Analyse av aromakomponenter og differensielle metabolitter i Cistanche Musalais basert på GC–MS og metabolomikk
Nov 28, 2025
Abstrakt:Denne studien forberedte Cistanche Musalais ved å bruke tradisjonelle teknikker med Xinjiang Hetian røde druer og varierende tilsetninger av Cistanche. Optimale prosessbetingelser ble bestemt ved enveis ANOVA. GC–MS og ikke-målrettet metabolomikk ble brukt til å analysere aromakomponenter og differensielle metabolitter, og aktive bestanddeler som totale flavonoider og totale polyfenoler ble kvantifisert. De optimale forholdene var: innledende sukkerinnhold på 32 grader Bx, gjæringstemperatur på 25 grader, og 7 % tilsetning av Cistanche deserticola. Under disse forholdene nådde alkoholinnholdet, total surhet, totalt antall flavonoider og totalt antall polyfenoler (12,6 ± 0,6) % vol, (3,82 ± 0,19) g/L, (0,80 ± 0,01) g/L og (0,60 ± 0,00) g/L, henholdsvis. GC–MS oppdaget 38 aromaforbindelser, med estere som den mest tallrike klassen (24 forbindelser), etterfulgt av 6 alkoholer, 2 ketoner og 2 aldehyder. Sammenlignet med Musalais laget utelukkende av druejuice, viste Cistanche deserticola Musalais betydelig høyere nivåer av nøkkelestere, inkludert etylacetat (6,42 % vs. 2.42%) og etylpalmitat (3,75 % vs. 1.18%), mens høyere alkoholer som isobutanol,{1}%, markant reduserte ({1}% vs.{1}%). Metabolomics identifiserte 230 differensielle metabolitter (VIP større enn eller lik 1, P < 0,05), anriket på veier relatert til ABC-transportører og aminosyrebiosyntese. Komponenter som trigonellin og crocin var signifikant forhøyet. Aminosyremetabolisme bidro til dannelsen av den karakteristiske smaksprofilen. Denne studien gir et teoretisk og teknisk grunnlag for utvikling og kvalitetsforbedring av Cistanche Musalais. Fremtidig forskning bør inkludere molekylære sensoriske teknikker, som GC–O, for bedre å identifisere de viktigste aktive forbindelsene som er ansvarlige for den generelle smaksprofilen.
Nøkkelord: Cistanche;Musalais; GC–MS; metabolomikk
CistancheMusalais
Oppføringsdetaljer for Cistanche Musalais
Musalais (Msalais)er en tradisjonell gjæret drikk unik for Xinjiang, produsert av røde Awati-druer eller Hetian (Hotan) røde druer. Den er laget av juicing, konsentrasjon og spontan gjæring, og er karakterisert som primitiv, naturlig og grønn. Som en unik kinesisk naturlig gjæret alkoholholdig drikk, viser Musalais distinkte regionale egenskaper i sensoriske egenskaper, ernæringsmessig verdi og funksjonelle aktiviteter. Alkoholer, estere, aldehyder, syrer, fenoler og terpener generert under gjæring gir ikke bare en unik smak, men er også assosiert med fordeler som å fremme blodsirkulasjonen, senke blodlipider, tonifisere nyrene og styrke kroppen, regulere kolesterolet og opprettholde det egnet for kardiovaskulær helse for forbrukere [1].
De siste årene, med økende etterspørsel etter sunne drikker, har markedet for funksjonell brennevin ekspandert raskt. På grunnlag av tradisjonell brygging, inneholder funksjonell brennevin spesifikke funksjonelle komponenter for å møte behov for velvære, helsevedlikehold eller spesifikk fysiologisk regulering. Kvaliteten deres påvirkes av råvarer, prosesser, mikrobielle samfunn og stabiliteten til funksjonelle komponenter [2]. I det sørlige Xinjiang folkepraksis tilsettes ofte lokale tilsetninger som gojibær, saflor, Cistanche og safran under Musalais-tilberedning for å forbedre helsefordelene og berike smaksmangfoldet [3]. Blant disse har Cistanche-rik på polysakkarider, aminosyrer, fenyletanoidglykosider, iridoidglykosider og alkaloider toniske effekter på nyre-yang, modulerer nevroendokrin funksjon og bekjemper tretthet, og får navnet "ørkenens ginseng" [4–5].
Imidlertid står industrialiseringen av Cistanche Musalais for tiden overfor utfordringer, inkludert mangel på produksjonsstandarder, ufullstendig prosesseringsteknologi og utilstrekkelig forskning på smaksstoffer, noe som begrenser markedspromosjonen og kvalitetsforbedringen. I denne studien ble Cistanche brukt som et tillegg for å optimalisere Musalais-gjæringsprosessen. GC–MS og umålrettet metabolomikk ble brukt for å systematisk løse aromabestanddeler og differensielle metabolitter, med sikte på å gi et teoretisk grunnlag og teknisk støtte for standardisert produksjon, smaksmodulering og funksjonell forbedring av Cistanche Musalais, og dermed fremme modernisering og verdiutvikling av denne tradisjonelle drikken.
1 Materialer og metoder
1.1 Materialer og reagenser
Cistanche tubulosa (rørformet Cistanche): førsteklasses kommersielle prøver hentet fra Hetian (Hotan), Xinjiang, med fyldig tekstur og fri for mugg og urenheter.
Hetian røde druer: kommersiell frukt med intakt utseende og sterk aroma, hentet fra Hetian, Xinjiang.
Metanol og acetonitril: Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
Maursyre: TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.
L-2-klorfenylalanin: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrumenter og utstyr
08-2T magnetisk rører med konstant temperatur, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.
57330-U SPME-enhet og 57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME-fiber, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.
6890N-5973 GC–MS-system, Agilent Technologies (China) Co., Ltd.
5430R kjølt sentrifuge, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.
TL-48R vevskvern med høy gjennomstrømning, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.
SCIENTZ-1LS vakuumkonsentrator, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.
Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
SDAJ-0.5 vinproduksjonslinje i kinesisk stil, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.
1.3 Eksperimentelle metoder
1.3.1 Prosessflyt
Cistanche ble dampet for senere bruk. Hetian røde druer ble vasket og valgt, avstilket og knust. Druejuice ble ekstrahert med en presse, deretter oppvarmet og konsentrert for å justere juicekonsentrasjonsindikatorene. Til slutt ble det dampede Cistanche-produktet blandet med konsentrert druejuice og fermentert under kontrollerte temperatur- og tidsparametere. Etter gjæring ble produktet klarnet for å oppnå Cistanche Musalais.
1.3.2 Klargjøring av Cistanche
Med mindre modifikasjoner av Gong et al. [6], høykvalitets, ikke-forringet tørket Cistanche ble skrellet, skåret i skiver, pakket inn i gasbind og dampet i 20 minutter for senere bruk.
1.3.3 Tilberedning av druejuice
Hetian røde druer med et innledende løselig faststoff (sukker) på 18 grader Bx ble brukt. Råtne, forringede og ujevnt modne druer ble fjernet. Etter vask og skrell ble druer presset. Saften ble kokt (konsentrert) ved høy temperatur og konsentrasjonen ble stoppet når sukkeret nådde 26, 29 eller 32 grader Bx. Saften ble avkjølt til romtemperatur for senere bruk.
1.3.4 Fermenteringsprosess for Cistanche Musalais
Dampet Cistanche ble tilsatt i definerte proporsjoner (3 %, 5 %, 7 %) til 600 ml konsentrert druejuice i en fermenteringsbeholder. Restsukker ble målt hver 24. time under gjæring for å overvåke fremdriften. Når restsukkeret falt til 4 g/l, ble gjæringen avsluttet. Supernatanten ble samlet og pasteurisert ved 85 grader i 30 minutter for å oppnå Cistanche Musalais.
1.3.5 Enkeltfaktor eksperimentell design for Cistanche Musalais
Effektene av Cistanche-tilsetning (3 %, 5 %, 7 %), innledende sukkerinnhold (26, 29, 32 grader Bx) og fermenteringstemperatur (22, 25, 28 grader) på fysisk-kjemiske egenskaper og bioaktivitet ble undersøkt.
1.3.6 Analyser og målinger
Alkoholinnhold, løselige faste stoffer og total surhet: bestemt i henhold til GB/T 15038-2006 "Generelle analytiske metoder for vin og fruktvin."
Totalt antall flavonoider: bestemt med henvisning til Xu et al. [7]. En kalibreringskurve ble utarbeidet med rutinkonsentrasjon (X) som abscisse og absorbans (Y) ved 510 nm som ordinat, noe som ga Y=0.8043X - 0,0278, R2=0.9999, noe som indikerer god linearitet.
Totalt antall polyfenoler: bestemt ved bruk av Folin-Ciocalteu-metoden [8]. En kalibreringskurve ble utarbeidet med gallussyreinnhold (X) som abscisse og absorbans (Y) ved 760 nm som ordinat, noe som ga Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975, noe som indikerer god linearitet.
1.3.7 GC–MS-analyse
Prøver fra to grupper - eksperimentelle (32 grader Bx, 25 grader, 7% Cistanche) og kontroll uten Cistanche - ble utsatt for GC–MS.
Prøveforbehandling: Prøven ble plassert i et 20 ml ekstraksjonsglass; 100 μL 50 ug/mL isoamylfenylacetat ble tilsatt som intern standard. Hetteglasset ble forseglet og ekvilibrert i et 60 graders vannbad med magnetisk omrøring ved 250 r/min i 20 min. SPME-fiberen ble deretter satt inn for 30 min ekstraksjon. Før bruk ble SPME-fiberen kondisjonert ved GC-innløpet ved 250 grader i 20 minutter.
GC–MS-forhold: HP-INNOWax-kolonne (60 m × 250 μm × 0,25 μm); innløp 250 grader; overføringslinje 250 grader; bærergassstrøm 1,5 ml/min; delt 4:1. Ovnsprogram: 40 grader (5 min), rampe 5 grader /min til 250 grader, hold 10 min. Ionekilde 230 grader; quadrupol 150 grader; EI 70 eV; full skanning 35–550 Da.
1.3.8 Umålrettet metabolomikk
1.3.8.1 Prøveforberedelse
To grupper ble testet: eksperimentell (32 grader Bx, 25 grader, 7 % Cistanche) og kontroll uten Cistanche; n=3 biologiske replikater per gruppe, totalt 6 prøver. Etter tining og vortexing ble 300 μL av hver prøve overført til et 1,5 mL rør og sentrifugert ved 12 000 r/min, 4 grader i 15 min. Deretter ble 100 μL supernatant flyttet til et 2 mL rør, hurtigfrosset i flytende nitrogen og lyofilisert. Tilsett 1 ml forhåndskjølt metanol:acetonitril (1:1, v/v), vortex 30 s; frys ved -20 grader i 30 minutter; sentrifuger ved 12 000 r/min, 4 grader i 10 min; samle 850 μL supernatant og vakuumtørk til fullstendighet; rekonstituer i 150 μL 50 % metanol (med 5 ppm 2-klorfenylalanin), vortex 30 s; sentrifuger 12 000 r/min, 4 grader i 10 min; filtrer gjennom 0,22 μm membran og overfør filtratet til hetteglass. Kombiner 10–20 μL fra hver prøve for å lage en QC-prøve for å evaluere instrumentstabilitet og datapålitelighet; QC er utelatt hvis færre enn 5 prøver er inkludert.
1.3.8.2 Analytiske forhold
Kromatografi: ACQUITY UPLC HSS T3 kolonne (100 Å, 1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm); strømning 0,4 ml/min; kolonne 40 grader; autosampler 8 grader ; injeksjon 2 μL. Mobil fase A: vann med 0,1 % (v/v) maursyre; mobil fase B: acetonitril med 0,1 % (v/v) maursyre.
Massespektrometri: sprayspenning +3.5 kV/−3,0 kV; kappegass 40 arb; hjelpegass 10 arb; kapillær 320 grader; hjelpegass temp 300 grader; MS1 oppløsning 60 000; skanneområde m/z 70–1000; AGC Target Standard; Maks IT 100 ms; dataavhengig MS/MS på topp 4 ioner med dynamisk ekskludering 4 s; MS2-oppløsning 15 000; HCD kollisjonsenergi 30 %.
1.3.8.3 Metabolittidentifikasjon
Metabolittidentifikasjon var basert på PSNGM (PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database), som omfattet et internt bibliotek med standarder, mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.lab.camon/), Mouc.nafiee.camon/, Mouc.nafiee/, Mouc.fiee. NIST_2020_MSMS, og et AI-forutsagt MS/MS-spektralbibliotek.
Merknad om eksterne databaser brukt i merknader:
HMDB: En omfattende human metabolomdatabase (versjon 5.0) som inneholder detaljert kjemisk, klinisk og biokjemisk informasjon for 220 945 metabolitter, med omfattende krysskoblinger til KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt og GenBank, og støtter avansert tekst/sekvens/spektralsøking og MS/NMR-struktur. Også assosiert med DrugBank, T3DB, SMPDB og FooDB.
LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50 000 kuraterte lipidstrukturer), spektre, veier, verktøy for MS-analyse, strukturtegning og nomenklatur-/klassifiseringsressurser.
mzCloud: Et avansert massespektralbibliotek som støtter spektrum, struktur, understruktur, tre og m/z-baserte søk, med 32 330 forbindelser, 51 002 spektraltrær og 16 531 567 spektre (med betydelige tillegg i 2024), optimert for Firefox/Chrome-skrivebordstilgang.
1.3.8.4 Multivariat statistisk analyse
Multivariate analyser ble brukt på metabolittdata fra de 6 prøvene for å utføre PCA, for å belyse metabolske forskjeller mellom Cistanche Musalais og Musalais. Differensielle metabolitter på tvers av grupper ble screenet ved bruk av OPLS-DA variabel betydning i projeksjon (VIP), fold endring og P-verdier (VIP-terskel og signifikans som ovenfor), etterfulgt av biologisk tolkning inkludert KEGG-baneberikelse [9].
Referanser
[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ, et al. Kvalitativ analyse av de viktigste aromaforbindelsene assosiert med tradisjonell Musalais-behandling i Xinjiang Kina. Journal of the Institute of Brewing. 2012;118(2):236–242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y, et al. Moderne forskningsfremgang på fermentert funksjonell brennevin. Brennevinsfremstilling. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Diskusjon om utviklingsstrategier for Xinjiang Msalais-druevin. Brennevinsfremstillingsvitenskap og teknologi. 2008(7):111–113.
[4] Song ZH, Lei L, Tu PF. Fremskritt innen forskning på farmakologisk aktivitet i planter av Cistanche Hoffing. et Link. Tradisjonelle kinesiske og urtemedisiner. 2003;34(9):U018.
[5] Shi TT, Ge WH. Forskningsutviklingen til Cistanche Hoffmg. Et Link. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY, et al. Studie på teknologien til en ny gjæret Cistanche-vin. Moderne mat. 2019(5):64–68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ, et al. Antioksidant og antibakteriell aktivitet av totale flavonoider fra Nervilia fordii. Northern Horticulture. 2017(16):161–165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX, et al. Blandet gjæring av sitrusskallrester med Trichoderma koningii, Aspergillus oryzae og Lactobacillus casei: prosessoptimalisering, antioksidantaktiviteter og ikke-målrettet metabolomikkanalyse. Matbiovitenskap. 2025;66:106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ, et al. Sammenligning av mye målrettet metabolomikk og umålrettet metabolomikk av vill Ophiocordyceps sinensis. Molecules. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Forskning på teknologien til Rosa kwangsiensis var. sterilis gjæret vin [Masteroppgave]. Chongqing: Southwest University; 2017.
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX, et al. Forskning på produktutvikling og responsoverflateoptimalisering av Msalais-pære. Behandling av landbruksprodukter. 2025;3:1–10.
[12] Zhang L, Jiang XF. Verifikasjon av tilpasningsevnen til bestemmelsesmetoden for kobber i GB/T15038-2006 generell analysemetode for vin og fruktvin. Brennevinsproduksjon. 2020;47(5):104–107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z, et al. Effekt av malolaktisk gjæringstemperatur på kvaliteten på Cabernet Sauvignon-vin. Zhejiang Agricultural Sciences. 2025;66(7):1724–1732.
