Antioksidant- og stivelseshydrolyserende enzymer Hemmende egenskaper til Striga-resistente gul-oransje maishybrider

For mer informasjon, kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: De fleste av helsefordelene fra korn tilskrives deres bioaktive forbindelser. Denne studien evaluerte nivåene av de bioaktive forbindelsene ogantioksidantog stivelseshydrolyserendeenzymerhemmende egenskaper til seks pipeline Striga-resistente gul-oransje maishybrider (kodet AS1828-1, 4, 6,8, 9, 11) in vitro. Maishybridene ble dyrket ved International Institute of Tropical Agriculture (ITA), Nigeria. De bioaktive forbindelsene (totale fenoler, tanniner,flavonoider, og fytat)nivåer, antioksidant (DPPH" og ABTS renseevne og reduserende kraft), og stivelseshydrolyserendeenzymer(-amylase og x-glukosidase)-hemmende aktiviteter av maishybridene ble bestemt ved spektrofotometri. Samtidig ble karotenoider kvantifisert ved å bruke et omvendt-fase HPLC-system. Områdene for de bioaktive forbindelsene var: 11.25-14.14 mg GAE/g (totalt fenol),3.62-4.67 mg QE/g (totalt flavonoider), 3.{{1{ {34}}}}.29 mg/g (tanniner),3.66-4.31 prosent (fytat),8.92-12.11ug/g (totalt xantofyller),2.{{19 }}.89 ug/g (totalt -karoten) og 3.17-3.77 ug/g(totalt provitamin A-karotenoider). Ekstrakter av maishybridene fanget DPPH"(SC50: 9. 07-26.35 mg/mL)og ABTS*(2.{{30}}.68 TEACmmol/g),reduserte Fe3 pluss til Fe2 pluss (0.25±0.64-0 0,43±0,01 mg GAE/g), og hemmet -amylase og -glukosidase, med IC50-områder på henholdsvis 26.28-52.55 mg/mL og 47.72-63.98 mg/ml. Blant de seks klonene av maishybridene hadde AS1828-9 høyest (s<0.05)levels of="" tannins="" and="" phytate="" and="" the="" strongest="">antioksidantog stivelseshydrolyserende enzymhemmende aktiviteter. Signifikante korrelasjoner ble observert mellom totale fenoler og følgende: ABTS*(s<0.01, r="0.757)," dpph"sc50=""><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase=""><0.01,r=-0.836) and="" α-glucosidase=""><0.05, r="-0.582).Hence," the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids(especially="" as1828-9)="" may="" be="" beneficial="" for="" alleviating="" oxidative="" stress="" and="" postprandial="">

Nøkkelord: total fenoler; totalt flavonoider; tanniner; karotenoider; fytinsyre; alfa-glukosidase-inhiberingsanalyse; alfa-amylaseinhiberingsanalyse

1. Introduksjon

Tilveiebringelse av høytytende, næringsrike og sunne matvekster er avgjørende for å møte utfordringene fra underernæring og sykdommene forbundet med den. Derfor har forskjellige systematiske tilnærminger, som å avle sykdomsresistente stifter med forbedret ernæringskvalitet, blitt brukt i forskningsprogrammer for planteavl for å møte kostholdsbehovene til den raskt økende globale befolkningen. Dette har blitt mer avgjørende med tanke på den drastiske reduksjonen i mengden og kvaliteten på den globale matforsyningen forårsaket av miljøforurensning, global oppvarming og utvikling av

nye biodrivstoffkilder [1]. I Afrika sør for Sahara har mais (Zea mays L.) vist seg å bidra til matsikkerhet og fattigdomsreduksjon blant lavinntektsfamilier [2].

Genotyper av gul-oransje mais er kjent for sine utmerkede ernæringsmessige og helsefremmende egenskaper på grunn av de bioaktive forbindelsene de inneholder, inkludert karotenoider, polyfenoliske forbindelser, fytinsyre [3-5] og tokoferoler [6]. Imidlertid er utsiktene til matsikkerhet og forbedret ernæring gjennom økt maisproduksjon i Afrika sør for Sahara truet av roten hemiparasittiske planten, Striga hermonthica(Del.)Benth forårsaker avlingstap så høyt som 100 prosent under alvorlig angrep på grunn av tap av vann og næringsstoffer gjennom parasittisme [7,8]. Følgelig utgjør S. hermonthica en abiotisk begrensning for maisproduksjonen i Afrika sør for Sahara, som stammer fra et paradigmeskifte fra det tradisjonelle systemet med oppdrett av korn som involverte lengre brakkperioder. Et slikt tradisjonelt system for oppdrett av korn sørget for at nivået av Striga frøbank i jorda var tålelig for plantene9]. For å redusere tapene i utbytte og kvalitet på mais forårsaket av S.hermonthica-angrep, er den beste kontrollmetoden å plante Striga-resistente maisgenotyper. Denne strategien er lett å tilpasse, spesielt i kombinasjon med annen ledelsespraksis [10].

Vår nylige studie viste at Striga-resistente gul-oransje maishybrider inneholder karotenoider, polyfenoler og fytinsyre [3]. Disse bioaktive forbindelsene er kjent for å fungere som antioksidanter og undertrykke postprandial hyperglykemi, blant andre helsemessige fordeler [4,5,11,12]. Blant de bioaktive forbindelsene i oransje maiskorn ble antioksidanten [13,14] og fordøyelsesenzymerhemmende aktiviteter [15] rapportert å avhenge av fenolforbindelsene, som hovedsakelig eksisterer i bundet form. I tillegg er fenolforbindelser kjent for å ha flere andre bioaktiviteter som hemming av xantinoksidase og angiotensin 1-omdannende enzymer, som er implisert i patogenesen av henholdsvis gikt og renninavhengig hypertensjon [11], og anti- inflammatoriske, anti-mikrobielle, anti-kreft, anti-Alzheimer og anti-allergiske egenskaper blant andre biologiske aktiviteter [16]. Derfor tiltrekker fenoliske forbindelser fra kostholdskilder mye oppmerksomhet fra både forskere og forbrukere på grunn av deres fordeler for menneskers helse [16].

Målet med denne studien var å evaluere nivåene av de bioaktive forbindelsene, og antioksidant- og stivelseshydrolyserende enzymhemmende egenskaper til seks pipeline Striga-resistente gul-oransje maishybrider in vitro. Studien testet også assosiasjonene mellom de bioaktive ingrediensene, ogantioksidantog stivelseshydrolyserende enzymhemmende aktiviteter til de seks pipeline Striga-resistente gul-oransje maishybridene.

2. Resultater og diskusjon

2.1.Bioaktive komponenter i seks rørledninger Striga-resistente gul-oransje maishybrider

De bioaktive komponentene bestemt i de seks rørledningene Striga-resistente gul-oransje maishybrider(AS1828-1(AS1), AS1828-4(AS4), AS1828-6(AS6), AS{{ 8}} (AS8), AS1828-9(AS9), AS1828-11(AS11))i denne studien inkluderte totale fenoler,flavonoider, tanniner, karotenoider og fytinsyre. Nivåene av totale fenoler, totale flavonoider, tanniner og fytinsyre er presentert i tabell 1. De totale fenolene varierte fra 11,25 til 14,14 mg GAE/g i henholdsvis AS4 og AS9; totale flavonoider varierte fra 3,62 til 4,67 mg QE/g i henholdsvis AS11 og AS6; tannininnholdet varierte fra 3,64 til 6,29 mg/g i henholdsvis AS1 og AS9; og fytinsyreinnholdet varierte fra 3,66 prosent i AS6 til 4,47 prosent i AS1.

Dermed inneholdt AS9 den høyeste (s<0.05)total phenolics="" and="" tannin="" levels,="" while="" as6="" had="" the="" highest="" total="" flavonoids="" content.="" the="" total="" phenolic="" concentrations="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" are="" higher="" than="" the="" values="" previously="" reported="" in="" yellow="" maize="" hybrids,="" including="" 2.15="" mg="" gae/g[15]and="" 2.08="" mg="" gae/g[17].="" similarly,="" the="" levels="" of="" total="" flavonoids="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" in="" this="" study="" are="" higher="" than="" the="" 0.93±="" 0.03="" mg="" oqe/g="" recently="" reported="" in="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour="" [17].="" although="" the="" tannin="" levels="" are="" within="" the="" range(2.1-7.3="" mg/g)previously="" reported="" in="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" [3],="" the="" values="">

relativt høyere enn utvalget av kondenserte tanniner (33,70 til 158,55 mg/100g, tilsvarende 0,34 til 1,59 mg/g) rapportert i pigmenterte maisgenotyper [13].

De høyere nivåene av totale fenoler, totale flavonoider og tanniner observert i de seks rørledningene Striga-resistente gul-oransje mais-hybrider, i forhold til verdier i den eksisterende litteraturen for disse polyfenolene i ikke-Striga-resistente gule mais-genotyper, kan være knyttet til mulige forskjeller i deres genetiske sammensetning [3]. Det er velkjent at biosyntesen av polyfenoler og andre plantesekundære metabolitter øker i nærvær av stressorer som et cellulært forsvar og/eller adaptiv mekanisme av planten for å motstå ugunstige forhold [16,18]. Dessuten stimuleres Striga-frøspiring av produksjonen av strigolaktoner (plantehormoner) i røttene til maisplanten, som planten frigjør under stress [19]. Dermed er det mulig at egenskapen for resistens mot S. hermonthica kan ha oppregulert biosyntesen av polyfenoliske forbindelser i maisen for å motstå parasitten. Dette støttes av en tidligere rapport om at post-vedleggsresistens mot S. hermonthica innebar fortykning av plantecelleveggen og akkumulering av mange små vakuoler og fenolavleiringer som er tett farget inne i plantecellen [20].

Fenolforbindelser er bemerkelsesverdige for sin antioksidantaktivitet på grunn av deres redoksegenskaper, som gjør dem i stand til å fungere som slukkere av singlett oksygen, donorer av hydrogen og reduksjonsmidler [21]. I tillegg ble det også rapportert om fenolforbindelser å inaktivere fordøyelsesenzymer, inkludert bukspyttkjertellipase, -amylase og a-glukosidase via uspesifikk binding til de individuelle enzymene [22]. Som tidligere rapportert av Villiger et al. [23] har fenoliske forbindelser en høy affinitet for proteiner via hydrogen og hydrofob binding, noe som øker deres evne til å hemme enzymer som -amylase og -glukosidase ved denaturering av protein.

The phytic acid contents were comparable (p>0.05)blant de seks rørledningene Striga-resistente gul-oransje maishybrider. Dette området stemmer overens med vår tidligere rapport om fytinsyreinnholdet i Striga-resistente gul-oransje maishybrider [3]. Fytinsyre har antioksidantaktivitet, i tillegg til sin hemmende effekt mot utvikling av nyrestein [24], samt anti-kreftegenskaper [25]. Antioksidantegenskapene til de bioaktive komponentene, spesielt de fenoliske bestanddelene (flavonoider og tanniner) i Striga-resistente gul-oransje maishybrider, kan også forhindre og/eller bremse den oksidative nedbrytningen av enkelte endogene næringsstoffer i maisen som er svært utsatt for oksidasjon, som umettede fettsyrer og vitaminer [16]. Videre kan de bioaktive komponentene i Striga-resistente gul-oransje mais-hybrider redusere hastigheten som noen toksiske oksidative produkter dannes med, og dermed opprettholde den ernæringsmessige kvaliteten og forlenge holdbarheten til matprodukter [26] laget av dem.

The carotenoid content in the Striga-resistant yellow-orange maize hybrids is presented in Table 2. Total β-carotene (9-cis-β-carotene + 13-cis-β-carotene + all-trans-β-carotene) ranged from 2.42 to 2.89ug/g; total xanthophylls (lutein+zeaxanthin) ranged from8.92 to 12.11l ug/g; and total provitamin A carotenoids(β-cryptoxanthin+β-carotene+α-carotene） ranged from 3.17 to 3.77 μg/g,in AS6 and AS9,respectively. There were no significant differences(p>0.05) i karotenoidinnholdet i den Striga-resistente gul-oransje

mais hybrider. Områdene av karotenoider oppnådd i denne studien bekrefter de som tidligere er rapportert av Alamu et al. for provitamin A biofortifiserte gul maishybrider [27]. Videre var de totale xantofyllene høyere i verdi enn de totale provitamin A-karotenoidene i Striga-resistente gul-oransje maishybrider, noe som bekrefter funnene til Ortiz et al. [28].

Karotenoidene kan ha komplementert antioksidant- og stivelseshydrolyserende enzym-hemmende aktivitetene til fenolforbindelsene i Striga-resistente gul-oransje mais-hybrider, i samsvar med deres rapporterte bioaktiviteter. For eksempel har karotenoider blitt rapportert å ha antioksidantaktivitet som hovedmekanismen som ligger til grunn for deres helsemessige fordeler [29]. De gir også beskyttende effekter mot ikke-smittsomme kroniske sykdommer som kreft[30] og kardiovaskulære sykdommer [31]. Dessuten ble -cryptoxanthin rapportert å redusere risikoen for type 2 diabetes (T2D) og redusere insulinresistens [32,33].

2.2. Antioksidantaktivitet av seks rørledninger Striga-resistente gul-oransje maishybrider

Antioksidantaktiviteten til de Striga-resistente gul-oransje maishybridene (tabell 3) avslørte at de seks rørledningsklonene alle viste antioksidantaktivitet ved å rense frie radikaler (ABTS grad pluss og DPPH*) og redusere jernioner (Fe3 pluss) til jernholdige ioner (Fe2 pluss ). Antioksidantaktiviteten varierte betydelig (s<0.05) among="" the="" hybrids,="" with="" as9="" having="" the="" strongest=""><0.05) free="" radicals="" scavenging="" abilities(7.28="" teac="" mmol/g="" and="" sc50,="" 9.07±="" 0.27="" mg/ml="" for="" abts+="" and="" dpph,="" respectively)and="" ferric-reducing="" power="" (0.43="" mg="" gae/g).="" it="" is="" pertinent="" to="" recall="" that="" as9-9="" also="" had="" the="" highest="" level="" of="" total="" phenolics="" and="" tannins,="" as="" presented="" earlier="" in="" table="" 1.="" the="" dpph°scavenging="" abilities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" obtained="" in="" this="" study="" (sc50:="" 9.07="" to="" 26.35="" mg/ml)="" are="" more="" potent="" than="" those="" reported="" by="" rodriguez-salinas="" et="" al.="" [13]="" for="" pigmented="" maize="" genotypes(ic50:="" 31="" to="" 52="" mg/ml)="" since="" a="" lower="" sc50="" or="" ic50="" is="" indicative="" of="" a="" stronger="" activity="" [34].="" however,="" vitamin="" c,="" a="" standard="" antioxidant="" with="" a="" lower="" sc50(4.63±0.28="" mg/ml),="" had="" a="" stronger="" dpph*scavenging="" activity="" than="" all="" of="" the="" six="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids.="" similarly,="" the="" abts·+="" scavenging="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" (2.65-7.68="" teac="" mmol/g)is="" higher="" than="" the="" value="" (294.81±="" 2.23="" umol="" teac/g)reported="" by="" irondi="" et="" al.[17]="" for="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour.="" the="" stronger="" antioxidant="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" over="" the="" non-striga-resistant="" pigmented="" maize="" genotypes="" may="" be="" attributed="" to="" the="" increased="" deposition="" of="" polyphenolic="" compounds="" in="" their="" defense="" against="" s.="" hermonthica="" [20],="" which="" may="" have,="" consequently,="" enhanced="" the="" antioxidant="" capacity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

Den frie radikaler-fjernende evnen og jern-reduserende kraften til Striga-resistente gul-oransje maishybrider antyder at de kan være gunstige for å beskytte kroppen mot oksidative angrep utfelt av frie radikaler og reaktive oksygenarter. Dermed kan Striga-resistente gul-oransje maishybrider ha en beskyttende effekt mot oksidativ skade av biomolekyler i kroppen, inkludert nukleinsyrer, proteiner, lipider og karbohydrater [35] og de kroniske sykdommene relatert til oksidativt stress [36] .

2.3. Stivelseshydrolyserende enzymhemmende aktiviteter av de seks rørledningen Striga-resistente biofortifiserte gul-oransje maishybrider

Den stivelseshydrolyserende enzymene (-amylase og -glukosidase)-hemmende aktiviteten til de seks rørledningene Striga-resistente gul-oransje maishybrider, uttrykt som IC50 (ekstraktkonsentrasjon som hemmet enzymaktivitet med 50 prosent), er presentert i tabell 4. IC50 verdiene for Striga-resistente gul-oransje maishybrider på -amylase og -glukosidase varierte fra 26,28 til 52,55 mg/mL og 47,72 til 63,98 mg/mL i henholdsvis AS9 og AS4. Blant de seks pipeline Striga-resistente gul-oransje maishybridene, viste AS9 med de laveste IC50-verdiene for både -amylase og -glukosidase, den sterkeste (p<0.05)inhibitory activity="" on="" these="" two="" enzymes.="" interestingly,="" there="" was="" no="" significant="" (p="">0.05) forskjell i IC50-verdiene til AS9 og akarbose (et standard antidiabetisk legemiddel) på -amylase, noe som indikerer at de -amylasehemmende evnene til AS9 og akarbose var sammenlignbare. Bortsett fra den -amylasehemmende evnen til AS9 som var sammenlignbar med den til akarbose, var de -amylase- og -glukosidasehemmende aktivitetene til akarbosen sterkere enn de til Striga-resistente gul-oransje maishybrider. Evnen til forskjellige pigmenterte (gul, lilla, rød og svart) maisgenotyper til å hemme stivelseshydrolyserende enzymaktivitet (-glukosidase) ble rapportert av Fabila-Garcia et al. [15]. Funnene deres viste at gult maisekstrakt hadde den høyeste glukosidasehemmende aktiviteten, uttrykt i prosent (69,8 prosent), blant maisgenotypene. I tillegg har Irondi et al. [17] nylig rapporterte o-amylase og -glukosidase IC50-verdier på henholdsvis 237,12± 2,60 og 157,18±1,05 ug/mL for provitamin A gult maismel. I forhold til maissilkeekstrakt, som ble rapportert [37] å hemme a-amylase og -glukosidase med gjennomsnittlige IC50-verdier på henholdsvis 218,4 og 221,4 ug/mL, hadde de seks pipeline Striga-resistente gul-oransje maishybridene en svakere hemmende effekt på c-amylase og x-glukosidase.

Både c-amylase og o-glukosidase er involvert i fordøyelsen av diettkarbohydrater. Mens -amylase i tynntarmen hydrolyserer stivelse -1,4 binder seg for å frigjøre oligosakkarider og disakkarider, fullfører -glukosidase i børstekanten av tynntarmen fordøyelsen ved å hydrolysere oligosakkaridene og disakkaridene ytterligere for å gi absorberbare monosakkarider, inkludert glucose og fruktose [38]. Derfor er hemming av disse to fordøyelsesenzymer en veletablert terapeutisk tilnærming for å lindre postprandial hyperglykemi i T2D-behandling og en nøkkelvirkningsmekanisme

av mange antidiabetiske midler [39], inkludert legemidler, naturlige produkter og funksjonell mat. Videre hadde Striga-resistente gul-oransje mais-hybrider en mer betydelig hemmende effekt på -amylase enn på -glukosidase. Dette mønsteret med hemming av stivelseshydrolyserende enzymer har gunstige terapeutiske implikasjoner og stemmer overens med mønsteret rapportert i tidligere studier [17,A0]. Dermed kan de seks pipeline Striga-resistente gul-oransje maishybridene, spesielt AS9, ha noen fordeler ved å kontrollere postprandial hyperglykemi.

2.4. Korrelasjoner mellom de bioaktive komponentene, antioksidant- og stivelseshydrolyserende enzymer-hemmende aktivitetene til de seks rørledningen Striga-resistente gul-oransje maishybrider

Blant de bioaktive komponentene korrelerte totale fenoler signifikant med ABTS· plus (s<><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase="" ic50=""><0.01,r=-0.836)and α-glucosidase="" ic50=""><0.05,r=-0.582) (table="" 5).="" as="" earlier="" stated,="" lower="" dpph"="" scs0="" and="" enzyme="" ics0="" values="" are="" indicative="" of="" stronger="" scavenging="" and="" inhibitory="" activities="" of="" a="" given="" sample="" on="" dpph*="" and="" enzymes,="" respectively="" [34].="" thus,="" when="" taken="" together,="" the="" negative="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" dpph·sc50,="" α-amylase="" ic50="" and="" α-glucosidase="" ic50,="" as="" well="" as="" the="" positive="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" abts="" scavenging="" ability="" and="" reducing="" power,="" suggest="" that="" phenolic="" compounds="" may="" have="" contributed="" majorly="" to="" the="" observed="" antioxidant="" and="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

3. Materialer og metoder

3.1. Kjemikalier og reagenser

Trolox, quercetin, L-askorbinsyre, gallussyre, ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre)), DPPH(2,2-difenyl -2-picrylhydrazyl), -glukosidase fra Bacillus stearothermophilus, p-nitrofenylglukopyranosid (PNPG), -amylase, løselig stivelse og akarbose ble kjøpt fra Sigma (St. Louis). Analytiske kvaliteter av alle andre kjemikalier og løsemidler ble brukt.

3.2. Prøvesamling

Tørre frøprøver av seks rørlednings-Striga-resistente gul-oransje maishybrider (kodet AS1828-1,4,6,8,9,11) alle dyrket ved Saminaka (8 grader 39'E, 10 grad 34' N; høyde på 760 m; årlig nedbør på 1149 mm; temperaturen på 18.1-37.3 grader ; jordtype, dystriske nitosoler) og Zaria (7 grader 45'Ø, 11 grader 8'N ; høyde på 622 m; årlig nedbør på 1076 mm; gjennomsnittstemperatur på 13.9-35.5 grader; jordtype, Ferric Luvisols) ble samlet inn fra Maize Improvement Program til International Institute of Tropical Agriculture (IITA), Ibadan, Nigeria. Hybridene ble plantet i mai i to sesonger, i et randomisert komplett blokkdesign i tre replikasjoner, i regntiden. Prøvene ble malt til mel (0,50 mm siktstørrelse) med Perten Laboratory Hammer Mill (3102, USA) og pakket hermetisk i ugjennomsiktige prøveposer for videre laboratorieanalyser.

3.3. Forberedelse1 av prøveekstrakt

For å fremstille et ekstrakt fra Striga-resistent gul-oransje mais-hybridmel, ble 1 g av melet bløtlagt i 10 ml metanol i et dekket 50 ml sentrifugerør over natten (12 timer) med periodisk risting. Deretter ble blandingen sentrifugert ved 3000 rpm i 10 minutter, og deretter ble supernatanten (metanolisk ekstrakt) samlet og lagret ved -4 grader C inntil analyse [41].

3.4. Bestemmelse av totalt fenolinnhold

Folin-Ciocalteu-metoden beskrevet av Singleton et al. [42] ble tatt i bruk for å bestemme det totale fenolinnholdet i de Striga-resistente gul-oransje maishybridenes melekstrakt. En del (300 ul) av ekstraktet ble dispensert i et reagensrør (i triplikater). Etterpå ble 1,5 mL Folin-Ciocalteu-reagens (Stam Folin-Ciocalteu-reagens fortynnet 10 ganger med destillert vann) og 1,2 mL Na2CO3-løsning (7,5 % w/v) tilsatt, og blandingen ble inkubert i mørket i 30 minutter kl. romtemperatur. Deretter ble absorbansen avlest ved 765 nm mot et emne. Det totale fenolinnholdet ble beregnet ved bruk av en gallussyrekalibreringskurve og uttrykt som gallussyreekvivalent (GAE) i en mg/g prøve.

3.5. Bestemmelse av totalt innhold av flavonoider

Protokollen beskrevet av Kale et al. [43] ble brukt for å bestemme det totale flavonoidinnholdet i den Striga-resistente gul-oransje maishybridens melekstrakt. Kort fortalt ble 0,5 ml av ekstraktet dispensert i reagensglass; dette ble fulgt av tilsetning av 1,5 ml metanol, 0,1 ml aluminiumklorid (10 prosent), 0,1 ml 1 M kaliumacetat og 2,8 ml destillert vann. Reaksjonsblandingen ble vortexet og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter, hvoretter absorbansen ble avlest ved 514 nm. Det totale flavonoidinnholdet i ekstraktene ble uttrykt som quercetinekvivalent (QE) i mg/g prøve.

3.6. Bestemmelse av Tan1nin-innhold

Tanninnholdet i de Striga-resistente gul-oransje mais-hybridenes melekstrakter ble kvantifisert ved den kolorimetriske metoden tidligere beskrevet av Joslyn [44], med en liten modifikasjon. En del av prøven (0,5 g) ble dispergert i 5 ml 1 prosent HCl i metanol og hensatt i 15 minutter. Etterpå ble blandingen sentrifugert ved 3{{10}}00 rpm i 10 min. En porsjon på 0,1 mL av supernatanten ble dispensert i reagensrøret som inneholdt 7,5 mL destillert vann, hvoretter 0,5 mL Folin-Dennis-reagens og 1 mL Na2CO3 (35 prosent)-løsning ble tilsatt, og volumet ble fylt opp til 10 ml med 0,9 ml destillert vann Etter blanding ble reaksjonsblandingen inkubert i 30 minutter ved romtemperatur, og absorbansen ble avlest ved 760 nm. Tannininnholdet, uttrykt som garvesyreekvivalent (TAE) i mg/g prøve, ble beregnet fra en garvesyrestandardkurve.

3.7. Kvantifisering av karotenoidinnhold i prøven

Karotenoidinnholdet i de Striga-resistente gul-oransje mais-hybridenes mel ble bestemt ved å bruke metoden beskrevet av Howe og Tanumihardjo [45]. Karotenoider ble ekstrahert fra melene ved å blande 0,6 g av prøven med 6 ml etanol (inneholdt 0,1 prosent butylert hydroksyltoluen). Blandingen ble plassert i vannbad ved 85 grader i 5 min. Deretter ble den forstyrrende oljen i blandingen forsåpet med kaliumhydroksid (80 prosent w/v) ved 85 grader i et vannbad i 5 minutter. Suspensjonen ble deretter blandet ved bruk av en virvelmaskin og returnert til vannbadet i ytterligere 5 minutter. Den ble umiddelbart overført til et isbad, og 3 ml kaldt avionisert vann ble tilsatt. Karotenoidinnholdet fra blandingen ble separert tre påfølgende ganger med 3 ml n-heksan ved sentrifugering ved 1000 rpm i 10 s. Det øvre laget av blandingen ble dispensert i et 50 ml konsentratorrør. Den kombinerte heksanfraksjonen ble vasket tre ganger med avionisert vann, virvlet og sentrifugert i 10 s ved 1000 rpm. N-heksanfraksjonen ble tørket ned ved bruk av en TurboVap (LIV) konsentrator under nitrogengass i 25 minutter. Det tørkede ekstraktet ble rekonstituert med metanol/diklormetan (1 mL, 50:50 v/v), og en 100 μL alikvot ble injisert i HPLC-systemet for å kvantifisere karotenoidene. HPLC-systemet (Water Corporation, Milford, MA, USA) besto av en beskyttelseskolonne, C30 YMC karotenoidkolonne (4,6×250 mm, 3 μM), binær HPLC-pumpe (Waters 626), auto-sampler (Waters 717) og en fotodiode array detektor (Waters 2996). Systemet opererte med Empower 1-programvare (Waters Corporation). Den mobile fasen besto av løsningsmiddel A, inneholdende metanol:vann (92:8 v/v) med 10 mmol/L ammoniumacetat, og løsningsmiddel B, inneholdende 100 prosent metyl-tertiær-butyleter. Gradienteluering ble utført med en strømningshastighet på 1 ml/min under følgende forhold: 29 min lineær gradient fra 83 prosent til 59 prosent A; 6 min lineær gradient fra 59 prosent til 30 prosent A; 1 min hold ved 30 prosent A;4 min av lineær gradient fra 30 prosent til 83 prosent A og en 4-min hold på 83 prosent . Kromatogrammer av karotenoidene ble generert ved 450 nm, og de spesifikke karotenoidene ble identifisert og kvantifisert ved bruk av ekstern standardmetode basert på kalibreringskurven fra rene standarder og sammenligning av absorpsjonsspekteret og sameluering med standard karotenoider.

3.8. Bestemmelse av fytinsyreinnhold

Metoden til Wheeler og Ferrel [46] ble brukt for å bestemme fytinsyreinnholdet i melene. Ekstraksjon ble utført ved mekanisk risting av en blanding av 1 g mel og 25 ml 3 prosent trikloreddiksyre (TCA) i 1 time og suspensjonen ble sentrifugert i 15 minutter ved 35 00 rpm. En 10 ml alikvot av supernatanten ble blandet med en 4 ml jern(III)kloridløsning, og blandingen ble oppvarmet i et kokende vannbad i 45 minutter. Den resulterende suspensjonen ble sentrifugert ved 3500 rpm i 15 minutter og supernatanten ble forsiktig dekantert. Deretter ble bunnfallet vasket to ganger ved å dispergere i 25 ml 3 prosent TCA, oppvarming i et kokende vannbad i 10 minutter og sentrifugert ved 3500 rpm i 10 minutter. Bunnfallsvolumet ble fylt opp til 30 ml med destillert vann, og blandingen ble oppvarmet i et kokende vannbad i 30 minutter. Den varme suspensjonen ble filtrert ved hjelp av Whatman-filterpapir (nr. 2), og bunnfallet ble vasket med 60 ml varmt destillert vann for å sikre fullstendig filtrering. Deretter ble bunnfallet holdt tilbake på filterpapiret oppløst med 40 ml varm 3,2 M HNO3 i en 100 ml målekolbe. En 0,5 mL alikvot ble overført til et sentrifugerør og fortynnet med 7 mL destillert vann, hvoretter 2 mL 1,5 M KSCN ble tilsatt, og volumet ble gjort til 10 mL med 0,5 mL destillert vann. Absorbansen ble avlest (innen 1 min) ved 480 nm. Fytinsyreinnholdet i melene ble beregnet ved å bruke et Fe/P-atomforhold på 4:6.

3.9. 2,2-Azinobis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) Radikalkation(ABTS· pluss)ScaOenging Assay/

Evnen til de Striga-resistente gul-oransje mais-hybridenes melekstrakter til å rense ABTS" ble undersøkt ved å ta i bruk prosedyren rapportert av Reet al. [47]. ABTS* pluss arbeidsreagens ble fremstilt ved grundig å blande like volum av vandige løsninger av ABTS pluss (7 millimol/L) og K2S2Os (2,45 millimol/L) og inkuberer blandingen

i et mørkt skap ved romtemperatur i 16 timer. Etterpå ble reagensens absorbans justert til 0.70±0.02 med etanol (95 prosent) ved 734 nm. Deretter ble 0,2 ml av ekstraktet og 2,0 ml av ABTS*-reagenset dispensert i reagensrøret, blandet godt og inkubert ved romtemperatur i 15 minutter i en mørk tilstand. Til slutt ble absorbansen avlest i et UV-Visible spektrofotometer (Milton Roy Company, USA) ved 734 nm. ABTSe ​​pluss renseevnen til melekstraktene ble senere beregnet fra en Trolox-standardkurve og ble uttrykt som Trolox-ekvivalent antioksidantkapasitet (TEAC).

3.10. 2,2-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Radical (DPPH") scavenging assay

Protokollen rapportert av Cervato et al. [48] ​​ble brukt for å bestemme melekstraktenes evne til å rense DPPH", ved bruk av vitamin C(askorbinsyre) som referanseantioksidant. Kort fortalt en reaksjonsblanding som inneholder 1,0 mL forskjellige konsentrasjoner (8, 16) , 24, 32 mg/mL) av ekstraktet (eller vitamin C) og 3,0 ml DPPH-gradsløsning (60 μM) ble inkubert ved romtemperatur i mørk tilstand i 30 minutter. Deretter ble absorbansen ble avlest ved 517 nm, og DPPH"fjerningsevnen(prosent) av ekstraktene ble beregnet og uttrykt som konsentrasjonen av ekstrakt som fanget 50% av DPPH"(SC50).

3.11. Reduserende kraftanalyse

Melekstraktenes evne til å redusere Fe3 pluss til Fe2 pluss ble testet ved å ta i bruk protokollen beskrevet av Oyaizu [49]. Kort fortalt ble en blanding av ekstraktet (2,5 mL), 200 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,6) (2,5 mL) og 1 prosent kaliumferricyanid (2,5 mL) inkubert ved 50 grader i 20 minutter hvoretter 2,5 ml 10% trikloreddiksyre ble tilsatt. Deretter ble blandingen sentrifugert ved 650 x g i 10 minutter. En porsjon på 2,5 ml av supernatanten ble dispensert i et reagensrør, og 2,5 ml destillert vann og 1 ml 0,1 prosent ferriklorid ble tilsatt og blandet grundig, og absorbansen ble avlest ved 700 nm. Til slutt ble den reduserende kraften til ekstraktene beregnet og uttrykt i milligram gallussyreekvivalent per gram prøve.

3.12. Alfa-amylase hemmingsanalyse

Alfa-amylase-inhiberingsanalyse ble utført ved å ta i bruk prosedyren beskrevet av Kwon et al. [50]. Porcin pancreas-amylase (EC3.2.1.1) og løselig stivelse (substrat) ble brukt i denne analysen. Ulike fortynninger av melekstraktene, totalt 500μL og 500μL av 0.02 M natriumfosfatbuffer (pH6.9) med 0,006 M NaCl) inneholdende 0,5 mg/ml -amylaseløsning ble blandet og inkubert ved 37 grader i 10 minutter. Deretter ble 500 μL 1 prosent stivelsesløsning i 0,02 M natriumfosfatbuffer tilsatt, og reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 grader i 15 minutter. Deretter ble den -amylase-katalyserte hydrolysen av stivelse avsluttet ved å tilsette 1,0 ml DNSA-fargereagens (1 prosent 35-dinitrosalisylsyre og 12 prosent natriumkaliumtartrat i 0,4 M NaOH). Reaksjonsblandingen ble senere inkubert i 5 minutter i et kokende vannbad, avkjølt til romtemperatur og fortynnet med 10 ml destillert vann. Absorbansen til blandingen ble avlest ved 540 nm. En referansetest som utelukket melekstraktet ble inkludert i forsøket. Deretter ble den prosentvise -amylasehemmingen beregnet som følger:

(A540R - A540S)× 100 prosent hemming =A540R

hvor A540R er absorbansavlesningen til referansen; A540S er absorbansavlesningen av prøven.

3.13. Alfa-glukosidase-hemmingsanalyse

Alpha-glucosidase inhibitory activity of the flours extracts was conducted by adopting the procedure reported by Kim et al. [39], using Bacillus stearothermophillus α-glucosidase (EC3.2.1.20) and para-nitrophenylglucopyranoside (PNPG) as the substrate. Five (5)units of an aliquot of α-glucosidase were incubated with 20 μg/mL of the extract for 15 min. The hydrolytic reaction was initiated by adding 3 mM PNPG prepared in 20 mM phosphate buffer, pH6.9, which served as a substrate. The hydrolytic reaction was allowed to proceed for 20 min at37°C, after which 2 mL of 0.1 M Na>CO: ble tilsatt for å avslutte reaksjonen. En referansetest uten melekstrakt ble inkludert i forsøket. Absorbansen til den gule p-nitrofenolen frigjort fra den -glukosidase-katalyserte hydrolysen av PNPG ble avlest ved 400 nm og prosentandelen o-glukosidase-hemming ble beregnet slik:

(A400R - A400S)× 100 prosent hemming =A400R

hvor A400R er absorbansavlesningen til referansen; A400Ser absorbansavlesningen av prøven.

3.14. Dataanalyse

Dataene oppnådd i denne studien (fra triplikatbestemmelser) ble uttrykt som gjennomsnittsverdier ± standardavvik (SD). Ved å bruke SPSS statistisk programvarepakke (16. versjon) ble det utført en enveis variansanalyse (ANOVA) på dataene, og gjennomsnittsverdiene ble sammenlignet ved bruk av Tukeys post hoc test på p.<0.05. the="" associations="" between="" the="" bioactive="" components,="" the="" antioxidant,="" and="" the="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" were="" calculated="" using="" the="" pearson="" correlation="" test.="" column="" representations="" of="" the="" mean="" values="" were="" done="" using="" graphpad="" prism="" (5th="">

4. Konklusjoner

De seks pipeline Striga-resistente gul-oransje mais-hybridene inneholdt viktige bioaktive bestanddeler (totale fenoler, totale flavonoider, tanniner, fytinsyre og karotenoider). Ekstraktene deres viste sterk antioksidantaktivitet og hemmet stivelseshydrolyserende enzymer (-amylase og -glukosidase). Blant de Striga-resistente gul-oransje mais-hybridene hadde AS1828-9 den mest potente antioksidant- og stivelseshydrolyserende enzymhemmende aktiviteten. Signifikante korrelasjoner ble observert mellom totalt fenolinnhold og ABTS* pluss, DPPH-grads renseevne, reduserende kraft, -amylase- og -glukosidasehemmende aktivitet til Striga-resistente gul-oransje maishybrider. Antioksidant- og stivelseshydrolyserende enzymers hemmende aktiviteter tyder på at Striga-resistente gul-oransje maishybrider (spesielt AS1828-9) kan være fordelaktige for å forebygge og/eller lindre oksidativt stress og postprandial hyperglykemi.