med forskjellige instrumenter. Hvordan disse 10 urtene fungerer sammen for å spille det perfekte repertoaret, må fortsatt utforskes. Derfor er det viktig å finne nye veier for å forstå mekanismene til YQHG mot CKD. Nettverksfarmakologi er en banebrytende metodikk, som først ble foreslått av Hopkins.16 Denne metoden er i samsvar med det holistiske synet på TCM. De siste årene har det blitt mye brukt for å belyse mekanismene til TCM i behandlingen av kronisk sykdom, inkludert CKD.17–19

I denne studien brukte vi først nettverksfarmakologi-tilnærmingen som et verktøy for å utforske de aktive forbindelsene til YQHG og undersøke dens underliggende virkningsmekanisme i behandlingen av CKD. Deretter ble molekylær dokking brukt for å verifisere påliteligheten til nettverksfarmakologi. I tillegg validerte vi det nefroprotektive potensialet til YQHG og nøkkelmåluttrykk i 5/6 nefrektomiserte rotter. Det er verdt å merke seg at tidligere studier hadde vist at tarmmikrobiotaen spilte en viktig rolle i den terapeutiske effekten av TCM.20–22 Tarmmikrobiotaen kunne endre den kjemiske sammensetningen av TCM-urter slik at den hadde en annen biotilgjengelighet, biologisk aktivitet eller toksisitet enn forløperen. TCM-urter kan også omforme mangfoldet og sammensetningen av tarmmikrobiota for å lindre relatert sykdom.23 Derfor brukes 16S rRNA-sekvensering til å analysere forholdet mellom TCM-urter, CKD og profilen til tarmmikrobiota, og legger grunnlaget for videre forskning på YQHG. Detaljene i analyseprosessen til denne forskningen er vist i figur 1.

Materialer og metoder

Nettverksfarmakologianalyser

Anskaffelse av aktive forbindelser og relaterte mål i YQHG Forbindelser av hver urt i YQHG ble hentet fra TCMSP-databasen (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) og omfattende litteraturutvinning. Forbindelsene ble filtrert gjennom ADME-evalueringssystemet, der oral biotilgjengelighet (OB) og legemiddellikhet (DL) var hovedparametrene. OB større enn eller lik 30% og DL større enn eller lik 0,18 var terskelverdiene for ADME-filtreringsmetoden anbefalt av TCMSP-databasen.24 TCMSP, STITCH (http://stitch.embl.de /), PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) og Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) databaser ble brukt for å identifisere målene som tilsvarer hver aktive forbindelse i YQHG . Uniprot-databasen (https://www.uniprot.org/) ble brukt til å standardisere resultatene.

Fishing for Candidate Targets of YQHG in Treating CKD Targets relatert til CKD ble anskaffet fra GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (http://www.omim.org/), DisGeNET (https:// www.disgenet.org/), TTD (http://db.idrblab.net/ttd/) og MalaCards (https://www.malacards.org/) databaser. Alle de innsamlede målene til CKD og YQHG ble slått sammen etter å ha blitt standardisert av Uniprot-databasen.

Kandidatmålene for YQHG mot CKD ble identifisert av Venn-plattformen (http://bioinformatics.psb.ugent.be/ web tools/Venn/), og resultatene ble brukt til videre analyse.

Nettverkskonstruksjon

(1) Compound-target (C-T) network of YQHG: The data of active compounds and their corresponding targets were imported into Cytoscape software (v3.6.0, Boston, MA, USA) to construct the C-T interaction network. The degree centrality, betweenness centrality, and closeness centrality were evaluated by the Network Analyzer plug-in of Cytoscape software. According to the three topological parameters of each node, the key active compound of YQHG was selected and analyzed. (2) Herb-Candidate target (H-CT) network of YQHG: The data of 10 herbs and candidate targets were imported into Cytoscape software to construct the H-CT interaction network. The pie chart was used to indicate the herb to which the candidate target (represented by circular nodes) belonged. (3) Protein-protein interaction (PPI) network of candidate targets: The visualization of PPI network was obtained by combining the STRING database (https://string-db.org/) and Cytoscape software. The species were limited to Homo sapiens, and the PPI confidence score>0.9 var filtreringsparameteren anbefalt av STRING-databasen.25 Noder og kanter representerer henholdsvis kandidatmål og protein-protein-interaksjoner i PPI-nettverket. I denne studien ble kjernemålproteinene valgt og identifisert med parameteren "Degree". Grad ble brukt til å evaluere den topologiske betydningen av nodene i nettverket, som ble beregnet av Network Analyzer-plugin-modulen til Cytoscape-programvaren.

GO og KEGG Pathway Enrichment Analysis

For å undersøke nøkkelbegrepene for den biologiske GO-prosessen og kritiske signalveier for kandidatmål, ble R-pakken (clusterProfiler, versjon 4.1.0) brukt for GO- og KEGG-anrikingsanalyse.26 Justert P-verdi<0.05 was considered statistically significant.

Molekylær dokking

I studiet av molekylær dokking ble Autodock Vina 1.1.2-programvare brukt til å bestemme bindingsmodusen og interaksjonene mellom de viktigste aktive forbindelsene til YQHG og hub-proteiner identifisert basert på PPI- og nettverksanalysatoranalyser. Denne tilnærmingen involverte følgende hovedtrinn: (1) Ligandmolekylfremstilling. 3D-strukturene til aktive forbindelser ble lastet ned i mol2-format fra TCMSP-databasen. AutodockTools 1.5.6 ble brukt til å åpne ligandmolekylet, legge til hydrogen, gasteigerladning, oppdage ligandrot, søke og definere roterbar binding og til slutt lagre det i pdbqt-format. (2) Preparering av reseptormolekyler. 3D-strukturene til hubproteiner ble lastet ned fra RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org). AutodockTools 1.5.6 ble brukt til å laste opp proteinet. Etter å ha lagt til alle hydrogenatomer, beregnet Gasteiger-ladning og kombinert ikke-polart hydrogen, blir den definert som reseptoren og lagret som pdbqt-format. (3) Innstilling av dokkingparametere. AutoGrid-verktøy for å stille inn parameterne til dokkingboksen (XYZ-koordinater og rutenettstørrelse). For å øke nøyaktigheten av beregningen ble uttømmende verdi satt til 20. (4) Utførelse og utgang. Autodock Vina 1.1.2-programvaren ble brukt for semi-fleksibel dokking, og den beste konformasjonen ble valgt som den endelige dokkingkonformasjonen. (5) Analyse og visualisering. Konformasjonen med den beste bindingsaffiniteten ble valgt for dokkingmodusanalyse. Bindingsaffiniteten til proteinet var mindre enn -5 kcal/mol, noe som tyder på at proteinet hadde en viss bindingsaktivitet med forbindelsen.27 Dokkingresultatene til forbindelsen og proteinet med den beste konformasjonen ble analysert og visualisert av PyMol-programvaren.

Utarbeidelse av YQHG

YQHG (batchnummer 20051031) var sammensatt av 10 enkelt TCM-granulat: Angelicae Sinensis Radix (Danggui, DG), Achyranthis Bidentatae Radix (Niuxi, NX), Centella Asiatica (L.) Urban (Jixuecao, JXC), Polygonati Rhizo, (Hujingzo,ma) HJ), Smilacis Glabrae Rhixoma (Tufuling, TFL), Radix Rhei Et Rhizome (Dahuang, DH), Pyrrosiae Folium (Shiwei, SW), Hedysarum Multijugum Maxim (Huangqi, HQ), Serissa Japonica (Thunb.) Thunb (LiuXyuexue, LYXyuexue, SW). ), Polygoni Cuspidati Rhizoma Et Radix (Huzhang, HZ), som ble produsert av Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd. (Wuxi, Jiangsu, Kina). Forholdet mellom enkelt TCM-granulat og tilsvarende rålegemiddel ble oppført i tabell 1. Alle granulene ovenfor ble autentisert av professor Wei Sun (Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing, Jiangsu, Kina). Det vektbaserte medikamentdoseringsformatet (per kg) ble brukt i denne studien for å beregne YQHG-dosene hos rotter.28 Beregnet med en voksen kroppsvekt på 70 kg var den kliniske ekvivalentdosen konvertert til rotter 2,8g/kg, som var brukes som middels dose av YQHG. Den lave dosen og den høye dosen i denne studien var henholdsvis halvparten og to ganger middels dosen av YQHG. UHPLC-MS ble utført for å bekrefte stabiliteten og effektiviteten til YQHG-ekstraktet.

Konstruksjon av 5/6 Nephrectomy og YQHG Administration

Sprague Dawley (SD) hannrotter (nr. 20210312Aazz0619000112, 6–8 uker gamle, 200–230 g) ble levert av Vital River Experimental Animal Co., Ltd. (Zhejiang, Kina). Rotter ble plassert i et spesifikt patogenfritt forsøksdyrsenter ved Nanjing University of Chinese Medicine. Nærmere bestemt ble rotter holdt i plastbur og gitt tilstrekkelig standard mat og vann fritt. Miljøforholdene i rommet der rottene ble oppdrettet inkluderte temperatur (22±2 grader), fuktighet (50±10%) og 12/12 timers lys/mørke-syklus. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til protokollen godkjent av Animal Care and Use Committee ved Nanjing University of Chinese Medicine [tillatelsesnummer 202101A047]. Retningslinjene som ble fulgt for forsøksdyrenes velferd var Forsøksdyrs retningslinjer for etisk gjennomgang av dyrevelferd (GB/T 35892–2018). Alle operasjoner ble utført under passende narkose, og alt ble gjort for å minimere dyrs lidelse.

CKD ble indusert hos 24 rotter ved en to-trinns 5/6 nefrektomi som tidligere beskrevet.29 Prosedyren for de to operasjonene var som følger: ablaterte 2/3 av venstre nyreparenkym (unngå nyrehilum), og deretter raskt plassert en gelatinsvamp på snittoverflaten for å stoppe blødningen i 4–5 minutter. En uke senere ble det utført en høyresidig unilateral nefrektomi. Nyrepedikkelen ble ligert med en steril 3–0 sutur, og deretter ble høyre nyre resekert. Bukhulen ble skylt med 0,9 % sterilt saltvann for å unngå postoperativ abdominal adhesjon etter to kirurgiske operasjoner. Induksjon og vedlikehold av anestesi (forbruket av isofluran var henholdsvis 6mL/t og 3mL/t) under operasjonen ble utført med Rodent Gas Anesthesia Machine (Yuyan-ABS). Seks rotter som gjennomgikk falsk operasjon ble brukt som kontroller. CKD-rotter ble tilfeldig delt inn i fire grupper (n=6 for hver gruppe). Undergruppene og den daglige dosen av gavage-stoffer var som følger: I) Modellgruppe (sterilt vann); II lavdose YQHG gruppe (1,4g/kg YQHG); III) Mellomdose YQHG (2,8 g/kg YQHG); IV) Høydose YQHG (5,6g/kg YQHG). Under forsøket ble alle rottene veid to ganger i uken, og medikamentdosene ble justert deretter. På slutten av forsøket ble urin- og fekalprøver samlet inn fra rotter før de ble ofret. Blodprøver og nyrevev ble samlet inn for videre studier.

Reagenser

Scr, blod urea nitrogen (BUN) og urinprotein kvantifiseringsanalysesett (C011-2-1, C013-2-1, C035-2-1) ble kjøpt fra Nanjing Jiancheng Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Kina). IL-6 ELISA-sett (bsk00042) ble kjøpt fra Nanjing Jinyibai Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Kina). BCA-proteinkonsentrasjonsanalysesett (PC0020) ble hentet fra Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Beijing, Kina). Anti-PTGS2 antistoff (ab179800), Anti-p53 antistoff (ab227655), Anti-GAPDH antistoff (ab181602) og Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab6721) ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK).

Scr, BUN og 24-timers urinproteinkvantifisering

Scr, BUN og 24 timers urinproteinnivåer ble målt ved bruk av Scr, BUN og urinproteinkvantifiseringsanalysesett i henhold til instruksjonene. Blant dem ble urinproteinkvantifisering utført ved 24 timers urinsamling med metabolske bur dagen før rottene ble ofret. Formelen er som følger: Urinprotein (mg/24t)=urinproteinkonsentrasjon (mg/L)×24t urinvolum (L).

Histopatologisk evaluering av nyrevev

Rottenyrer ble skylt med forhåndskjølt PBS (Solarbio) og deretter fiksert i 4 % paraformaldehyd (bioskarp). Snitt (4μm) ble kuttet fra parafininnstøpt nyrevev og farget med hematoksylin og eosin (H&E) eller Massons trikrom (Masson) (Solarbio). Lysmikroskopbilder ble fotografert ved hjelp av en digital lysbildeskanner (typespesifikasjon: Pannoramic DESK, P-MIDI, P250; Firma: 3D HISTECH; Land: Ungarn; Skanneprogramvare: Pannoramic Scanner). Trinnene for å beregne arealet av glomerulær og tubulointerstitiell fibrose var som følger: Først av alt ble CaseViewer2.4-programvaren brukt til å velge det glomerulære (tubulointerstitale) området for 40×bildebehandling. Prøv å fylle hele synsfeltet med vevet, og sørg for at bakgrunnslyset til hvert bilde var konsistent. For det andre utførte Image-Pro Plus 6.0-programvaren bildeanalyse, satte piksel som standardenhet, og to synsfelt ble valgt for hver skive. Til slutt ble fibroseområdet evaluert, det vil si prosentandelen av fibrosearealet (%)=glomerulært (tubulointerstitalt) fibroseområde/glomerulært (tubulointerstitielt) område×100 %.

Analyse av tarmmikrobiota

Avføring fra alle rottene i de fem gruppene (Sham, Model, LD YQHG, MD YQHG, HD YQHG) ble samlet inn for tarmmikrobiotaanalyser. De fire hovedtrinnene involvert i sekvensering av tarmmikrobiota var som følger: I) Ekstraksjon av genom-DNA: Det totale DNA fra avføring ble ekstrahert av EZNA® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek) i henhold til produsentens protokoller. DNA-konsentrasjon og renhet ble overvåket på 1 % agarosegel. II) PCR-amplifisering: V3-V4-regionen til 16S rRNA-genet ble amplifisert ved å bruke en spesifikk primer (338F_806R) med strekkoden. PCR-amplifikasjonen ble utført ved å bruke TransStart Fastpfu DNA-polymerase-settet. III) Kvantifisering, blanding og rensing av PCR-produkter: Se de foreløpige kvantifiseringsresultatene av elektroforese, QuantiFluor™ -ST Assay Kit (Promega) ble brukt til å oppdage og kvantifisere PCR-produktene, og deretter blande de tilsvarende proporsjonene i henhold til sekvenseringskravene til hver prøve. Deretter ble blandingen av PCR-produkter renset med et GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific). IV) Bibliotekforberedelse og sekvensering: Profileringen ble utført på MiSeq-plattformen (Illumina, Inc., San Diego, CA). Rask lengdejustering av korte avlesninger (FLASH, versjon 1.2.11) ble brukt til å filtrere 16S rRNA-sekvenseringsdata. Operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs) ble plukket med en likhetsgrense på 97 %, og de rensede amplikonene ble sekvensert på en Illumina MiSeq-plattform hos Majorbio Biopharm Technology Co. Ltd. (Shanghai, Kina) i henhold til standardprotokollene.

Western Blot og ELISA

Det totale proteinet fra frosne nyreprøver ble ekstrahert med RIPA-lysebuffer (Beyotime) inneholdende 1 % PMSF (Beyotime). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med BCA-proteinkonsentrasjonsanalysesett (Solarbio) i henhold til instruksjonene. Proteiner ble separert med SDS-PAGE-geler og overført til PVDF-membraner (Solarbio). Etter blokkering med 5 % BSA (Solarbio), ble membranene inkubert med primære antistoffer PTGS2 (1:1000), p53 (1:1000), GAPDH (1:10.000) ved 4 grader over natten. Deretter ble membranene vasket med TBST (Solarbio) og inkubert i 60 minutter ved romtemperatur med Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (1:20 000). Membranene ble inkubert med Ultrasensitive ECL Detection Kit (Proteintech) i 1–2 minutter og deretter detektert på BIO-RAD ChemiDoc XRS+ Gel Imaging System (Bio-Rad, California, USA). Gråverdiene til proteinbåndene ble analysert ved bruk av Image Lab-programvaren (Bio-Rad).

PBS ble tilsatt til nyrevevet (1 ml/0,1 g), og den elektrohomogeniserte prøven ble sentrifugert for å samle supernatanten. Deretter ble rotte IL-6 ELISA-settet brukt for å påvise uttrykket av IL-6 i henhold til instruksjonene.

Statistisk analyse

Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. GraphPad Prism 9.0 programvare (GraphPad, CA, USA) ble brukt til statistisk analyse og bildekonstruksjon. Vi kombinerte QQ-plott (tilleggsfigur 1) med Shapiro-Wilk-testen for å vurdere datanormalitet. For normalfordelte data ble enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys test brukt. For ikke-normalfordelte data ble Kruskal–Wallis-testen etterfulgt av den ikke-parametriske Wilcoxon rangsumtesten brukt. s<0.05 was considered statistically significant.

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportøren i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Handle for flere spesifikasjoner:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÅ NATURLIG ORGANISK CISTANCHE EKSTRAKT MED 25 % ECHINACOSIDE OG 9 % ACTEOSIDE FOR NYRESINFEKSJON