Basert på nettverksfarmakologi og dyreeksperimenter for å utforske effekten av fenyletanoidglykosid av Cistanche Tubulosa på effekten av diabetisk nefropati

Sammendrag: Mål Å utforske effekten avCistanchefenyletanolglykosider(CPhGs) pådiabetisk nyresykdom(DKD) basert på nettverksfarmakologi og dyreforsøk. Metoder UHPLC-QE-MS-metoden ble brukt til å analyserekjemiske komponenter i CPhGs. TCMSP og Swiss Target Prediction-databaser ble brukt til å screene kjernekomponenter. OMIM og GeneCards databaser ble brukt for å skaffe DKD-relaterte mål. Etter å ha oppnådd vanlige mål, ble STRING-nettstedet brukt til å konstruere et proteininteraksjonsnettverk. DAVID-databasen ble brukt til GO, KEGG pathway-analyse og Cytoscape-programvare ble brukt til å konstruere "CPhGs core component-target-pathway" nettverk. Ti rotter ble tilfeldig valgt som normalgruppe, og de resterende rottene ble matet med fôr med høyt sukker og høyt fettinnhold og gitt en enkelt intraperitoneal injeksjon av STZ for å etablere en DKD-modell. De ble delt inn i modellgruppe, dapagliflozin (1 mg/kg) gruppe og CPhG høy og middels og lav dose (500, 25{{40}}, 125 mg/kg) grupper, 10 dyr i hver gruppe, medikamentintervensjon i 6 uker, generelle forhold ble observert, kroppsvekt ble bestemt og blodsukker ble testet hver uke; 24 timers urin ble samlet etter siste dose. Oppdag 24-time totalt urinprotein (24-UTP); samle blod fra abdominalaorta og ofre det, separere serum og oppdage ureanitrogen (BUN), urinsyre (UA), totalkolesterol (TC), triglyserid (TG) og høyt blodtrykk. Nivåer av høydensitetslipoprotein (HDL) og lavdensitetslipoprotein (LDL), HE-farging og Masson-farging ble brukt til å observere patologiske endringer i nyrevev, ELISA ble brukt til å påvise serum IL-1, IL{{17} }, og TNF-nivåer, og Western blot ble brukt for å oppdage nyrevev. JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3 proteinekspresjon. Resultater Totalt 699 komponenter ble oppdaget med UHPLC-QE-MS-teknologi. Etter screening ble 16 kjernekomponenter av CPhGs og 323 relaterte mål oppnådd. CPhGs og DKD delte 99 mål. Nøkkelmålene var STAT3, SRC, EGFR osv. KEGG-baneanalyse screenet 151 signalveier, og viste at IL-17-signalveien, PI3K/Akt-signalveien, TNF-signalveien osv. kan spille en nøkkelrolle i behandling av DKD av CPhGs. CPhG-er kan øke kroppsvekten til DKD-rotter (P＜0.01), redusere vannforbruket (P＜0.01), regulere glukose- og lipidmetabolismen, redusere 24-UTP- og BUN-nivåer (P＜0.01) og forbedre nyrevev . Patologisk skade reduserte proteinekspresjonen av p-JAK2/JAK2 og p-STAT3/STAT3 i nyrevev (P＜0.01) og økte proteinekspresjonen av SOCS3 (P＜0.01). Konklusjon CPhG-er griper inn i DKD gjennom flere komponenter, flere mål og flere veier, muligens ved å hemme JAK2/

STAT3 signalvei.

Nøkkelord: Cistanche fenyletanolglykosid; diabetisk nefropati; UHPLC-QE-MS; nettverk farmakologi; dyreforsøk; JAK2 /STAT3 signalvei

HVOR LANG TAR DET FOR CISTANCHE Å JOBBE FOR NYREPASIENTER?

Diabetisk nyresykdom (DKD), som en av de viktigste mikrovaskulære komplikasjonene ved diabetes, er ikke bare den primære faktoren som fører tilKronisk nyre sykdommen også hovedårsaken til sluttstadium nyresykdom (ESRD) over hele verden. Årsak [1-2]. Klinisk behandling av DKD innebærer først og fremst å kontrollere blodsukker, blodtrykk og blodlipider, og for det andre å beskytte nyrefunksjonen, unngå bruk av nefrotoksiske legemidler og forbedre livsstilen [3-4]. På grunn av den komplekse patogenesen til DKD og mangelen på spesifikke intervensjonsmål, har dagens behandlingsalternativer imidlertid begrensninger og er ikke effektive. Forekomsten av sluttstadium DKD er fortsatt økende. Derfor er det av stor betydning å finne effektive naturlige legemidler.

Cistanche Deserticola Y. C. Ma ellerCistanche C.De tørkede kjøttfulle stilkene avCistanche tubulosa (Schenk) Wightmed skjellete blader [5] ble først registrert i "Shen Nong's Materia Medica" og ble oppført som toppklasse. De er kjent som "ørkenginseng" [6]. De er søte, salte og varme. , går tilbake til nyre- og tykktarmens meridianer, og har effekten av å nære nyre-yang, fylle på essens og blod, fukte tarmene og avføringsmiddel. Forskning viser at fenyletanoidglykosider (CPhGs) er en av de viktigste aktive ingrediensene og er ansvarlige for utviklingen.

Det materielle grunnlaget for å utøve farmakologiske effekter; Cistanche-ekstrakt har anti-diabetisk [7-8], anti-leverkreft [9], nyrebeskyttelse [10-11], nevrobeskyttende [12-13] og andre farmakologiske effekter, men i dag er CPhGs er ikke effektive i behandling av DKD. Dens effekter og mekanismer er uklare.

Denne studien brukte nettverksfarmakologi og molekylære dokkingmetoder [14], og tok CPhGs som forskningsobjekt, predikerte og analyserte de viktigste aktive ingrediensene og potensielle mål for behandling av DKD, og ​​etablerte deretter en kombinasjon av streptozocin (STZ)-indusert høy. DKD-rottemodell matet med lipidfôr ble brukt som gjenstand for in vivo-forskning, for å gi referanse for klinisk utvidelse og anvendelse av relaterte behandlinger og videre forskning på virkningsmekanismen.

1 materiale

1.1 Dyr

70-ukegamle SD-hannrotter med SPF-nivå, kroppsvekt (240±20) g, ble kjøpt fra Animal Experiment Center ved Xinjiang Medical University [Experimental Animal Use License No. SYXK (ny) {{4} }], kl Dyrene ble adaptivt oppdrettet i 1 uke ved en temperatur på (22 ± 2) grader, en relativ fuktighet på 50 % til 70 %, og en 12 timer/12 timer vekslende lys og mørke syklus. Eksperimentet ble godkjent av Animal Ethics Committee ved Medical Experimental Animal Center ved Xinjiang Medical University (etikknummer IACUC-20220127-19).

1.2 Reagenser og medikamenter

CPhGs (batch number 201610, purity >80 %) ble levert av Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozin (batchnummer NB2248) ble kjøpt fra AstraZeneca, Storbritannia. Fôr med høyt sukker og høyt fettinnhold (kat.nr. Boaigang-B1135DM) og STZ (batchnr. 2021110307) ble kjøpt fra Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; urin mikroalbumin (batch nr. 20220611), urea nitrogen (batch nr. 20220626), urinsyre (batch nr. 20220613), totalt kolesterol (batch nummer 20220615), triglyserider (batch nummer 20220626), protein (2022-201 høydensitetsnummer 202201) ), og lipoprotein med lav tetthet (batchnummer 20220615) ble kjøpt fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; interleukin-6 (IL-6, partinummer JL20896), interleukin-1 (IL-1, partinummer JL20884) og tumornekrosefaktor- (TNF-, partinummer 13202 ) ble kjøpt fra Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; JAK2 kanin polyklonalt antistoff (partinummer 22v9316), p-JAK2 kanin polyklonalt antistoff (partinummer 78g9360), STAT3 kanin polyklonalt antistoff (partinummer 15x8824), p-STAT3 kanin polyklonalt antistoff (partinummer 7abit, SOm137alrn), nummer 31d4841) ble alle kjøpt fra Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; HRP-merket geit-anti-kanin IgG polyklonalt antistoff (batchnummer 20000758) ble kjøpt fra Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; -aktin kanin monoklonalt antistoff (batchnummer AC230205001), RIPA lysisbuffer (batchnummer 20220416), BCA Proteinkonsentrasjonsbestemmelsessett (batchnummer 20230401) ble kjøpt fra Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 Instrumenter

Vanquish ultrahøy ytelse væskekromatografi, Q Exactive Focus høyoppløselig massespektrometer, Heraeus Fresco17 sentrifuge, FC automatisk mikroplateleser (Thermo Fisher Scientific, USA); JXFSTPRP-24-kvern (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Mingche D24 UV rent vannmåler (Tyskland Merck Millipore Company); ACQUITY UPLC BEH C18 kolonne (1,7 μm, 2,1 mm×100 mm) (American Waters Company); Accu Chek Performa blodsukkermåler (Swiss Roche Company); CM1850UV kryostat, DM300 oppreist fluorescensmikroskop (Leica Company, Tyskland); GL-88B virvelmåler (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); elektronisk analytisk balanse (Bio-Rad Company, USA).

2 metoder

2. 1 UHPLC-QE-MS analyse

2.1.1 Klargjøring av prøveløsning

Vei 100 mg CPhGs, tilsett 500 μL 80 % metanol, vortex i 30 s, ultralydbehandle i et isvannbad i 1 time, la stå ved -40 grad i 1 time, sentrifuger ved 4 grader , 12 000 r/min i 15 minutter, aspirer supernatanten, 0. Filtrer gjennom en 22μm mikroporøs membran og oppbevar i et -80 graders kjøleskap.

2.1.2 Kromatografiske forhold

ACQUITY UPLC BEH C18 kolonne (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm); mobil fase acetonitril (A) -1% maursyre (B), gradienteluering (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 til 12 min, 75% til 98% A; 12 til 14 min, 98% A; 14 til 14,1 min, 98% til 15% A; Volumstrøm 0 . 5 ml/min; kolonnetemperatur 35 grader; injeksjonsvolum 5 μL.

2.1.3 Massespektrometriforhold

fullskanning ddMS2 fullskanningsmodus; kappe gass volumstrømhastighet 45 arb; volumstrømhastighet for hjelpegass 15 arb; kapillærtemperatur 400 grader ; kollisjonsenergi i NCE-modus 15% ~ 30% ~ 45% syklus; sprayspenning ± 4,0 kV.

2.2 Nettverksfarmakologiforskning

2. 2. 1 CPhGs

Komponentmålscreening: Sorter de kjemiske komponentene analysert med UHPLC-QE-MS etter relativt innhold, og slett de hvis kjemiske strukturer ennå ikke er bestemt. Skriv inn InChIKey-serienummeret til de screenede ingrediensene i TCMSP-databasen for å få de farmakokinetiske parametrene til hver ingrediens. Basert på betingelsene for oral biotilgjengelighet (OB) > 30 % og medikamentlikhet (DL) > 0,18, vil kandidater som oppfyller kravene bli screenet. Skriv inn SMILES-nummeret til hver komponent i Swiss Target Prediction-databasen for å forutsi målet, og få CPhGs kjemiske komponentmål.

2. 2. 2 DKD

Sykdomsmålscreening Bruk "diabetisk nefropati" som søkeord for å søke etter sykdomsmål i OMIM-, GeneCards- og NCBI-databaser.

2. 2. 3 Komponent-mål-sykdom nettverkskonstruksjon

Kryssmålene til CPhGs-komponenter og sykdommer ble oppnådd gjennom R-programvarekartlegging, og Cytoscape 3.7.2-programvare ble brukt til å konstruere et komponentmålnettverkssystem, der analyseplugin-modulen oppdaget kjernemål.

2. 2. 4 Konstruksjon av protein-protein interaksjonsnettverk (PPI)

Importer skjæringsmålproteinene til komponenter og sykdommer inn i STRING-databasen, konstruer et protein-protein-interaksjonsnettverk (PPI), slett proteiner uten tilkoblede noder i nettverket, og sett konfidensnivået for den laveste proteininteraksjonsskåren til {{1} }.700. Konstruer et PPI-nettverk, last ned resultatene i TSV-formatet, importer dem til Cytoscape 3.7.2-programvaren, og bruk analyseplugin-modulen for å skjerme kjernemål ytterligere.

2. 2. 5 GO, KEGG-analyse

Bruk delen Funksjonell merknad i DAVID-databasen for å utføre anrikningsanalyse på skjæringsmålene for komponentsykdommer. Angi først analyseparametrene, skriv inn skjæringsmålet i Genliste-boksen, velg offisielt-gen-symbol som målidentifikator, velg Genliste som datatype (listetype), og velg "Homo Sapiens (Art)" som målkilde (Art). Race)", start analysen etter å ha bekreftet analyseparameterne, skaff GO- og KEGG-analyseresultatene, og bruk deretter ImageGPs nettbaserte tegneplattform til å tegne boblediagrammet for KEGG- og GO-analyseresultatene. Cytoscape 3.7.2-programvaren konstruerer komponenten -target-pathway nettverksbilde.

2. 2. 6 Molekylær dokking

Last først ned 3D-strukturdiagrammet for den aktive ingrediensen i SDF-format fra PubChem-databasen, last deretter ned 3D-strukturdiagrammet for kryssmålet i PDB-format fra US Global Protein Database (PDB), og last det til slutt opp til CB-Dock nettsted for molekylær dokking. Skjerm de dominerende dokkingkonformasjonene og visualiser dem med Pymol.

2.3 Dyreforsøk

2.3.1 Modellering, gruppering og legemiddeladministrasjon

10 rotter ble tilfeldig valgt som normalgruppe og fôret med vanlig fôr, og de resterende rottene ble fôret med fôr med høyt sukker og høyt fettinnhold. Etter 6 uker ble de gitt en engangs intraperitoneal injeksjon av 30 mg/kg STZ (0,1 mmol/L STZ oppløst i pH 4,5 natriumcitratbuffer), og 72 timer senere ble det tatt blod fra halevenen for å oppdage fastende blodsukker (FBG). Hvis FBG er større enn eller lik 16,7 mmol/L, ble diabetesmodellen vellykket etablert [15]; fortsette De ble fôret med fôr med høyt sukker og høyt fettinnhold i 2 uker. DKD-modellering ble fastslått å være vellykket basert på uringlukosepositivitet og 24-timers totalt urinprotein (24-UTP) større enn eller lik 20 mg. Blant dem døde 3 under modelleringsprosessen og 7 mislyktes. , totalt 50 var vellykkede. Rottene som ble vellykket modellert ble tilfeldig delt inn i modellgruppen, dapagliflozin-gruppen (1 mg/kg) og CPhGs høy-, middels og lavdose (500, 250, 125 mg/kg) grupper. Hver administreringsgruppe ble administrert intragastrisk. Rottene i normalgruppen og modellgruppen fikk tilsvarende legemidler, og rottene i normalgruppen og modellgruppen fikk samme mengde normalt saltvann ved sondemating, en gang daglig i totalt 6 uker. I løpet av administrasjonsperioden fortsatte rotter i hver gruppe unntatt normalgruppen å få fôr med høyt fettinnhold.

2.3.2 Biokjemisk indikatorpåvisning

Etter 6 uker med CPhG-intervensjon ble 24-timers urin samlet fra rottene, og 24-times totalt urinprotein (24-UTP) ble målt; blod ble samlet fra den fastende halevenen for å påvise FBG-nivåer; blod ble samlet fra abdominal aorta, 4 grader, 1500 r/min. Sentrifuger i 10 minutter for å separere serumet og oppdage serum urea nitrogen.

BUN), urinsyre (UA), totalkolesterol (TC), triglyserid (TG), lipoprotein med høy tetthet (HDL), lipoprotein med lav tetthet (lipoprotein med lav tetthet LDL).

2.3.3 Observasjon av patologisk morfologi av nyrevev

Rottene ble bedøvet med natriumpentobarbital og avlivet. Nyrene ble skrellet av, veid, fiksert med 4% paraformaldehyd, dehydrert, gjennomsiktig, dyppet i voks, innebygd og seksjonert for hematoxylin-eosin (HE)-farging.

Etter Masson-farging ble vevsmorfologien observert under et mikroskop, og Image-Pro Plus 6.0-programvare ble brukt til å analysere den integrerte optiske tettheten og kvantifisere det relative kollagenfiberområdet.

2. 3. 4 ELISA

Metoden ble brukt til å påvise nivåene av seruminflammatoriske faktorer hos rotter. Nivåene av IL-6, IL-1 og TNF- ble oppdaget i henhold til instruksjonene i settet.

2. 3. 5 Western blot-metode for å oppdage relatert proteinekspresjon

Rottenyrevev ble tatt, RIPA-lysat ble tilsatt for å ekstrahere det totale proteinet, og konsentrasjonen ble bestemt ved BCA-metoden.

Etter natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese, overføring til PVDF-membran, og etter blokkering, JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p -STAT3 (1:2000), SOCS3 (1:2000), -aktin (1:2000) antistoffer, inkuber ved 4 grader over natten, tilsett HRP-merket IgG sekundært antistoff (1:5000), og inkuber ved romtemperatur i 1 time, utviklet med elektroluminescenssett, eksponert med proteingel-imager, ved bruk av Image J-programvare

Kvantitativ analyse av stykker. Ved å bruke -actin som intern referanse, er forholdet mellom gråverdien til målbåndet og det interne referansebåndet det relative proteinuttrykket.

2.4 Statistisk analyse

Dataene ble behandlet av SPSS 25.0 programvare, og dataene ble uttrykt som (x±s). Enveis variansanalyse ble brukt for sammenligning mellom grupper. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.